基于超高效液相色譜指紋圖譜和主成分分析法評價不同主產(chǎn)地半枝蓮的質(zhì)量＊

楊敏娟，羅宇琴，官永河，朱德全

（廣東一方制藥有限公司 佛山 528244）

半枝蓮為唇形科植物半枝蓮Scutellaria barbataD.Don的干燥全草。其性寒，味辛、苦，具有清熱解毒，化瘀利尿的功能，臨床主要用于疔瘡腫毒，咽喉腫痛，跌撲傷痛，水腫，黃疸，蛇蟲咬傷等[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明，半枝蓮具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、增強(qiáng)免疫等生物活性[2]。半枝蓮含有多種化學(xué)成分，主要成分為黃酮類化合物（Flavonoids）和二萜類化合物（Diterpenoids），還有生物堿（Alkaloids）、甾體（Steroids）、多糖（Polysaccharids）等成分[3]。

文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，半枝蓮指紋圖譜研究不多，主要涉及HPLC 及GC 等方法。如張同波[4]建立了12 份不同產(chǎn)地的半枝蓮藥材的HPLC 指紋圖譜，可能由于受產(chǎn)地、氣候和生態(tài)環(huán)境等影響，不同產(chǎn)地的半枝蓮藥材所含成分產(chǎn)生較大的差異。林敬明等[5]建立半枝蓮單味藥材的HPLC 鑒定方法。對10 份不同批次的半枝蓮藥材指紋圖譜進(jìn)行解析，確定了16 個共有峰，對不同批次半枝蓮樣品HPLC 指紋圖進(jìn)行相似度分析，結(jié)果顯示所有樣品與對照指紋圖譜相似度均在0.88以上。王慧彬等[6]采用Discovery-C18 柱（4.6 mm ×250 mm，5 μm），以甲醇-0.05%甲酸溶液為流動相進(jìn)行梯度洗脫，建立半枝蓮的HPLC 指紋圖譜的方法。通過對10 批不同產(chǎn)地半枝蓮藥材的研究建立了半枝蓮藥材的指紋圖譜，其中確定13 個色譜峰為共有峰。10 批藥材的相似度在0.985-0.744 之間。該方法提取簡單，具有很好的穩(wěn)定性、重復(fù)性和可行性。趙偉偉等[7]采用Agilent ZORBAX SB-C18 色譜柱（4.6 mm ×250 mm,5 μm），以乙腈-0.2%磷酸溶液為流動相，建立了不同產(chǎn)地半枝蓮藥材的指紋圖譜。該方法精密度、重現(xiàn)性以及穩(wěn)定性良好。以野黃芩苷作為對照峰，確定了13個特征峰為其共有峰。采用中藥色譜指紋圖譜相似度軟件進(jìn)行測評，8 份藥材的相似度介于0.953～0.768。主成分分析獲得2 個主要成分，累積貢獻(xiàn)率可達(dá)80.347%。應(yīng)用指紋圖譜并結(jié)合主成分分析，能夠準(zhǔn)確的評價半枝蓮藥材的質(zhì)量。陳香愛等[8]采用反相高效液相色譜法，以甲醇-乙腈-0.05%磷酸溶液進(jìn)行梯度洗脫，建立了30批不同來源半枝蓮藥材的HPLC-UV 指紋圖譜，確定了14 個共有峰，并對30批半枝蓮及其混淆品的進(jìn)行了相似度分析。24 批半枝蓮藥材的相似度均在0.7 以上，6 批混淆品均在0.4以下。該HPLC 指紋圖譜鑒別方法具有重復(fù)性好、特征性強(qiáng)、方法簡便等特點，可作為半枝蓮及其混淆品藥材的鑒別方法。潘瑞景等[9]采用氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用技術(shù)，結(jié)合化學(xué)計量學(xué)直觀推導(dǎo)式演進(jìn)特征投影法（HELP）和相似度分析（SA），對不同產(chǎn)地半枝蓮及其混淆品白花蛇舌草和半邊蓮揮發(fā)性成分的指紋圖譜進(jìn)行了研究。分別從半枝蓮、白花蛇舌草以及半邊蓮中定性定量出52、38、38 種化合物。其中半枝蓮和白花蛇舌草的共有峰48個，半枝蓮與半邊蓮的共有峰52 個。保留時間和每組分峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別小于0.2%和6.1%。相似度計算結(jié)果顯示9 個不同產(chǎn)地的半枝蓮的相關(guān)系數(shù)均在0.766 0 以上，而混淆品的相關(guān)系數(shù)分別為0.419 9和0.405 9，可以有效的判別半枝蓮及其混淆品。

文獻(xiàn)記載半枝蓮主產(chǎn)河北，山東，陜西、河南，江蘇，浙江，臺灣，福建，江西，湖北，湖南，廣東，廣西，四川，貴州，云南等省區(qū)[10]。90 年代以前，半枝蓮以野生為主，90年代初期，開始試種并栽培成功，逐步在各地發(fā)展種植。從“康美中藥網(wǎng)”、“中藥材天地網(wǎng)”、“藥通網(wǎng)”可以查詢到，截止2017 年12 月22 日，目前產(chǎn)量比較大的，供應(yīng)全國的半枝蓮主產(chǎn)地有8個，分別分布在河南省駐馬店市、河南省信陽市、湖南省邵陽市、安徽省阜陽市、四川省成都市雙流縣以及山東省濟(jì)寧市，以上產(chǎn)地總產(chǎn)量占全國總產(chǎn)量的80%以上。

中藥指紋圖譜在一定分析技術(shù)的基礎(chǔ)上，獲得可以標(biāo)示中藥材的共有峰的色譜圖[11]，具有整體性、模糊性和量化性的特點，能夠全面體現(xiàn)中藥材質(zhì)量，已成為鑒別真?zhèn)?、控制質(zhì)量的重要方法[12]。主成分分析法是一種降維的統(tǒng)計方法[13]，依據(jù)貢獻(xiàn)率大?。ā?5%）用具有代表性的因子代替多個原始變量。近年來已被廣泛應(yīng)用于中藥，尤其是指紋圖譜上[14-17]，是一種獨(dú)具特色的多指標(biāo)評價技術(shù)。本項目組深入產(chǎn)地，就地取材，收集了三大主產(chǎn)地的26 批半枝蓮，系統(tǒng)地對其指紋圖譜進(jìn)行研究，并結(jié)合主成分分析法，綜合評價不同產(chǎn)地的半枝蓮藥材。

1 儀器與試藥

表1 26批半枝蓮藥材信息

1.1 儀器

Vanquish 超高效液相色譜儀（賽默飛世爾科技有限公司），ACQUITY UPLC H-Class 型超高效液相色譜儀（沃特斯公司）；ACQUITY UPLC I-Class 超高效液相飛行時間高分辨質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)（Waters Corporation,Milford,MA,USA），數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)為MarkerLynx 4.1 工作站（Waters,Manchester,U.K.），Acclaim C18色譜柱（2.1 mm × 100 mm，2.2 μm），萬分之一天平（梅特勒-托利多公司），百萬分之一天平（梅特勒-托利多公司），電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司）。

1.2 試劑與試藥

芹菜素-7-O-葡萄糖苷（純度大于98%，四川省維克奇生物科技有限公司，批號：wkq17072708）；野黃芩素（純度大于98%，四川省維克奇生物科技有限公司，wkq17072710）；芹菜素（純度大于98%，四川省維克奇生物科技有限公司，wkq17032405）；野黃芩苷（純度91.3%，中國食品藥品檢定研究院，批號：110842-201508）；半枝蓮對照藥材（中國食品藥品檢定研究院，批號：121293-201404）；石油醚、甲醇、乙醇（分析純）；甲酸、磷酸、甲醇（色譜級）；水為超純水（實驗室自制）；26批半枝蓮藥材信息詳見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Acclaim C18色譜柱（2.1 mm × 100 mm，2.2 μm）；進(jìn)樣量為1 μl；柱溫為30℃；檢測波長為335 nm；流速為0.4 mL·min-1；以甲醇（A）-0.2%磷酸溶液（B）為流動相進(jìn)行梯度洗脫，梯度為0-3 min，25%→29%A；3-10 min，29%→34%A；10-16 min，34%A；16-20 min，34%→42%A；20-28 min，42%A；28-35 min，42%→75%A。

2.2 質(zhì)譜條件

氮?dú)庾鳛橘|(zhì)譜離子源的霧化、錐孔氣；電噴霧電離正離子模式；毛細(xì)管電壓：3.0 KV；錐孔電壓：35 V；離子源溫度：100℃；脫溶劑氣溫度：300℃；脫溶劑氣流速：800 L·h-1；掃描時間：0.5 s；掃描時間間隔：0.02 s；質(zhì)荷比范圍：50-1 500；數(shù)據(jù)采集模式：centroid；以甲酸鈉溶液校正質(zhì)量軸，以亮氨酸腦啡肽（Leucineenkephalin）為內(nèi)標(biāo)校正質(zhì)量精度，LockSprayTM 流速5 μL·min-1。

2.3 溶液制備

2.3.1 參照物溶液的制備

精密稱取野黃芩苷對照品、芹菜素-7-O-葡萄糖苷對照品、野黃芩素對照品和芹菜素對照品適量，加甲醇溶解，制成質(zhì)量濃度分別約為100 μg·mL-1的混合溶液，過0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.3.2 供試品溶液的制備

取半枝蓮藥材粉末（過四號篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，稱定重量，回流30 min，放冷，再稱定重量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 指紋圖譜方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗

取S1 樣品，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，考察共有峰的相對保留時間和相對峰面積的一致性。結(jié)果顯示，各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD 均小于3.0%，該儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗

取S1 樣品，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下的色譜條件分別在0，2，4，8，12，16，20，24小時測定，考察共有峰的相對保留時間和相對峰面積的穩(wěn)定性，顯示，各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3.0%，該供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.3 重復(fù)性試驗

取S1 樣品，按“2.3.2”項下方法制備6 份供試品溶液，按“2.1”項下的色譜條件分析，考察共有峰的相對保留時間和相對峰面積的一致性，結(jié)果顯示，各共有峰的相對保留時間和相對峰面積RSD均小于2.0%，該方法重復(fù)性良好。

2.5 色譜峰的指認(rèn)

圖1 半枝蓮樣品色譜峰的指認(rèn)

取S1 樣品約0.1 g，流動相為甲醇（A）-0.2%甲酸溶液（B），其他同“2.3”、“2.1”和“2.2”項下的條件。通過比對化合物的色譜峰保留行為、精確分子量以及對照品，半枝蓮樣品UPLC指紋圖譜中4個色譜峰得到明確的指認(rèn)，分別為野黃芩苷（峰3）、芹菜素-7-O-葡萄糖苷（峰5）、野黃芩素（峰9）和芹菜素（峰11），如圖1所示；各色譜峰的峰號、保留時間、名稱、CAS 號、分子式和結(jié)構(gòu)式見表2。

2.6 指紋圖譜的建立和相似度評價

按“2.3.2”項下方法制備26 批半枝蓮藥材供試品溶液，按“2.1”項下的色譜條件測定，對所得到的指紋圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果見表3；將結(jié)果導(dǎo)入國家藥典委員會推薦的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004A 版）”，以S1 樣品的圖譜作為相似度計算校正的參照譜，時間窗寬度設(shè)為0.10 s，建立共有模式和指紋圖譜疊加圖，并計算各批次與對照指紋圖譜的相似度，結(jié)果見圖2、3 和表4。結(jié)果表明，確定26 批半枝蓮樣品中有11 個共有峰，所有指紋峰的相對保留時間RSD 均小于2.0%，相對峰面積RSD 范圍為31.0%-118.5%，說明3 個產(chǎn)地半枝蓮各成分含量存在一定差異；26 批半枝蓮藥材的相似度范圍為0.871-0.999，不同產(chǎn)地半枝蓮中的各成分和比例較有一定的差異。

2.7 主成分分析

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件對26 批半枝蓮藥材共有峰的峰面積進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，存為變量并作主成分分析，計算其主成分特征值累積貢獻(xiàn)率、初始因子載荷矩陣及綜合得分。

相關(guān)系數(shù)的特征值和方差貢獻(xiàn)率見表5，初始因子載荷矩陣見表6。由表5、6 可知，第1 主成分的特征根為6.328，累計貢獻(xiàn)率為57.528%，野黃芩苷、芹菜素-7-O-葡糖糖苷、成分1、4、6、7、8 及10 在第1 主成分上有較高載荷，說明第1 主成分主要反映了以上8個成分的信息；第2 主成分特征根為1.833%，累計貢獻(xiàn)率為16.662%，主要反映了野黃芩素和芹菜素的信息。以主成分為變量得到得分圖4，由圖可知，距離原點較遠(yuǎn)的幾個點就是主成分1 和2 中權(quán)重值大的成分，其在決定產(chǎn)地差異上具重大作用。

圖2 半枝蓮藥材的UPLC共有模式圖

表2 指認(rèn)峰的相關(guān)信息

圖3 26批半枝蓮UPLC指紋圖譜疊加圖

表3 半枝蓮藥材指紋圖譜共有峰相對保留時間和相對峰面積

表4 不同產(chǎn)地半枝蓮相似度評價結(jié)果

表5 特征值和方差貢獻(xiàn)率

表6 初始因子載荷矩陣

用3 個主成分計算半枝蓮藥材綜合得分，結(jié)果如表7 所示。整體來看，產(chǎn)自河南的半枝蓮材質(zhì)量相對較優(yōu)；產(chǎn)自安徽產(chǎn)地的半枝蓮藥材綜合得分排名靠后；產(chǎn)自四川產(chǎn)地的半枝蓮排名波動較大，這可能是半枝蓮實際情況，質(zhì)量差異大，也可能因為采樣區(qū)域性問題，批次較少，缺乏代表性。

圖4 不同產(chǎn)地半枝蓮的載荷圖

表7 26批半枝蓮樣品的綜合得分排序

3 討論

通過單因素分析，本研究考察了提取溶媒、提取方式及提取時間對半枝蓮指紋圖譜的影響；考察了半枝蓮最佳吸收波長和流動相，確認(rèn)了半枝蓮藥材UPLC指紋圖譜的供試品處理方法以及最佳色譜條件。

本研究應(yīng)用質(zhì)譜共指認(rèn)了4 個共有峰，它們分別是野黃芩苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、野黃芩素及芹菜素。根據(jù)質(zhì)譜信息，并結(jié)合文獻(xiàn)，確定保留時間為25.236 min的色譜峰為木犀草素，推測峰4（保留時間：13.369 min）可能為黃芩素的同分異構(gòu)體[18]；峰10（保留時間為22.974 min）可能為互為同分異構(gòu)體的異野黃芩素-8-O-葡萄糖苷、5,8,2'-三羥基-7-O-葡萄糖醛酸黃酮苷或異高山黃芩素-8-O-β-D-葡萄糖苷[19,20]。

從指紋圖譜建立的過程中可知，不同產(chǎn)地同一色譜峰的峰高差異較大，這可能與半枝蓮的生長環(huán)境、地理環(huán)境等多種因素有關(guān)。因此，選擇最適宜生長條件是建立半枝蓮藥材的基地，控制藥材質(zhì)量的穩(wěn)定性，生產(chǎn)出高質(zhì)量中藥材的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。