影響腱骨愈合的因素及促進(jìn)腱骨愈合的策略

肖磊， 鄭博元， 莊騰豐， 王華軍， 鄭小飛

(暨南大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 骨關(guān)節(jié)與運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)中心， 廣東 廣州 510630)

肌腱勞損到肌腱全層斷裂等肌腱損傷已成為危害人類(lèi)健康的最常見(jiàn)疾病之一.芬蘭的人口僅為500萬(wàn)，但每年有超過(guò)20萬(wàn)例急性肌腱損傷發(fā)生；在美國(guó)，約30%～50%的運(yùn)動(dòng)損傷為肌腱勞損，每年約有10萬(wàn)至20萬(wàn)例前交叉韌帶損傷發(fā)生，每3 000人中就有1人患有前交叉韌帶損傷；每年超過(guò)51%的80歲以上老年人患有肩袖損傷[1].中國(guó)每年僅前交叉韌帶斷裂手術(shù)患者高達(dá)10萬(wàn)人次.同時(shí)，肌腱損傷的高患病率也給每個(gè)國(guó)家的醫(yī)療保健系統(tǒng)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān).澳大利亞每年用于肩袖修補(bǔ)術(shù)的直接醫(yī)療花費(fèi)超過(guò)2.5億美元，而美國(guó)政府每年用于治療肩袖損傷的醫(yī)療花費(fèi)甚至超過(guò)70億美元[2].根據(jù)肌腱損傷的嚴(yán)重程度、患者職業(yè)等，手術(shù)重建已經(jīng)成為前交叉韌帶損傷、肩袖損傷等疾病的重要治療手段.但目前手術(shù)重建的長(zhǎng)期療效并不樂(lè)觀，約有32%的前交叉韌帶重建術(shù)后患者預(yù)后不滿意，且有10%的患者需要再次手術(shù)[3]，而肩袖修復(fù)術(shù)后再撕裂的發(fā)生率甚至可高達(dá)94%[4].因腱骨的特殊結(jié)構(gòu)導(dǎo)致的愈合能力較差，手術(shù)重建愈合時(shí)間長(zhǎng)，而愈合時(shí)間的長(zhǎng)短直接影響到患者早期的康復(fù)訓(xùn)練.可見(jiàn)，促進(jìn)腱骨愈合是手術(shù)重建治療和功能恢復(fù)的核心，提高腱骨愈合能力并縮短其愈合時(shí)間.因此，本研究通過(guò)文獻(xiàn)對(duì)影響腱骨愈合因素及促進(jìn)腱骨愈合策略等關(guān)鍵問(wèn)題進(jìn)行綜述，以期對(duì)臨床治療提供依據(jù).

1 正常腱骨止點(diǎn)的解剖結(jié)構(gòu)及腱骨愈合過(guò)程

正常腱骨止點(diǎn)是一系列高度特異排序的組織，其主要作用為傳遞從軟組織至骨的復(fù)雜機(jī)械應(yīng)力.腱骨止點(diǎn)通常分為直接止點(diǎn)與間接止點(diǎn)，直接止點(diǎn)以前交叉韌帶及肩袖為例，存在連接軟組織結(jié)構(gòu)與深層次骨組織的纖維軟骨組織.直接止點(diǎn)的轉(zhuǎn)化區(qū)中包含4種不同類(lèi)型的軟組織：肌腱/韌帶、未鈣化的纖維軟骨、鈣化的纖維軟骨及骨組織[5-6]，(圖1、2)；內(nèi)側(cè)副韌帶嵌入脛骨的腱骨止點(diǎn)為典型的間接止點(diǎn)，在間接止點(diǎn)中，存在連接骨膜與肌腱/韌帶的致密纖維組織.

紫色代表Ⅰ型膠原，綠色代表Ⅱ型膠原，可見(jiàn)韌帶和骨組織主要有Ⅰ型膠原構(gòu)成，腱骨界面主要由Ⅱ型膠原構(gòu)成.

Purple represents type Ⅰ collagen, green represents type Ⅱ collagen, so ligament and bone tissue mainly composed of type Ⅰ collagen, tendon bone interface mainly composed of type Ⅱ collagen.

圖1 腱骨止點(diǎn)末端結(jié)構(gòu)的分子成分[5]

Fig.1 Molecular composition of terminal structure of tendon-to-bone attachment[5]

a:腱骨止點(diǎn)的分層組織；b:轉(zhuǎn)化區(qū)不同組織的礦物含量梯度；c:轉(zhuǎn)化區(qū)組織礦物含量梯度的透射電子顯微鏡相(上)、拉曼投針結(jié)果(下)；d:透射電子顯微鏡相的電子能量損失譜，紅色代表鈣含量高、綠色代表碳含量高.

a:Tissue-level schematic of the tendon-to-bone attachment. b: Schematic of transitional tissue, with mineral content within fbrocartilage indicated by greyscale intensity. c: TEM(Transmission Electron Microscope) image of mineral gradient (top) and Raman microprobe results of mineral content, (bottom), with colour dots indicating mineral content, red low and blue high. d:TEM-electron energy loss spectroscopy image revealing calcium-dominated regions (mineral) in red and carbon-dominated regions (tropocollagen) in green.

圖2 腱骨止點(diǎn)的分層結(jié)構(gòu)[6]

Fig.2 The hierarchical structure of the tendon-to-bone attachment[6]

對(duì)于肩袖撕裂、前交叉韌帶斷裂等肌腱損傷，手術(shù)重建是常用的手段，但重建的預(yù)后情況不樂(lè)觀，11%～32%的前交叉韌帶重建術(shù)后患者預(yù)后不佳，約10%的患者需再次手術(shù)，而肩袖修補(bǔ)術(shù)后肩袖再撕裂發(fā)生率高達(dá)20%～94%[3-4].重建手術(shù)從解剖上恢復(fù)肌腱的位置，但只有達(dá)到牢固的腱骨愈合才能提供有效的力學(xué)強(qiáng)度，盡管修復(fù)技術(shù)不斷進(jìn)步，但肩袖撕裂、前交叉韌帶斷裂等的重建術(shù)后牢固的腱骨愈合依然是一個(gè)難題.

肌腱愈合過(guò)程可以分為3個(gè)主要階段：炎性滲出、纖維增生及改造塑形(表1).相對(duì)肌腱愈合，腱骨愈合較為復(fù)雜.目前已有許多研究腱骨愈合過(guò)程的動(dòng)物實(shí)驗(yàn).Rodeo 等[7]在狗的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，將脛骨處的長(zhǎng)伸肌腱轉(zhuǎn)位并固定在脛骨骨性隧道中，2周后可見(jiàn)血管及纖維肉芽組織覆蓋于腱骨界面，4周后可見(jiàn)骨隧道有新生的骨組織長(zhǎng)入，12周后可見(jiàn)連接肌腱與骨隧道表明的膠原纖維，該膠原纖維延肌腱的受力方向排列，與Sharpey纖維十分相似，26周后在骨隧道全長(zhǎng)均可見(jiàn)連接肌腱與骨隧道表明的膠原纖維，最終形成纖維性的腱骨止點(diǎn).Hays 等[8]的研究中，對(duì)192只清潔級(jí)健康成年雄性大鼠行自體屈肌腱前交叉韌帶重建術(shù)，分別在7、14、28及42 d用光學(xué)顯微鏡觀察腱骨愈合過(guò)程，其過(guò)程主要為：大量新生骨小梁出現(xiàn)在骨通道表明成纖維細(xì)胞大量增殖，形成軟骨樣細(xì)胞，膠原纖維逐漸成熟后形成Sharpey膠原纖維；Sharpey膠原纖維的形成是腱骨愈合的最早標(biāo)志，且需要1年才形成典型的4層結(jié)構(gòu).可見(jiàn)，重建術(shù)后肌腱移植物在骨通道中的愈合過(guò)程主要包括隧道側(cè)壁成骨、新生骨在塑形、腱骨界面形成血供、Sharpey纖維形成及纖維軟骨鈣化等多個(gè)環(huán)節(jié)[9].腱骨愈合的機(jī)制尚未完全明確，目前認(rèn)為，纖維軟骨帶是腱骨止點(diǎn)的特征性結(jié)構(gòu)，對(duì)腱骨愈合起關(guān)鍵作用.

表1 肌腱愈合過(guò)程Table 1 Tendon-to-bone healing process

2 影響腱骨愈合的因素

2.1 移植物與骨隧道的適配度

移植物與骨隧道的適配度將影響移植物在骨隧道內(nèi)的活動(dòng)度，隨著骨隧道的擴(kuò)大，移植物在其間的活動(dòng)度增加，導(dǎo)致移植物在骨隧道內(nèi)的縱向運(yùn)動(dòng)(蹦極效應(yīng))和橫向運(yùn)動(dòng)(雨刷效應(yīng))增加，兩種效應(yīng)不利于移植物與骨道愈合，并使骨隧道擴(kuò)大.Tien 等[10]的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，采用直徑為(1.48±0.12)mm的半腱肌重建新西蘭白兔的前交叉韌帶，3組實(shí)驗(yàn)兔骨隧道的直徑分別為1.5、1.8、2.0mm，術(shù)后15 d測(cè)試重建韌帶的抗張強(qiáng)度得出，骨隧道直徑2.0 mm組實(shí)驗(yàn)兔的重建韌帶平均抗張強(qiáng)度為(1.302±0.657)kg，僅為骨隧道直徑1.5 mm組實(shí)驗(yàn)兔的一半(2.511±0.293)kg，移植物與骨隧道的適配度與腱骨愈合關(guān)系密切，骨隧道直徑與移植物直徑一致可實(shí)現(xiàn)更大的錨定強(qiáng)度.

2.2 移植物固定方法

移植物的固定根據(jù)固定裝置與移植物末端的距離可分為直接固定與間接固定，直接固定是將移植物直接固定于骨，而間接固定是將移植物末端固定于相對(duì)較遠(yuǎn)部位.直接固定相比于間接固定可以減少移植物與骨道間的縱向運(yùn)動(dòng)(蹦極效應(yīng))和橫向運(yùn)動(dòng)(雨刷效應(yīng)).

2.3 移植物在骨隧道內(nèi)的位置

移植物在骨隧道內(nèi)的位置不同其愈合情況也不一樣.Berg 等[11]的研究中，選取26只成年兔，分別在股骨端與脛骨端遠(yuǎn)離關(guān)節(jié)腔、靠近關(guān)節(jié)腔及中間地帶3個(gè)部分鉆取直徑為3.2 mm的骨隧道，并在術(shù)后1、2、4和12周觀察骨隧道的骨長(zhǎng)入情況，結(jié)果越接近關(guān)節(jié)腔，隧道內(nèi)新生骨的含量越少，肌腱在骨隧道內(nèi)的愈合是由隧道遠(yuǎn)端向關(guān)節(jié)腔內(nèi)生長(zhǎng)的，越靠近關(guān)節(jié)腔，愈合所需時(shí)間越長(zhǎng).

2.4 移植物的機(jī)械應(yīng)力

肌腱在骨隧道內(nèi)的愈合情況與移植物的機(jī)械應(yīng)力有關(guān)，張應(yīng)力對(duì)腱骨愈合起促進(jìn)作用，壓應(yīng)力促進(jìn)軟骨形成，切應(yīng)力對(duì)愈合幾乎無(wú)影響.當(dāng)移植物的力學(xué)因素改變時(shí)，移植物的生物力學(xué)特性將因此改變，進(jìn)而影響肌腱移植物與骨道周?chē)挠?Yamakado等[12]的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，選取44只雌性日本白兔，將其趾長(zhǎng)伸肌的股骨端切斷后植入垂直于脛骨干的骨隧道內(nèi).移植物在骨隧道不同部位的應(yīng)力不同，壓應(yīng)力分布于隧道下部，張應(yīng)力分布于骨隧道口處，而切應(yīng)力主要分布在隧道內(nèi)部.術(shù)后4、6、8、12周及6月觀察骨隧道不同部位移植物的愈合情況.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，術(shù)后4～6周可見(jiàn)骨隧道上部已有類(lèi)似Sharpey纖維連接，術(shù)后12周可見(jiàn)隧道內(nèi)的纖維連接變薄，但在隧道口處纖維連接排列更加有序，隧道內(nèi)部無(wú)編織骨，僅見(jiàn)于隧道口，移植物在骨隧道不同部位的愈合情況差異是由不同的機(jī)械應(yīng)力造成的.

3 促進(jìn)腱骨愈合的策略

3.1 生長(zhǎng)因子

生長(zhǎng)因子(growth factors，GF)是一類(lèi)可調(diào)節(jié)、促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞因子，又稱(chēng)多肽生長(zhǎng)因子.理論上，生長(zhǎng)因子可通過(guò)促進(jìn)膠原纖維生產(chǎn)或促進(jìn)新骨形成等不同作用加速腱骨愈合的進(jìn)程，主要包括：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor，TGF)、骨形態(tài)生成蛋白(bone morphogeneti protein，BMP)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)和粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)等對(duì)腱骨愈合有促進(jìn)作用[13-15].

3.1.1 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β

正常的肌腱細(xì)胞在肌腱受損時(shí)能產(chǎn)生轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)，TGF-β可促進(jìn)組織修復(fù)和愈合、抑制慢性炎癥疾病、調(diào)節(jié)自身免疫及抑制移植排斥反應(yīng)過(guò)程.TGF-β有TGF-β1、TGF-β2、TGF-β33種同分異構(gòu)體，其中TGF-β1與損傷修復(fù)過(guò)程的關(guān)系最為密切.Yamazaki等[16]選取28只成年獵狗行單側(cè)前交叉韌帶重建術(shù)，骨隧道內(nèi)注入2.0 ng TGFβ1和0.1 mL纖維蛋白膠，纖維蛋白膠組中骨隧道內(nèi)注入0.1 mL纖維蛋白膠，空白對(duì)照組未予以任何處理，實(shí)驗(yàn)組最大抗拉力為(188.2±5.4)N，明顯大于纖維蛋白膠組(99.0±18.7)N和空白對(duì)照組(86.7±36.5)N.Mannning等[17]在大鼠的研究中，實(shí)驗(yàn)組采用肝素/纖維蛋白將TGF-β3輸送得到腱骨插入點(diǎn)修復(fù)岡上肌損傷，結(jié)果同樣證實(shí)TGF-β3能夠增加炎癥反應(yīng)、新生血管、細(xì)胞增殖來(lái)加速腱骨愈合，改善力學(xué)性能.

3.1.2 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是1989年由Ferrara N等從牛垂體濾泡星狀細(xì)胞體外培養(yǎng)中純化出來(lái)的蛋白質(zhì).韌帶重建后的再血管化及塑形改建過(guò)程中，VEGF起到重要作用.Yoshikawa 等[18]的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，取自體半腱肌對(duì)羊行前交叉韌帶重建術(shù)，用含有VEGF的溶液浸泡移植肌腱，對(duì)照組不特殊處理，術(shù)后12周結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組移植韌帶中新生血管數(shù)比對(duì)照組明顯豐富，實(shí)驗(yàn)組移植韌帶的機(jī)械性能也優(yōu)于對(duì)照組，證實(shí)VEGF可促進(jìn)新生血管的形成，并使腱骨界面獲得更好的機(jī)械性能.

3.1.3 骨形態(tài)生成蛋白

骨形態(tài)生成蛋白(bone morphogeneti protein，BMP)屬非水溶性蛋白，也是證實(shí)可單獨(dú)誘導(dǎo)骨組織形成的局部生長(zhǎng)因子，已有20余種BMP被分離和克隆，除BMP-1外其余均屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β超家族，研究最多的是BMP-2.張力等[19]取30只成年新西蘭兔同側(cè)半腱肌肌腱作為自體移植材料行雙側(cè)前交叉韌帶重建術(shù)，實(shí)驗(yàn)組在移植腱骨隧道界面注射填充以纖維蛋白膠作為載體的rhBMP-2，對(duì)照組僅填充纖維蛋白膠，空白對(duì)照組不作任何填充，實(shí)驗(yàn)組術(shù)后2周界面組織主要由軟骨細(xì)胞和軟骨機(jī)制構(gòu)成，術(shù)后4周可見(jiàn)類(lèi)似直接止點(diǎn)的4層結(jié)構(gòu)，術(shù)后8周界面主要由直接止點(diǎn)構(gòu)成，實(shí)驗(yàn)組的腱骨愈合程度明顯優(yōu)于對(duì)照組，證實(shí)BMP-2在加速腱骨愈合的同時(shí)，可使腱骨界面獲得更好的生物力學(xué)特性.

此外，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)和粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)等生長(zhǎng)因子均被證明在動(dòng)物模型中對(duì)腱骨愈合有促進(jìn)作用.

3.2 富血小板血漿

富血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)含高濃度的血小板、白細(xì)胞和纖維蛋白，源于自身血液，根據(jù)血液中各類(lèi)細(xì)胞沉降系數(shù)的差別，通過(guò)離心的方法從全血中提取出血小板濃縮液.已證實(shí)PRP可促進(jìn)組織修復(fù)，因其含有高濃度的血小板，而血小板細(xì)胞中含有大量促進(jìn)組織修復(fù)的生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子，如TGF、PDGF、VEGF、胰島素樣生長(zhǎng)因子等.PRP激活后可釋放大量促進(jìn)組織修復(fù)的生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子，進(jìn)而促進(jìn)腱骨界面處的細(xì)胞遷徙及分化，從而起到促進(jìn)腱骨愈合的作用.Hee等[20]用綿羊作為肩袖損傷修補(bǔ)的動(dòng)物模型，將不同質(zhì)量濃度的重組血小板源性生長(zhǎng)因子(platelet-derived growth factor，rhPDGF-BB)和I型膠原基質(zhì)注入實(shí)驗(yàn)綿羊肩袖修補(bǔ)處，當(dāng)注入中質(zhì)量濃度的重組血小板源性生長(zhǎng)因子(rhPDGF-BB)和I型膠原基質(zhì)時(shí)，綿羊肩袖修補(bǔ)處可承受的極限負(fù)荷明顯優(yōu)于低質(zhì)量濃度的實(shí)驗(yàn)綿羊，證實(shí)在肩袖修補(bǔ)處注入重組血小板源性生長(zhǎng)因子(rhPDGF-BB)和I型膠原基質(zhì)可增強(qiáng)肩袖修補(bǔ)處的生物力學(xué)強(qiáng)度、加速肩袖修補(bǔ)處愈合.

Sanchez 等[21]對(duì)37例行前交叉韌帶重建術(shù)后6～24周的患者進(jìn)行二次關(guān)節(jié)鏡探查，22例患者采用PRP輔助治療分為實(shí)驗(yàn)組，15例患者為對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組患者移植肌腱的滑膜覆蓋、厚度及緊張性方面的優(yōu)良率明顯更高.而Zhang等[22]一項(xiàng)臨床試驗(yàn)中將60例肩關(guān)節(jié)鏡下肩袖修補(bǔ)的患者分為對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組各30例，對(duì)照組采用雙排釘固定，實(shí)驗(yàn)組在雙排釘固定的基礎(chǔ)上在肩袖修補(bǔ)處注入富血小板血漿，術(shù)后12周對(duì)照組患者的再斷率(30%)是實(shí)驗(yàn)組(14%)的兩倍，富血小板血漿可降低肩袖修補(bǔ)術(shù)后的再斷率.王亞斌等[23]對(duì)24只兔行雙側(cè)前交叉韌帶重建的實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組為一側(cè)膝關(guān)節(jié)移植物予自體PRP凝膠預(yù)處理，對(duì)照組為另一側(cè)膝關(guān)節(jié)移植物不予處理，發(fā)現(xiàn)2周和6周時(shí)Burak評(píng)分實(shí)驗(yàn)組高于對(duì)照組，12周時(shí)對(duì)照組腱骨界面為成熟瘢痕組織，而實(shí)驗(yàn)組顯示該界面為成熟纖維軟骨帶，證實(shí)PRP凝膠可促進(jìn)同種異體移植肌腱早期腱骨愈合.董佩龍等[24]將40例擬接受初次膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶重建的單純前交叉韌帶斷裂患者隨機(jī)分為兩組，每組20例，富血小板血漿組術(shù)中應(yīng)用自體富血小板血漿和血凝酶浸泡移植物，生理鹽水組應(yīng)用同等劑量的生理鹽水和血凝酶浸泡移植物，結(jié)果富血小板血漿組Lysholm評(píng)分由術(shù)前(39.8±8.9)分提高至術(shù)后12個(gè)月(92.1±2.7)分，明顯優(yōu)于生理鹽水組，富血小板血漿組KNEELAX3測(cè)量結(jié)果由術(shù)前(9.4±1.2)mm降至術(shù)后12個(gè)月(1.2±1.1)mm，較生理鹽水組明顯改善，PRP可使移植肌腱獲得更優(yōu)良的滑膜覆蓋、厚度及緊張性.

3.3 基因治療

生長(zhǎng)因子的半衰期較短，在體內(nèi)作用時(shí)間有限，需在腱骨界面單次大質(zhì)量濃度或反復(fù)多次使用才能達(dá)到有效藥物質(zhì)量濃度，才能充分發(fā)揮生長(zhǎng)因子促進(jìn)腱骨愈合的生物作用.基因治療有望實(shí)現(xiàn)在腱骨愈合早期持續(xù)向腱骨界面輸入生長(zhǎng)因子，以達(dá)到直接促進(jìn)腱骨愈合的目的.基因工程技術(shù)也稱(chēng)基因拼接技術(shù)和DNA重組技術(shù)，即通過(guò)特定載體將目的基因轉(zhuǎn)入目標(biāo)細(xì)胞并發(fā)揮其功能作用，通過(guò)目標(biāo)細(xì)胞的復(fù)制、分化使目的基因持續(xù)、穩(wěn)定表達(dá).目前已有較多研究成功運(yùn)用基因工程技術(shù)實(shí)現(xiàn)促進(jìn)腱骨愈合的目標(biāo).Chen等[25]通過(guò)腺病毒載體將具有促進(jìn)腱骨愈合的堿性生長(zhǎng)因子bFGF基因轉(zhuǎn)染至骨形態(tài)蛋白BMP2細(xì)胞中，手術(shù)將轉(zhuǎn)染后的BMP2細(xì)胞植入腱骨界面，結(jié)果顯示基因工程的聯(lián)合復(fù)合物能夠縮短肌腱與骨的愈合過(guò)程，可獲得更好的多孔性及更高的力學(xué)特性.Wang等[26]的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，48只新西蘭白兔并行前交叉韌帶置換術(shù)，運(yùn)用腺病毒介導(dǎo)TGF-β1基因轉(zhuǎn)染方法將TGF-β1基因轉(zhuǎn)入實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)兔腱骨界面細(xì)胞中，術(shù)后12周鏡下觀察發(fā)現(xiàn)A組腱-骨界面大量膠原纖維且排列緊密，與骨隧道壁垂直連接的Sharpey纖維增多顯著，可見(jiàn)愈合晚期類(lèi)似直接止點(diǎn)結(jié)構(gòu)；而對(duì)照組腱-骨界面雖可見(jiàn)纖維細(xì)胞增生、膠原纖維但較少，少量Sharpey纖維排列不規(guī)整，未見(jiàn)類(lèi)似直接止點(diǎn)形成，證實(shí)基因工程技術(shù)可縮短腱骨愈合過(guò)程的時(shí)間，并使腱骨界面獲得更高的力學(xué)特性.

3.4 骨膜包被

骨膜是覆蓋在骨表明的一層纖薄的結(jié)締組織，包含了內(nèi)外兩層結(jié)構(gòu)，外層由大量成纖維細(xì)胞和膠原纖維束組成稱(chēng)為纖維層，內(nèi)層由大量未分化祖細(xì)胞和基質(zhì)顆粒組成稱(chēng)為生發(fā)層.生發(fā)層含有干細(xì)胞，干細(xì)胞有多向分化的能力，可根據(jù)所處的環(huán)境不同分化為骨和軟骨組織，因此在韌帶重建過(guò)程中采用骨膜包裹移植肌腱，并將骨膜縫合在移植肌腱表面，使骨膜的生發(fā)層接觸骨隧道，進(jìn)而增強(qiáng)腱骨界面愈合.Kyung 等[27]選取20只新西蘭白兔，將兔的趾長(zhǎng)伸肌腱植入脛骨近端的骨隧道內(nèi)，根據(jù)是否在移植肌腱末端包裹兔自身的骨膜分為實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組，術(shù)后3、6周均可發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組腱骨界面新生骨形成較對(duì)照組更廣泛、緊密，證實(shí)了骨膜包裹移植肌腱可促進(jìn)腱骨愈合.陳百成等[28]的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中， 將60只健康新西蘭白兔平均分為3組：骨膜包繞肌腱生發(fā)層朝向骨組、骨膜包繞肌腱生發(fā)層朝向肌腱組、肌腱無(wú)骨膜包繞組為對(duì)照組，結(jié)果骨膜生發(fā)層朝向骨組術(shù)后3周即有明顯的骨膜成骨，術(shù)后4周生發(fā)層朝向骨組新生骨小梁較另外兩組顯著增多，術(shù)后6周生發(fā)層朝向骨組，新生骨小梁的數(shù)量以及肌腱結(jié)合的緊密程度均明顯優(yōu)于生發(fā)層朝向肌腱組合對(duì)照組，證實(shí)自體骨膜包裹肌腱且生發(fā)層朝向骨可縮短成骨時(shí)間，加速腱骨愈合.另外，趙楊等[29]選取了60只新西蘭兔建立肩袖損傷模型，根據(jù)是否使用自體骨膜補(bǔ)片分為實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組術(shù)后12周即可見(jiàn)類(lèi)似正常的腱骨界面結(jié)構(gòu)，且實(shí)驗(yàn)組腱骨連接緊密程度、生物力學(xué)特性、抗?fàn)坷瓘?qiáng)度均明顯優(yōu)于對(duì)照組，證實(shí)使用自體骨膜補(bǔ)片可有效促進(jìn)腱骨愈合，縮短肩袖愈合時(shí)間，具有良好的生物學(xué)特性.

3.5 細(xì)胞學(xué)方法

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)存在于全身器官間質(zhì)和結(jié)締組織中，源于中胚層的具有高度多向分化潛能的成體干細(xì)胞，在特定的條件下可分化為多種中胚層來(lái)源的細(xì)胞[30].最早的間充質(zhì)干細(xì)胞是從骨髓中分離而來(lái)，之后從脂肪組織、期待、牙髓、肌肉、滑膜以及肌腱等組織中提取得到間充質(zhì)干細(xì)胞[31].動(dòng)物移植研究證實(shí)，間充質(zhì)干細(xì)胞可以增強(qiáng)組織的修復(fù)，促進(jìn)骨、關(guān)節(jié)軟骨、椎間盤(pán)以及肌腱再生.多種來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞和軟骨相關(guān)的細(xì)胞能夠促進(jìn)腱骨界面纖維軟骨形成，進(jìn)而改善腱骨連接的生物力學(xué)強(qiáng)度[30].

3.5.1 骨髓來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞

因骨髓來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)獲取方便，分離和純化技術(shù)已趨成熟，是軟骨組織工程中目前公認(rèn)的最有發(fā)展?jié)摿Φ姆N子細(xì)胞.Nourissat等[32]將大鼠跟腱切除后再手術(shù)重建，組1局部未予以處理，組2跟腱止點(diǎn)重建模型注射軟骨細(xì)胞，組3跟腱止點(diǎn)重建模型注射BMSCs，術(shù)后45 d組3在腱骨連接界面出現(xiàn)許多整齊排列的圓形軟骨細(xì)胞，形成類(lèi)似于正常連接界面的典型4層結(jié)構(gòu)，腱骨愈合情況遠(yuǎn)優(yōu)于組1和組2，證實(shí)骨髓來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)腱骨愈合的作用.在Hemigou等[33]的臨床研究中，90例行肩關(guān)節(jié)鏡修復(fù)肩袖損傷的患者，研究者向45例實(shí)驗(yàn)組患者腱骨連接界面注射濃縮的自體BMSCs，對(duì)照組未予以特殊處理，并在術(shù)后進(jìn)行連續(xù)24個(gè)月的隨訪，術(shù)后6個(gè)月隨訪發(fā)現(xiàn)間實(shí)驗(yàn)組治愈率(100%)明顯高于對(duì)照組(67%)；此外，在10年的隨訪期內(nèi)，肩袖保持完好的患者有39例(87%)，而對(duì)照組僅20例(44%)，也證實(shí)了骨髓來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)腱骨愈合的作用.Voss等[34-35]在肩關(guān)節(jié)鏡下肩袖修復(fù)術(shù)中通過(guò)肱骨近端穿刺成功獲取骨髓來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞，并具有可重復(fù)性，可避免穿刺身體的其他部位或二次手術(shù)，使得BMSCs的應(yīng)用更加方便.

3.5.2 脂肪來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞

脂肪來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)是一種可向多種間充質(zhì)細(xì)胞增殖分化的祖細(xì)胞，可釋放出生長(zhǎng)因子和其他細(xì)胞因子.脂肪組織的獲取方式十分簡(jiǎn)單，通過(guò)微創(chuàng)的吸脂術(shù)可輕易獲取脂肪組織，再經(jīng)過(guò)分離培養(yǎng)即可得到存活力極強(qiáng)的ADSCs.與和造血細(xì)胞不同，ADSCs不會(huì)引起強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)而且還會(huì)釋放免疫抑制因子，使ADSCs的同種異體移植可以順利進(jìn)行.Oh等[36]在兔實(shí)驗(yàn)中，將兔肩胛下肌切除并在6周后對(duì)其進(jìn)行二期修復(fù)以模擬陳舊性肩袖損傷重建模型，并將32只模型兔分為4組：添加ADSCs+修復(fù)組、添加生理鹽水+修復(fù)組、添加ADSCs組、添加生理鹽水組，在修復(fù)后的第6周測(cè)得添加ADSCs+修復(fù)組的抗拉力最大負(fù)荷(87.02±29.81)N明顯高于添加生理鹽水+修復(fù)組(59.85±37.77)N，證實(shí)脂肪來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞可使腱骨界面在較短時(shí)間內(nèi)獲得較高的力學(xué)強(qiáng)度.

3.5.3 肌腱來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞

近年，研究者在人、小鼠、大鼠、兔及馬等生物的肌腱組織中分理處間充質(zhì)干細(xì)胞.在體外經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)后可以分化為成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞以及脂肪細(xì)胞；在裸小鼠和裸大鼠的皮下移植肌腱干細(xì)胞(tendon-derived stem cells，TDSCs)形成了類(lèi)似肌腱、骨、軟骨以及腱骨連接界面的組織.Cheng等[37]選取45只實(shí)驗(yàn)兔并分為3組：TSCs組、抑制了TSG-6(腫瘤壞死因子α基因)的TSCs組以及空白對(duì)照組，將各組TSCs通過(guò)纖維凝膠作用到大鼠岡上肌腱骨連接界面，術(shù)后第4周結(jié)果發(fā)現(xiàn)TSCs組的抗拉力最大負(fù)荷(4.91±1.41)N/mm2顯著大于對(duì)照組(2.99±1.04)N/mm2，證實(shí)肌腱來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞具有促進(jìn)腱骨愈合的作用.Bi等[38]最先在小鼠髕腱和人腘繩肌腱中發(fā)現(xiàn)肌腱干細(xì)胞，隨后Nagura等[39]從9例患者的肩袖中分離得到肌腱干細(xì)胞，而Utsunomiya等[40]從孟肱關(guān)節(jié)滑膜、肩峰下滑囊、肩袖肌腱和大結(jié)節(jié)止點(diǎn)中)中提取肌腱干細(xì)胞，說(shuō)明成功從動(dòng)物和人的肩袖組織中獲取肌腱干細(xì)胞.

3.6 材料學(xué)方法

3.6.1 骨誘導(dǎo)材料

鈣磷生物材料具有良好的生物相容性而廣泛用于自體骨替代和骨缺損填充，也逐漸用于促進(jìn)腱骨愈合的實(shí)驗(yàn)研究.骨誘導(dǎo)材料中以磷酸鈣或磷酸鎂類(lèi)為主，具有骨傳導(dǎo)性及骨誘導(dǎo)性，能夠刺激新骨生成，并最終被骨組織所替代.Zhao等[41]將144只斯普拉-道來(lái)氏大鼠岡上肌腱離斷后3周再行二次修復(fù)，并將修復(fù)后的大鼠分為3組：僅做修復(fù)組、使用磷酸鈣黏合材料修復(fù)組和使用羥基磷灰石黏合材料修復(fù)組，分別于術(shù)后2、4和8周利用微型CT觀察發(fā)現(xiàn)使用磷酸鈣黏合材料修復(fù)組和使用羥基磷灰石黏合材料修復(fù)組比對(duì)照組具有更大的極限載荷和更強(qiáng)的硬度，且具有更好的生物相容性與降解性，證實(shí)磷酸鈣直接促進(jìn)腱骨愈合，還可促進(jìn)生長(zhǎng)因子分泌間接促進(jìn)腱骨愈合.沈瀚等[42]對(duì)30只新西蘭兔行自體半腱肌前交叉韌帶重建術(shù)，并根據(jù)是否在骨隧道內(nèi)植入骨誘導(dǎo)性鈣磷陶瓷分為實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組，術(shù)后4、8和12周采用HE、Masson天狼星紅染色觀察腱骨界面組織學(xué)變化，實(shí)驗(yàn)組8周時(shí)可見(jiàn)大量Sharpey纖維形成，12周出現(xiàn)直接連接，而對(duì)照組12周時(shí)才出現(xiàn)Sharpey纖維，同樣證實(shí)鈣磷生物材料可明顯縮短腱骨愈合的時(shí)間.

3.6.2 生物可吸收界面螺釘

前交叉韌帶損傷、肩袖損傷重建后，成功的關(guān)鍵在于移植肌腱與骨隧道的牢固愈合并保持移植肌腱的張力.生物可吸收界面螺釘始于20世紀(jì)90年代，其在固定移植肌腱的同時(shí)還可在原有部位完全降解，且不影響術(shù)后磁共振顯影.Cheng等[43]的研究中，對(duì)60只新西蘭白兔行自體半腱肌腱前交叉韌帶重建術(shù)，實(shí)驗(yàn)組術(shù)中使用高純度可降解鎂的螺釘固定，對(duì)照組術(shù)中使用鈦金屬螺釘，術(shù)后12周實(shí)驗(yàn)組已可見(jiàn)清楚地纖維軟骨移行區(qū)，而對(duì)照組中僅可見(jiàn)紊亂的纖維軟骨層，實(shí)驗(yàn)組中還可見(jiàn)較高水平的BMP-2、VEGF及纖維軟骨標(biāo)志物等表達(dá)，證實(shí)了生物可吸收界面螺釘可促進(jìn)腱骨界面生長(zhǎng)因子的釋放，縮短腱骨愈合的時(shí)間.

3.6.3 可降解支架

生物相容性支架或可降解多孔支架一般為纖維蛋白膠、聚乙醇酸等材料，其具有多孔超微結(jié)構(gòu)，可建立一個(gè)適合細(xì)胞增殖和分化的環(huán)境來(lái)促進(jìn)腱骨細(xì)胞附著和長(zhǎng)入.已有大量研究證實(shí)可降解支架促進(jìn)腱骨愈合的有效性.Spalazzi 等[44]將成纖維細(xì)胞和成骨細(xì)胞聯(lián)合三相支架、非細(xì)胞支架植入行前交叉韌帶重建術(shù)的無(wú)胸腺實(shí)驗(yàn)大鼠中，分為實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組，三相支架的3個(gè)部分分別與韌帶、腱骨界面和骨接觸，術(shù)后8周觀察發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組腱骨界面愈合情況和移植肌腱的力學(xué)特性明顯優(yōu)于對(duì)照組，證實(shí)生物相容性支架可促進(jìn)腱骨愈合.Wu等[45]、Yokoya等[46]的研究也證實(shí)纖維蛋白膠、聚乙醇酸材料在腱骨愈合處形成一高細(xì)胞活性區(qū)域，其腱骨細(xì)胞的附著和長(zhǎng)入增強(qiáng).

3.7 物理學(xué)方法

3.7.1 低強(qiáng)度脈沖超聲波

低強(qiáng)度脈沖超聲波(Low-intensity pulsed ultrasound，LIPUS)是1.5 MHz，聲強(qiáng)在1～50 mW/cm2的超聲.研究證明，LIPUS對(duì)骨愈合的各個(gè)過(guò)程包括血管生成、軟骨形成以及骨形成均有益處，用于促進(jìn)骨折愈合、骨折延遲愈合、軟骨缺損和韌帶損傷.LIPUS對(duì)腱骨愈合有促進(jìn)作用，且使用LIPUS后愈合的腱骨界面更接近正常的形態(tài).Lovric等[47]的山羊?qū)嶒?yàn)中，行肩袖修補(bǔ)術(shù)，根據(jù)是否使用低強(qiáng)度脈沖超聲波分為實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組，術(shù)后28 d觀察發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組腱骨界面的成骨細(xì)胞活性、血管化和礦化程度均明顯優(yōu)于對(duì)照組，證實(shí)LIPUS可促進(jìn)腱骨界面的血管形成并使腱骨界面獲得更好的力學(xué)特性.

3.7.2 體外沖擊波治療(extracorporeal shockwave therapy，ESWT)

與LIPUS相比，體外沖擊波治療可以輸送更高的能量，總共僅需要2～3次的治療，也更容易被患者所接受.目前有研究顯示體外沖擊波可改變腱骨界面周?chē)牧W(xué)環(huán)境，促發(fā)TGF-β、VEGF、BMP等生長(zhǎng)因子的表達(dá)，骨和膠原的生成增加，最終起到促進(jìn)腱骨愈合的作用[69-70].Wang 等[48]53例前交叉韌帶重建術(shù)后患者，其中予以26例患者體外沖擊波治療并分為治療組， 27例患者行常規(guī)治療分為對(duì)照組，術(shù)后1、2年治療組患者的Lysholm膝關(guān)節(jié)評(píng)分明顯優(yōu)于對(duì)照組(P<0.01)，術(shù)后2年治療組患者的IKDC(international knee documentation committee,IKDC)評(píng)分優(yōu)于對(duì)照組(P<0.05)，且骨隧道X線片可見(jiàn)治療組患者的骨隧道面積明顯較對(duì)照組小，證實(shí)體外沖擊波治療能顯著提高前交叉韌帶重建術(shù)后膝關(guān)節(jié)功能，并能預(yù)防骨隧道的擴(kuò)大.

3.8 中醫(yī)藥治療

3.8.1 中藥

前交叉韌帶或肩袖損傷后，以局部筋肉血脈受損為主，表現(xiàn)為陰血虛損，根據(jù)祖國(guó)醫(yī)學(xué)應(yīng)采用滋補(bǔ)腎陰之法.國(guó)內(nèi)已有實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)中藥療法能夠改善機(jī)體微環(huán)境，促進(jìn)韌帶重建后腱骨界面的細(xì)胞增殖以及分化成熟，起到促進(jìn)腱骨愈合的作用.楊偉毅等[49]將36只新西蘭大白兔隨機(jī)分為3組：溫補(bǔ)腎陽(yáng)組、滋補(bǔ)腎陰組和空白對(duì)照組，對(duì)其行前交叉韌帶重建術(shù)后使用中藥干預(yù)并制備組織標(biāo)本，結(jié)果發(fā)現(xiàn)術(shù)后4、8和12周的HE(Hematoxylin)染色、Masson染色中滋補(bǔ)腎陰組白兔的腱骨界面處的成纖維細(xì)胞、軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)情況最佳，溫補(bǔ)腎陽(yáng)組次之，空白對(duì)照組各種細(xì)胞生長(zhǎng)分化較差，證實(shí)通過(guò)滋補(bǔ)腎陰可有效促進(jìn)腱骨愈合，而溫補(bǔ)腎陽(yáng)對(duì)腱骨愈合有一定促進(jìn)作用.羅程等[50]選取24只新西蘭大白兔隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組于術(shù)中局部應(yīng)用紅花黃色素注射液，對(duì)照組局部使用生理鹽水，行前交叉韌帶重建術(shù)后4、8周實(shí)驗(yàn)組移植肌腱的拉脫負(fù)荷強(qiáng)度均優(yōu)于對(duì)照組，證實(shí)紅花黃色素在生物學(xué)上增強(qiáng)并加速腱骨界面愈合，但具體作用機(jī)制有待大量實(shí)驗(yàn)研究揭示.

3.8.2 針灸

韌帶損傷屬中醫(yī)痹癥，針灸治療可通經(jīng)活絡(luò)，消腫止痛，促使血脈通暢.有研究證實(shí)針灸可用于治療肩袖損傷及前交叉韌帶損傷，關(guān)于針灸對(duì)腱骨愈合的直接研究相對(duì)較少，但仍有一些研究可以間接證明針灸對(duì)腱骨愈合的促進(jìn)作用.Tatiana 等[51]對(duì)6只新加坡Dawley大鼠使用電針治療，治療后使用顯微磁共振掃描大鼠的大腦，發(fā)現(xiàn)大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中間充質(zhì)干細(xì)胞的釋放明顯增多，電針可通過(guò)間充質(zhì)干細(xì)胞的釋放來(lái)起到促進(jìn)腱骨愈合的作用.Rha等[52]將39例岡上肌肌腱損傷患者并分為兩組，針灸組采用針灸治療，富血小板血漿組采用超聲引導(dǎo)下的富血小板血漿注射治療，隨訪6月后發(fā)現(xiàn)針灸組患者的肩關(guān)節(jié)疼痛與殘疾評(píng)分(17.7±3.7)明顯低于富血小板血漿組(29.5±3.8)，即針灸治療對(duì)岡上肌腱損傷的療效優(yōu)于富血小板血漿，針灸治療對(duì)腱骨愈合的促進(jìn)作用優(yōu)于富血小板血漿.蔡凱等[53]將60例行肩袖修補(bǔ)術(shù)治療的患者隨機(jī)分為兩組，對(duì)照組術(shù)后實(shí)施康復(fù)訓(xùn)練，觀察組在對(duì)照組基礎(chǔ)上加用溫針灸肩3針，治療12周后觀察組的VAS(visual analogue scale,VAS)評(píng)分、Constant-Murely評(píng)分均優(yōu)于對(duì)照組，溫針灸可改善肩袖修補(bǔ)術(shù)后患者的肩關(guān)節(jié)活動(dòng)功能、疼痛程度，也有促進(jìn)腱骨愈合的作用.

3.9 術(shù)后康復(fù)

前交叉韌帶重建術(shù)和肩袖修補(bǔ)術(shù)術(shù)后早期的康復(fù)功能鍛煉，不僅有助于防止關(guān)節(jié)粘連、僵硬和肌肉萎縮等術(shù)后并發(fā)癥，還能夠改善腱骨界面的結(jié)構(gòu)、提高肌腱的最大應(yīng)力載荷，從而實(shí)現(xiàn)膝關(guān)節(jié)或肩關(guān)節(jié)功能的早期恢復(fù).已有許多研究證實(shí)術(shù)后早期的適當(dāng)負(fù)重活動(dòng)能夠促進(jìn)腱骨愈合.Packer等[54]對(duì)26只大鼠行前交叉韌帶重建術(shù)，根據(jù)術(shù)后負(fù)重活動(dòng)強(qiáng)度分為3組：全部負(fù)重組、適當(dāng)負(fù)重組和嚴(yán)格制動(dòng)組，術(shù)后2周利用顯微CT(Computed tomography)發(fā)現(xiàn)適當(dāng)負(fù)重組大鼠腱骨界面骨密度質(zhì)量濃度(813.0±24.9)mg/mL高于全部負(fù)重組骨密度質(zhì)量濃度(778.4±32.6)mg/mL和嚴(yán)格制動(dòng)組骨密度質(zhì)量濃度(784.9±26.4)mg/mL，適當(dāng)負(fù)重組大鼠腱骨界面骨小梁厚度(106.5±23.0)μm也明顯優(yōu)于其余兩組(72.6±10.6)μm，證實(shí)術(shù)后康復(fù)鍛煉不應(yīng)過(guò)度負(fù)重，降低腱骨界面骨小梁的厚度對(duì)腱骨愈合造成不良影響，并證實(shí)適當(dāng)負(fù)重可促進(jìn)腱骨愈合.Rodeo等[55]的實(shí)驗(yàn)研究也得出相同結(jié)論，適當(dāng)負(fù)重可促進(jìn)腱骨愈合，但持續(xù)負(fù)重將會(huì)影響腱骨愈合進(jìn)程.在臨床工作中，需針對(duì)不同的患者制定出個(gè)性化的最佳術(shù)后康復(fù)計(jì)劃.

綜上，每種促進(jìn)腱骨愈合的方法均對(duì)移植物在骨隧道內(nèi)的愈合起積極作用，但作用機(jī)制仍需更深入的研究.雖已探索出一些促進(jìn)腱骨愈合的方法[56-57]，但大多數(shù)尚處于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段并未進(jìn)入臨床應(yīng)用.應(yīng)用于臨床還需長(zhǎng)遠(yuǎn)的研究.此外，將多種促進(jìn)腱骨愈合的方法同時(shí)使用，是否會(huì)產(chǎn)生協(xié)同效用或削弱作用，尚需進(jìn)一步的研究.