lncRNA RP11-769O8.2在肝癌組織、細胞系中的表達及其編碼能力評估和靶基因預測

陳思宇，陳安寧，宋偉，劉玲瓏，王鵬飛，姚清媚，吳帆，周素芳

(廣西醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，南寧 530021)

肝癌(HCC)是臨床常見的惡性腫瘤，在癌癥死亡原因中排在前列，且發(fā)病和死亡水平居高不下[1,2]。近年來，雖然臨床上針對HCC的治療手段不斷更新，但治療HCC的總體療效并沒有明顯提高[3]。腫瘤轉移是一個多步驟、多階段、多途徑的復雜過程，涉及到多基因的參與[4]。研究[5～11]發(fā)現(xiàn)，除蛋白質編碼基因能調節(jié)腫瘤外，一些非編碼基因如長鏈非編碼RNA(lncRNA)分子也參與了腫瘤發(fā)生發(fā)展的調控。在HCC中也存在多種lncRNA的表達改變，比如lncRNA MVIH、MALAT-1、HULC和H19等，這些lncRNA通過不同方式調控基因表達，參與了HCC的發(fā)生發(fā)展[12]。RP11-769O8.2是新發(fā)現(xiàn)的一種lncRNA，國內外研究尚未見相關報道。本研究通過實時熒光定量PCR法(RT-PCR法)檢測HCC患者組織及細胞系中RP11-769O8.2，另通過在線數(shù)據(jù)庫評估其編碼能力和預測其靶基因，以揭示RP11-769O8.2的作用機制及意義。

1 材料與方法

1.1 肝癌組織、細胞系及主要試劑、儀器 手術切除的HCC組織17例份[取自廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院2016年10月～2017年3月收治的患者，男14例、女3例，年齡31～60(48.8±9.3)歲，均經(jīng)病理確診，且未進行化療]，保存于本實驗室-80 ℃冰箱；另取癌旁組織(癌組織包膜1 cm外的癌周組織)作對照;臨床病歷資料完整，所有患者均知情同意。人HCC細胞系SK-Hep1、HepG2、Huh7、97L及人正常肝細胞系L-02由本實驗室保存。DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國Hy-Clone公司,胎牛血清、含EDTA胰酶購自Gibco公司,總RNA提取試劑盒購置于Omega Bio-Tek公司，逆轉錄試劑盒、熒光定量反應相關試劑、GAPDH內參引物購置于寶生物工程(大連)有限公司。PCR儀購自德國Biometra公司，熒光定量PCR儀購置于Eppendorf公司。

1.2 HCC組織、細胞系中RP11-769O8.2檢測 采用qRT-PCR法。①HCC組織及癌旁組織：取30 mg冰上解凍的組織樣品，用眼科剪剪碎后轉到50 mL離心管加入1.5 mL裂解液及30 μL的β巰基乙醇，冰上放置，用高速分散勻質機破碎組織，置于冰上10 min，以4 000 r/min離心5 min，取上清，后續(xù)按試劑盒步驟進行；②HCC細胞系：用0.5 mL胰蛋白酶將處于對數(shù)生長期的細胞消化下來，并用PBS洗3次。按試劑盒步驟提取RNA。逆轉錄和PCR反應均嚴格按照TaKaRa公司提供的說明書，以GAPDH作為內參進行相對定量，每組設3復孔，在實時定量熒光PCR儀上進行檢測。RP11-769O8.2：5’-TCAGATTCTGTGGACATTTGGAG-3’，5’-GCCTTAT-TATTGGCTTTGGTTG-3’；內參GAPDH引物：5’-GC-ACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’，5’-TGGTGAAGACG-CCAGTGGA-3’。以2-ΔΔCt法代表RP11-769O8.2的相對表達量。

1.3 RP11-769O8.2編碼能力評估及其靶基因預測 使用在線數(shù)據(jù)庫Coding Potential Calculator Online(http://cpc.cbi.pku.EdU.cn/)預測RP11-769O8.2編碼能力。根據(jù)順式(cis)作用模式預測其靶基因，使用UCSC數(shù)據(jù)庫(http://genome.ucsc.edu/)尋找RP11-769O8.2周圍鄰近的靶基因。

1.4 HCC組織、細胞系中YES原癌基因1(YES1)檢測 采用qRT-PCR法。①HCC及癌旁組織：稱取30 mg冰上解凍的組織樣品，用眼科剪剪碎后轉到50 mL離心管加入1.5 mL裂解液及30 μL的β巰基乙醇，冰上放置，用高速分散勻質機破碎組織，置于冰上10 min，以4 000 r/min離心5 min，取上清，后續(xù)按試劑盒步驟進行；②HCC細胞系：用0.5 mL胰蛋白酶將處于對數(shù)生長期的細胞消化下來，并用PBS洗3次。按試劑盒步驟提取RNA。逆轉錄和PCR反應均嚴格按照TaKaRa公司提供的說明書，以GAPDH作為內參進行相對定量，每組設3復孔，在實時定量熒光PCR儀上進行檢測。YES1：5′-CCCTCCTCCTGAAGTAACGC-3′，5′-CTCATGAGTCGCTGCTACCG-3′；內參GAPDH：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。采用2-ΔΔCt法計算YES1的相對表達量。

2 結果

2.1 HCC組織、細胞系中RP11-769O8.2表達比較 HCC、癌旁組織中RP11-769O8.2表達量分別為13.22±2.04、11.72±2.36，兩者比較，P<0.05。SK-Hep1、Huh7、HepG2、97L細胞系中RP11-769O8.2相對表達量分別為0.32±0.01、1.50±0.04、2.35±0.24、1.21±0.15，SK-Hep1表達與其他三者比較，P均<0.05。

2.2 RP11-769O8.2表達與HCC臨床病理參數(shù)的關系 結果見表1。由表1可知，RP11-769O8.2表達與HCC肝硬化程度相關(P<0.05)。

2.3 RP11-769O8.2編碼能力及靶基因 Coding Potential Calculator Online在線數(shù)據(jù)庫顯示RP11-769O8.2的編碼能力評分為-1.28，提示蛋白質編碼能力弱，而作為編碼RNA陽性對照的TP53 mRNA和GAPDH mRNA的編碼能力評分分別為8.25和2.24，均遠大于RP11-769O8.2。UCSC數(shù)據(jù)庫檢測顯示，RP11-769O8.2是編碼YES1的剪切體，由兩段外顯子序列轉錄組成，位于YES1反義鏈，YES1 mRNA可能有轉錄激活與表達調控方式，因此將YES1選為RP11-769O8.2的靶基因。

表1 RP11-769O8.2表達與HCC患者臨床病理參數(shù)的關系

2.4 HCC組織、細胞系中YES1表達比較 HCC、癌旁組織中YES1表達量分別為13.22±2.04、11.72±2.36，兩者比較，P<0.05。SK-Hep1、Huh7、HepG2、97L細胞系中YES1相對表達量分別為0.48±0.23、1.82±0.62、2.56±1.04、1.86±0.79，L-02與其他三者比較，P均>0.05。

2.5 RP11-769O8.2與YES1的相關分析結果 HCC組織中RP11-769O8.2、YES1的相對表達量分別為1.5±1.5、2.35±1.49；以RP11-769O8.2在HCC組織與癌旁組織中的相對表達量為X軸，以YES1在HCC組織與癌旁組織中的相對表達量Y軸，制作散點圖，判斷RP11-769O8.2與YES1的相關趨勢，線性相關分析得到Pearson相關系數(shù)為0.597，P<0.05，顯示RP11-769O8.2與YES1的表達量呈正相關。

3 討論

原發(fā)性HCC，是由肝細胞或肝內膽管上皮細胞發(fā)生的癌腫，是我國常見惡性腫瘤之一，是一種死亡率較高的腫瘤疾病，男性中發(fā)病率高于女性。HCC組織細胞學分類較多，其中SK-Hep1為肝/腹水細胞癌細胞系；HepG2細胞系于1979年，從阿根廷一名15歲高加索男孩的原發(fā)性肝胚細胞瘤中分離出并建立，該細胞系呈上皮樣，貼壁抱團生長；Huh7細胞系于1982年從一名患有HCC的57歲日本男性HCC組織標本上培養(yǎng)而得。該細胞AFP陽性，高度分化，細胞呈上皮樣，貼壁生長；97L細胞系由上海醫(yī)科大學中山醫(yī)院建立，將一名我國39歲男性HCC患者的肝右葉轉移病灶的手術切除標本接種于裸鼠肝內建造出人HCC裸鼠轉移模型而得。

lncRNA數(shù)量比較多，大約是mRNA的3～100倍，這些類似mRNA的轉錄本在各種基因調控水平和胚胎發(fā)育等生物學過程中發(fā)揮作用。越來越多的證據(jù)也表明，異常表達的lncRNA在多種疾病狀態(tài)中發(fā)揮重要作用，如癌癥。這些RNA盡管在十幾年前就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，但只有少數(shù)分子的功能得到鑒定，仍有很大的研究空間。而RP11-769O8.2是新發(fā)現(xiàn)的一種lncRNA，其對HCC的作用及機制目前國內外尚未見相關報道。RP11-769O8.2是編碼YES1蛋白的剪切體，由兩段外顯子序列轉錄組成，位于YES1的反義鏈上。本研究顯示，HCC組織中RP11-769O8.2的相對表達量低于癌旁組織，SK-Hep1 RP11-769O8.2的相對表達量低于Huh7、HepG2、97L，RP11-769O8.2表達水平的降低與患者肝硬化程度有關。提示RP11-769O8.2表達水平可能與HCC的發(fā)生發(fā)展有密切聯(lián)系。

Coding Potential Calculator Online在線數(shù)據(jù)庫評估RP11-769O8.2編碼能力得分為-1.28，提示蛋白質編碼能力弱，其評分遠遠小于作為編碼RNA陽性對照的TP53 mRNA編碼能力評分8.25及GAPDH mRNA 2.24。cis調控就是指非編碼RNA對臨近mRNA的一種轉錄激活與表達調控方式。研究發(fā)現(xiàn)，基因調控可能以順式(cis)或反式(trans)作用形式發(fā)生。其中cis調控主要依賴順式作用元件進行，順式作用元件是指存在于基因旁側序列中能影響基因表達的序列，包括啟動子、增強子、調控序列和可誘導元件等，它們的作用是參與核內基因表達的調控，順式作用元件通常轉錄為非編碼RNA，如lncRNA[13]。通過生物信息學預測發(fā)現(xiàn)，RP11-769O8.2位于YES1反義鏈上，可能通過cis調控機制影響YES1的表達，進而在癌癥中發(fā)揮作用。YES1作為可以調節(jié)細胞增殖、黏附和分化的關鍵因子，是Src家族激酶中的一員。YES1在許多腫瘤中均有較高的表達水平[14]，已被認為是許多癌癥的潛在治療目標，包括黑色素瘤、乳腺癌和橫紋肌肉瘤等[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，與L-02比較，YES1在SK-Hep1中表達水平最低，而在Huh7、97L中的表達水平相近，在HepG2中的表達水平最高，L-02表達與HCC各細胞系比較均無顯著性差異；而YES1在HCC組織中的表達明顯低于癌旁組織。相關性分析顯示,RP11-769O8.2及其靶基因YES1呈正相關性。提示YES1可能是RP11-769O8.2的作用靶點，且與HCC的發(fā)生發(fā)展有密切關系。

總之，RP11-769O8.2在HCC組織標本中低表達，與患者的肝硬化程度相關，編碼能力弱；且RP11-769O8.2的表達與YES1的表達呈正相關，可能是潛在的HCC預后預測分子標志物。但由于樣本量不大，且缺乏進一步的分子生物學及實驗室數(shù)據(jù)，關于RP11-769O8.2在HCC中的具體作用及分子機制尚需更加深入研究。