陜產(chǎn)寬葉重樓的生藥學(xué)研究△

程虎印，程江雪，王艷，張景霞，顏永剛，彭亮，楊新杰，高靜

1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 西安 712046；2.陜西省微生物研究所，陜西 西安 710043

寬葉重樓ParispolyphyllaSm.var.latifoliaWang et Chang為百合科重樓屬南重樓組藥用植物，主要分布于我國(guó)山西、陜西西部、甘肅、安徽等地[1]，在陜西華陰市、耀州區(qū)、黃龍、鎮(zhèn)巴縣和秦嶺南北坡多有分布，根莖入藥，多生于海拔1000～1840 m的陰濕闊葉林下、溝邊溪旁、林緣[2-8]。重樓屬南重樓組具有極高的藥用價(jià)值，其粗壯根莖所含重樓皂苷類成分具有止血、鎮(zhèn)痛、抗炎擬菌、收縮子宮和抗腫瘤等活性，臨床上常用于治療子宮出血、泌尿系感染、外科炎癥、癌癥、避孕等[6，9-13]，2015版《中華人民共和國(guó)藥典》收載中藥重樓基原植物為百合科重樓屬南重樓組的云南重樓ParispolyphyllaSmith var.yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz.或七葉一枝花P.polyphyllaSmith var.chinensis(Franch.)Hara的干燥根莖[14]。寬葉重樓根莖在陜西多地當(dāng)中藥重樓使用，常用于止血、抗炎鎮(zhèn)痛和癌癥、肺系疾病、慢性胃病等治療[6，8，13，15-16]。近年來(lái)重樓的市場(chǎng)需求快速增長(zhǎng)、價(jià)格連年攀升，致使民間對(duì)粗壯根莖類的重樓屬南重樓組野生資源進(jìn)行了掠奪式的采掘，加上該類群繁殖率低、自然生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、群落自然更替緩慢等因素，加劇了市場(chǎng)供給的資源壓力，導(dǎo)致重樓中藥資源遭到嚴(yán)重破壞而迅速減少，藥材緊缺狀況業(yè)已顯現(xiàn)[5，8，17-19]。

南重樓組在我國(guó)許多地區(qū)有多種植物種類相混入藥，其根莖在歷史上、民間部分地區(qū)一直作為重樓使用[17，20-22]，均含2015版《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定的重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ等質(zhì)量控制性有效組分[9，11，24-25]。目前對(duì)寬葉重樓的研究主要集中在化學(xué)成分[26]、ITS2鑒別[27]和非傳統(tǒng)入藥部位的化學(xué)成分[28-29]等方面，其生藥學(xué)研究未見報(bào)道。為了探討寬葉重樓質(zhì)量可靠性和自然資源替代性，擴(kuò)大重樓中藥資源范圍，保護(hù)云南重樓和七葉一枝花野生資源，本實(shí)驗(yàn)對(duì)寬葉重樓的生藥性狀和顯微特征進(jìn)行了觀察研究，用HPLC法對(duì)重樓皂苷I、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的總含量進(jìn)行了測(cè)定，報(bào)告如下。

1 器具用品

1.1 儀器

Nikon D7000數(shù)碼照相機(jī)(株式會(huì)社尼康)；HD-300型自動(dòng)脫水機(jī)、HD-310型石蠟包埋機(jī)、HD-310型包埋機(jī)專用冷凍臺(tái)、HD-330型攤片拷片機(jī)、HD-360型生物組織自動(dòng)染色機(jī)(湖北慧達(dá)儀器有限公司)；FA2104型電子分析天平(上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司)；LEICA RM2235切片機(jī)(德國(guó)徠卡公司)；ZEISS Imager.A2顯微鏡(德國(guó)蔡司公司)；UltiMate 3000 HPLC(Product of ThermoFisher)；GS-120-5-C18-BIO高效液相色譜柱(4.6 nmmID×250 nm，蘇州環(huán)球色譜有限責(zé)任公司)。

1.2 試劑試藥

重樓皂苷I、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ(批號(hào)依次為10575-201410、10576-201409、10577-201411、10578-201411)對(duì)照品，南昌貝塔生物科技有限公司，純度≥98%；95%乙醇(分析醇)；甲醇(色譜醇gradient grade≥99.9%)；水為哇哈哈純凈水；乙腈(色譜乙腈gradient grade≥99.9%)；其余試劑均為分析純。

1.3 材料

根據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)[30-33]和當(dāng)?shù)刂貥撬幉牟赏诹?xí)慣，本實(shí)驗(yàn)用寬葉重樓的根莖生藥樣品均采自主產(chǎn)區(qū)陰濕的自然落葉闊葉林下或人工闊葉林下重樓仿野生種植基地(見表1)，實(shí)地采集的樣品植株均在苗期6年以上，經(jīng)王繼濤高級(jí)實(shí)驗(yàn)師、顏永剛教授和課題組專家共同鑒定。

2 方法與結(jié)果

2.1 生物學(xué)特性

株高30～160 cm。根莖粗厚，橫走，呈結(jié)節(jié)狀不勻扁圓錐體，最初形成的根莖較細(xì)，此后逐步變粗，至頂部最粗(即：根莖的年生物量積累逐年增大)，略彎曲，表面棕紅色至棕褐色，有層狀突起橫斜粗環(huán)紋，頂芽自7、8月間的花期末、果期初萌出，至次年3月實(shí)生苗出土前持續(xù)增粗、加長(zhǎng)，芽長(zhǎng)可至5～8 cm。葉5～19，葉柄長(zhǎng)0.2～1.5 cm，有時(shí)帶紫色；葉片寬卵狀長(zhǎng)圓形、寬披針形至倒長(zhǎng)卵狀披針形，長(zhǎng)6～25 cm，寬2.6～6 cm，先端短尖，基部寬楔形，羽狀網(wǎng)脈?；?至9數(shù)，花柄長(zhǎng)于外輪花被片；內(nèi)輪花被片線形至狹條形，寬0.5～1.5(2)mm，遠(yuǎn)長(zhǎng)于外輪花被片；雄蕊6～18，花藥與花絲近等長(zhǎng)，藥隔極短，長(zhǎng)約0.1～0.2 mm；花柱3至9，細(xì)圓柱形，離生并外向反曲；花柱基盤狀，棱角數(shù)與花數(shù)一致，紫色至深紫褐色；子房外壁具疣狀突起，果時(shí)更加顯著。果實(shí)球形，深綠色，直徑2～5 cm，有多條鈍縱棱，縱裂。種子球形，橘紅色?；ㄆ?～7月，果期7～10月。見圖1。

注：1.果實(shí);2.種子;3.原植物;4.臘葉標(biāo)本。圖1 寬葉重樓的果實(shí)、種子特征及原植物、臘葉標(biāo)本圖

寬葉重樓的根莖長(zhǎng)度與周長(zhǎng)、株高、葉片數(shù)目及葉片長(zhǎng)寬、花基數(shù)、果實(shí)直徑及成熟種子數(shù)目常隨生長(zhǎng)年限的延長(zhǎng)有不同程度的增加，生長(zhǎng)習(xí)性具有生殖生長(zhǎng)期較長(zhǎng)、花期和初果期為根莖膨大期的生長(zhǎng)規(guī)律。人工栽植過(guò)程中，如選擇干旱、過(guò)度光照、粘質(zhì)土壤等逆性生長(zhǎng)環(huán)境，或移栽時(shí)機(jī)選擇不當(dāng)，則其年生長(zhǎng)周期提前且縮短、地上部分生長(zhǎng)不良、根莖自尾部漸次朽萎或生物量逐年減少，直至失亡。

寬葉重樓與重樓ParispolyphyllaSm.的最主要區(qū)別是：葉為寬卵狀長(zhǎng)圓形、寬披針形至倒長(zhǎng)卵狀披針形，寬2.6 cm以上；內(nèi)輪花被片遠(yuǎn)長(zhǎng)于外輪花被片；藥隔極短，長(zhǎng)約0.1～0.2 mm；子房或果皮外壁具疣狀突起，果時(shí)更加顯著。

2.2 生藥性狀

寬葉重樓生藥為去芽、去須根的干燥根莖。生藥呈結(jié)節(jié)狀不勻扁圓柱體或圓錐體，略彎曲，長(zhǎng)4.3～6.2 cm，直徑0.6～3.5 cm。表面呈棕紅色至棕褐色，有層狀突起橫斜環(huán)紋，結(jié)節(jié)明顯，一端有凹陷莖痕或芽體切面，周身密布凹陷的白色須根痕或有殘留須根，質(zhì)地堅(jiān)硬，斷面乳白色，較平整，粉性強(qiáng)。氣微，味微苦、麻。見圖2。

圖2 寬葉重樓生藥性狀特征

2.3 生藥顯微特征

2.3.1 根莖橫切面 表皮細(xì)胞一至兩層，壁栓化稍增厚，最外層外切向壁栓化顯著、呈棕褐色，細(xì)胞排列緊密、無(wú)細(xì)胞間隙，細(xì)胞呈近圓形、類方形、不整齊長(zhǎng)方形或三角形，少楔形。較粗根莖部分表皮破碎或剝落。

皮層寬廣。外皮層3～6層，比表皮細(xì)胞稍大，有時(shí)因外層外切向壁稍栓化而呈淺褐色，排列較為整齊緊密，基本無(wú)細(xì)胞間隙，不含或少含淀粉粒。皮層薄壁細(xì)胞呈類長(zhǎng)方形、類長(zhǎng)圓形、類多角形，大小均基本等，排列不整齊，細(xì)胞間隙明顯，約有31～40層，內(nèi)含淀粉粒細(xì)胞的細(xì)胞直徑約徑12～36 μm，為生活細(xì)胞；含針晶束的細(xì)胞普遍較大，直徑(長(zhǎng)度)約21～78 μm，為死亡細(xì)胞，針晶束長(zhǎng)32～60 μm，寬10～40 μm。皮層內(nèi)可見根跡維管束，其維管束鞘由薄壁細(xì)胞構(gòu)成，厚約9～13層，內(nèi)有大型細(xì)胞間隙構(gòu)成的通氣組織。可見粘液細(xì)胞。內(nèi)皮層細(xì)胞較小，長(zhǎng)方形、切向延長(zhǎng)，排列成不連續(xù)、不整齊的波狀環(huán)形。皮層寬度與中柱半徑的寬度比約為2～2.5∶1。

中柱結(jié)構(gòu)為基本組織之中散布周木式維管束。中柱鞘不明顯，薄壁細(xì)胞大小較為均等、排列不整齊、細(xì)胞間隙明顯，富含淀粉粒、針晶束。有15～20個(gè)周木式維管束，多散布在中柱外圍，呈橢圓形或不規(guī)則形，少數(shù)兩至三個(gè)成群排列。可見粘液細(xì)胞腔。見圖3。

2.3.2 生藥粉末 呈白色，略帶淡棕黃色。淀粉粒極多，呈球形、長(zhǎng)圓形或鈍三角形，大小差異顯著，基本為單粒，復(fù)粒淀粉為三粒復(fù)合型和多粒團(tuán)塊型，較少，臍點(diǎn)明顯，多為點(diǎn)狀、條狀、人字形及星狀，層紋不明顯，直徑6～25 μm；草酸鈣針晶極多，暗灰色，散在排列或呈束簇狀排列，長(zhǎng)度為12～71 μm，單個(gè)寬約5 μm；導(dǎo)管較常見，主要為螺紋、梯紋及梯-網(wǎng)紋導(dǎo)管，螺紋導(dǎo)管直徑6～15 μm，有導(dǎo)管介于螺紋和梯紋之間，直徑12～40 μm。見圖4。

注：1.栓化表皮;2.皮層;3.維管束鞘;4.根跡;5.細(xì)胞間隙;6.草酸鈣針晶;7.內(nèi)皮層;8.周木式維管束;9.黏液細(xì)胞。圖3 橫切面結(jié)構(gòu)部分詳圖及簡(jiǎn)圖(10×4)

注：1.淀粉粒；2.針晶(束)；3.螺紋導(dǎo)管；4.環(huán)-梯紋導(dǎo)管；5.梯-網(wǎng)紋導(dǎo)管；6.梯紋導(dǎo)管。圖4 生藥粉末顯微特征

2.4 HPLC法測(cè)定重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ總含量

2.4.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性 色譜柱為Inertsil ODS(C18)(250 mm× 4.6 mm，5 μm)；檢測(cè)波長(zhǎng)：203 nm；柱溫：25 ℃；流動(dòng)相：水(A)-乙腈(B)梯度洗脫(見表2)，流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣體積：30 μL。理論板數(shù)按重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ計(jì)算均不低于10 000。對(duì)照品、樣品的HPLC圖見圖5。

表2 梯度洗脫程序表

注：1.重樓皂苷Ⅶ；2.重樓皂苷Ⅵ；3.重樓皂苷Ⅱ；4.重樓皂苷Ⅰ。

注：1.重樓皂苷Ⅶ;2.重樓皂苷Ⅵ;3.重樓皂苷Ⅱ;4.重樓皂苷Ⅰ。圖5 重樓混合對(duì)照品(A)及樣品(B)的HPLC色譜圖

2.4.2 溶液的制備 對(duì)照品溶液的配制：精密稱取重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅵ和重樓皂苷Ⅶ 2 mg，分別置于5 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，制成濃度為0.4 mg·mL-1的對(duì)照品溶液，備用；精密吸取上述4種對(duì)照品溶液各1.5 mL，置于統(tǒng)一10 mL容量瓶中，搖勻，用甲醇定容，即得混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。

供試品的制備：將寬葉重樓根莖粉碎成粗粉，精密稱取藥材粉末2.0 g，置于錐形瓶中，加入25 mL 90%乙醇，浸泡0.5 h后，連續(xù)回流提取2次，合并濾液，完全蒸發(fā)續(xù)濾液中溶劑，向其中加入甲醇溶解，并定容至10 mL容量瓶?jī)?nèi)，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.4.3 方法學(xué)的考察 按相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行方法學(xué)試驗(yàn)，結(jié)果，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性以及加樣回收率試驗(yàn)中，供試品的峰面積RSD值均在規(guī)定范圍內(nèi)，表明方法精密度、供試品溶液穩(wěn)定性、方法重復(fù)性較好。

2.4.4 寬葉重樓藥材樣品有效組分的含量測(cè)定 取10批8月采集的寬葉重樓藥材樣品各適量，分別按“2.4.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，并以干燥品計(jì)算含量。結(jié)果見表3。

表3 10批8月采集寬葉重樓藥材的有效組分含量測(cè)定結(jié)果 %

測(cè)定結(jié)果表明，寬葉重樓藥材中重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的總含量均在3%以上，符合2015版《中華人民共和國(guó)藥典》“重樓”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)論

陜產(chǎn)重樓屬南重樓組有2種6變種(含云南重樓和七葉一枝花)均為中藥重樓的來(lái)源植物[8]，寬葉重樓的葉片寬2.6 cm以上、內(nèi)輪花被片遠(yuǎn)長(zhǎng)于外輪花被片、子房外壁或外果皮的疣狀凸起等特征與重樓易于區(qū)別。但長(zhǎng)期以來(lái)，寬葉重樓常被當(dāng)做“燈臺(tái)七”使用[2-8]，大眾認(rèn)知與入藥均混同于重樓其它粗壯根莖的類群。本研究厘清了寬葉重樓的識(shí)別特征、生藥來(lái)源、生長(zhǎng)習(xí)性及陜西省主要分布區(qū)，以正本清源。

根莖橫切面顯微結(jié)構(gòu)中具有1至2層表皮、內(nèi)皮層排列成不連續(xù)的波狀環(huán)形、15～20個(gè)小型散布周木式維管束等橫切面特征性結(jié)構(gòu)，根跡維管束鞘內(nèi)有類似于通氣組織的大型細(xì)胞間隙，與其陰濕的生長(zhǎng)環(huán)境相輔[34]，連同點(diǎn)狀、條狀、人字形及星狀臍點(diǎn)的(鈍)球形淀粉粒等生藥粉末特征，與七葉一枝花和云南重樓1層表皮、斷續(xù)排列的內(nèi)皮層、25個(gè)以上小型散布周木維管束、生藥粉末中淀粉粒等特征[13，35]有顯著區(qū)別，是標(biāo)志性顯微鑒別指標(biāo)。

寬葉重樓生藥有效組分重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ總含量超過(guò)了2015版《中華人民共和國(guó)藥典》0.6%的指標(biāo)，就本實(shí)驗(yàn)而言，寬葉重樓藥材以實(shí)生苗生長(zhǎng)年限6年以上、株高100 cm以上、采集時(shí)間在8月間較為適宜，與李艷敏等[32]、童凱等[33]甾體皂苷總含量因闊葉形、莖高增加、隨生長(zhǎng)年限延長(zhǎng)而增加等研究結(jié)果一致；也表明它在自然分布區(qū)的海拔區(qū)限內(nèi)的質(zhì)量無(wú)顯著差異；與七葉一枝花、云南重樓的原植物來(lái)源、性狀、顯微特征及4種重樓皂苷類有效組分有相似性，說(shuō)明二者具有質(zhì)量相似性，在一定程度上印證了陜西民間、歷史上和中藥原料藥市場(chǎng)將它作為重樓同名等效藥用[2-8，15-17]的合理性，在資源上相互替代的可行性和藥理活性值得進(jìn)一步研究和。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)寬葉重樓的生物學(xué)特征和生藥學(xué)研究結(jié)果，將為陜西尋求中藥重樓替代資源、制訂寬葉重樓質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、研究陜產(chǎn)重樓屬其它類群的生藥學(xué)特征奠定了基礎(chǔ)，充分利用藥典收載種類的生物學(xué)信息[36]和種苗繁育技術(shù)[37-38]合理開發(fā)陜西特色資源。