響應(yīng)曲面法優(yōu)化米炒黨參炮制工藝研究＊

呂辰子，何美菁，王 勃，孟祥龍，2，劉麗婷，張朔生＊＊

（1.山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 晉中 030619；2.東國大學(xué)東方醫(yī)學(xué)院 慶州 38066）

黨參為桔?？泣h參屬植物黨參Codonopsis pilosula(Franch.) Nannf.、素花黨 參Codonopsis pilosulaNannf.var.Modesta(Nannf.) L.T.Shen 或川黨參Codonopsis tangshenOliv.的干燥根，秋季釆挖，洗凈，曬干[1]。黨參為我國傳統(tǒng)補(bǔ)益藥，應(yīng)用廣泛。據(jù)現(xiàn)代藥理研究表明[2]，黨參具有調(diào)節(jié)血糖、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、促進(jìn)造血機(jī)能、抗缺氧、抗應(yīng)激、耐疲勞、延緩衰老、調(diào)節(jié)胃收縮等多種作用，目前已被國家衛(wèi)計委列入藥食兩用品種名單。米炒是指將凈制或切制后的飲片與大米共同拌炒的方法。大米性甘味平，具有補(bǔ)中益氣、調(diào)理脾胃、止渴、止瀉痢的作用[3]，黨參經(jīng)米炒之后，氣變清香，可以增強(qiáng)其健脾止瀉的作用[4,5]，用于脾胃虛弱，食少，便溏。黨參炔苷是黨參中的主要活性成分，有抗癌、抗菌、抗炎、鎮(zhèn)靜降壓作用，還能調(diào)節(jié)前列腺代謝，可作為黨參研究的指標(biāo)性成分[6,7]。本試驗以黨參炔苷含量為評價指標(biāo)，采用HPLC 測定方法和響應(yīng)曲面試驗法優(yōu)化米炒黨參工藝參數(shù)，為今后規(guī)范黨參炮制工藝、制訂合理的飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 器材

1.1 實驗儀器

CZB1002 電子秤（諸暨市超澤街器設(shè)備有限公司），電磁爐（江門市威多福電器有限公司），萬能高速粉碎機(jī)RRHP-100 型，EX125ZH 分析天平（奧豪斯儀器有限公司），超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司），SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵，HH-2 型電熱恒溫水浴鍋，U-3 000 型高效液相色譜儀（美國Thrmo Fisher Scientific公司）

1.2 實驗試劑及藥材

大米，黨參飲片，經(jīng)山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院張朔生教授鑒定為生黨參飲片正品，黨參炔苷對照品（上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司，純度≥98%（批號4623），甲醇為分析純（天津市科密歐），乙腈為色譜純。

2 實驗方法與結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液及樣品的制備

2.1.1 米炒黨參樣品制備

將大米置熱的炒藥鍋內(nèi)，用中火加熱至米冒煙時，投入黨參片拌炒，至黨參呈黃色時取出，篩去米，放涼，打粉，過藥典4號篩即可。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

取黨參炔苷對照品5 mg，精密稱定，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解、定容，0.45 μm 微孔濾膜濾過，得濃度為0.5 mg·mL-1，得-1的黨參炔苷對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備

取米炒黨參粉末2 g，置100 mL 錐形瓶中，加甲醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲1 h 后，取出，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，濾過。取25 mL 水浴蒸干，再用甲醇溶解，定容至10 mL，0.45 μm 微孔濾膜濾過，制得供試品溶液備用。

2.1.4 含量測定色譜條件

Uetimate3 000 系列高效液相色譜儀，配DAD-3 000(RS)檢測器，反相高效液相色譜法，Thermo Hypersil GOLD（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱；流動相為乙腈—水（28∶72）；流速1 mL·min-1；檢測波長270 nm；柱溫25℃；進(jìn)樣量為10 μL；黨參炔苷在267 nm 處有最大吸收值，因此選擇267 nm 作為檢測波長[6]。

對照品及樣品色譜圖（圖1，圖2）。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線性范圍考察

取黨參炔苷對照品適量，精密稱定，置于25 mL容量瓶定容，制得濃度為0.5 mg·mL-1定容-1的黨參炔苷對照品溶液，作為備用液。分別取對照品溶液1，2，3，4，6 mL于10 mL容量瓶中，甲醇定容，分別制成濃度為0.05 mg·mL-1，0.1 mg·mL-1，0.15 mg·mL-1，0.2 mg·mL-1，0.3 mg·mL-1的對照品溶液，進(jìn)樣量為10 μL，以峰面積對進(jìn)樣濃度進(jìn)行回歸，得到回歸方程：y=168.93x+8.821 3（R2=0.999 4），表示黨參炔苷在0.05-0.3 mg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.2 精密度實驗

取黨參炔苷對照品儲備液連續(xù)進(jìn)樣6 次，每次10 μL，計算黨參炔苷峰面積，得到RSD 為0.91%，證明其精密度較好，結(jié)果見表1。

2.2.3 穩(wěn)定性實驗

取炮制后的黨參粉末2 g，精密稱定，按照“2.1.3”項下制備供試品溶液的方法制備，分別于配置后0，1，2，4，6，8，10 h 進(jìn)樣，測定峰面積，求RSD，評定其穩(wěn)定性。得到其RSD 為0.71%，證明在10 h 內(nèi)其穩(wěn)定性良好（表2）。

表1 精密度實驗

表2 穩(wěn)定性試驗

圖1 黨參炔苷對照品高效液相色譜圖

圖2 黨參供試品高效液相色譜圖

2.2.4 重復(fù)性實驗

精密稱取炮制后黨參粉末6 份，每份約2 g，按照“2.1.3”項下制備供試品溶液的方法制備，測定黨參炔苷的平均含量，評定該分析方法的精密度。計算RSD為2.42%，表明其重復(fù)性良好（表3）。

2.2.5 加樣回收率實驗

取炮制后黨參粉碎，取6 份，每份1 g，按照上述樣品的制備方法制備好待測，每份中加入0.1mg·mL-1的黨參炔苷對照品溶液各1 mL，回收率（%）=（測得總量-供試品中所含被測成分量）/加入的對照品的量×100%。測得加樣回收率為97.4%，RSD為0.91%（表4）。

表3 重復(fù)性實驗

表4 加樣回收實驗

圖3 不同溫度下炮制對黨參炔苷含量的影響

圖4 在不同的炮制時間下對于黨參炔含量的影響

圖5 米與黨參不同配比對于黨參炔苷含量的影響

表6 Box-behnken設(shè)計實驗

3 實驗內(nèi)容

3.1 單因素實驗

3.1.1 炮制溫度的考察

圖6 米炒黨參炮制溫度與炮制時間對黨參炔苷含量的影響

圖7 米炒黨參炮制溫度和輔料與藥物之比對黨參炔苷含量的影響

選擇炮制時間為3 min，黨參與米量之比為2∶1，將溫度設(shè)置為60℃、100℃、130℃、160℃、180℃、210℃，考察溫度變化對黨參炔苷含量的影響，測定結(jié)果如圖3，得到最佳炮制溫度為180℃。

3.1.2 炮制時間的考察

選擇炮制溫度180℃，黨參與米量之比為2∶1，設(shè)置炮制時間為1 min、2 min、4 min、6 min，考察炮制時間對于黨參炔苷含量的影響，測定結(jié)果如圖4，得到最佳的炮制時間為2 min。

3.1.3 輔料與飲片質(zhì)量之比的考察

選擇炮制溫度為180℃，炮制時間為2 min，選擇輔料與黨參的比例為1∶10、2∶10、6∶10、10∶10，考察比例關(guān)系對黨參中黨參炔苷含量的影響，測定結(jié)果見圖5，得到最佳的物料比為6∶10。

3.2 響應(yīng)曲面實驗

根據(jù)米炒黨參單因素實驗的結(jié)果，得到較好的單因素：炮制溫度為180℃、炮制時間為2 min、輔料與黨參的比例為6∶10。以此設(shè)定因素水平表如下（表5，表6）。

由Design-Export 8.0.6 軟件分析處理得到的相應(yīng)曲面（圖6，圖7，圖8）：

3.3 實驗分析

由三維的立體模型圖以及實驗結(jié)果得到的相應(yīng)的二次方程模型：黨參炔苷含量=0.32+0.015A-0.050 B -4.138 × 10-3C+0.010AB -7.025 × 10-3AC +0.037BC-0.081A2-0.11 B2-0.056C2。R值為0.9556，說明該模型能解釋95.56%響應(yīng)值的變化，因而該模型的擬合程度比較好，試驗誤差小，可以用此模型進(jìn)行分析和預(yù)測。

由方程及回歸分析可以得到，B 因素即炮制時間對于黨參炔苷含量的影響較為顯著，由表7 可得各因素對于黨參炔苷含量影響的順序：炮制時間二次項＞炮制溫度二次項＞炮制時間一次項＞輔料與藥物之比二次項＞炮制時間、輔料與藥物之比雙因素＞炮制溫度的一次項＞輔料與藥物之比、炮制溫度的雙因素＞炮制時間與炮制溫度的雙因素影響＞炮制物料比一次項的影響。

3.4 實驗結(jié)果

黨參炔苷在最中心處所對應(yīng)的條件下含量最高，由Design-Export 8.0.6 優(yōu)化處理的到最佳米炒黨參炮制工藝參數(shù)為：炮制溫度為182.77℃、炮制時間為1.76 min、輔料與藥物的比例為55∶100，預(yù)測黨參炔苷的含量值為0.328 1 mg·mL-1（圖6，圖7，圖8）。

圖8 米炒黨參炮制時間和輔料與藥物之比對黨參炔苷含量的影響

表7 回歸分析結(jié)果

表8 米炒黨參驗證實驗

3.5 驗證實驗

在最佳的炮制工藝條件下進(jìn)行三組平行實驗，對該炮制工藝進(jìn)行驗證（表8）

采用實驗得到的最佳條件設(shè)計實驗，米炒黨參測定得到黨參炔苷含量為0.326 3 mg·g-1，與預(yù)測值相接近，說明利用響應(yīng)曲面法對炮制工藝擬合效果好。

4 討論

規(guī)范中藥飲片及其炮制品生產(chǎn)工藝，制定相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是中藥可持續(xù)發(fā)展的基礎(chǔ)。黨參炔苷作為黨參標(biāo)志性成分，收錄于2015版《中華人民共和國藥典》中黨參鑒別項下。本實驗運(yùn)用響應(yīng)曲面法考察了米炒黨參的炮制溫度、炮制時間、輔料與藥材之比對黨參炔苷含量的影響，進(jìn)而對米炒黨參的炮制工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳炮制工藝。傳統(tǒng)的工藝優(yōu)化通常采用正交試驗設(shè)計，響應(yīng)曲面法與之相比雖然試驗次數(shù)相對較多，但它能把因素與響應(yīng)值的相互關(guān)系函數(shù)化，建立連續(xù)變量曲面模型，考察的因素不局限于所設(shè)計的水平，能更直觀、精確地得到最優(yōu)組合條件，能更好的反應(yīng)各因素之間的相互作用。

目前有研究表明[8,9]，黨參米炒后5-羥甲基糠醛（5-HMF）含量增加，并能調(diào)控胃腸平滑肌興奮性收縮。黨參多糖與阿魏酸等有機(jī)酸共同加熱是生成5-HMF 的主要途徑。在本試驗基礎(chǔ)上可以繼續(xù)藥理試驗，結(jié)合黨參米炒前后黨參炔苷和5-HMF 含量變化，以及相關(guān)藥理試驗指標(biāo)，為進(jìn)一步闡釋米炒黨參炮制機(jī)理提供借鑒。