RhoA激酶信號通路介導(dǎo)的自噬障礙在2型糖尿病大鼠心肌纖維化中的作用

黃柳，賈妍，郭炳彥，劉素云，李擁軍

2型糖尿?。═2DM）是一種最常見的糖尿病，約占90%以上[1]。糖尿病心肌?。―CM）是T2DM的一種慢性并發(fā)癥，臨床主要表現(xiàn)為心功能異常，最終可發(fā)展為心力衰竭、心源性休克甚至死亡，其發(fā)病機(jī)制目前尚不明確[2]。自噬是一種細(xì)胞應(yīng)激和自我防御的機(jī)制，可以與溶酶體融合為自噬溶酶體，降解細(xì)胞內(nèi)退化的細(xì)胞器、異常蛋白質(zhì)等結(jié)構(gòu)，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[3]。近年來研究顯示[4]，自噬參與了T2DM患者的心肌細(xì)胞代謝紊亂、心肌纖維化等病理生理過程，與DCM的發(fā)生密切相關(guān)。Rho激酶（ROCK）是RhoA下游重要的效應(yīng)分子，在細(xì)胞自噬過程中發(fā)揮極為重要的作用[5]。研究發(fā)現(xiàn)[6]，RhoA的異常表達(dá)可導(dǎo)致心血管重塑、心力衰竭，在DCM的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，但其作用具體機(jī)制尚不清楚。本研究探討RhoA激酶信號通路介導(dǎo)的自噬障礙在糖尿病心肌纖維化中的作用，旨在為臨床診治DCM的治療和預(yù)防提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與動物多功能酶標(biāo)檢測儀（iMark680）購自Bio-Rad公司；熒光顯微鏡購自日本Olympus公司；鹽酸法舒地爾注射液購自天津紅日藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H20040356；3-甲基腺嘌呤（3-MA）自噬抑制劑、0.2%膠原酶Ⅱ購自美國Sigma公司；RT-PCR檢測試劑盒購自上海恒斐生物科技有限公司；無支原體胎牛血清、DMEM培養(yǎng)液購自北京索萊寶科技有限公司；Ⅰ型前膠原（PCⅠ）和PCⅢ ELISA檢測試劑盒購自上海恒斐生物科技有限公司；Vimentin、肌球蛋白磷酸酶靶向蛋白1（M Y P T 1）、p-MYPT1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin 1、p62、UNC-51樣激酶1（ULK1）、p-ULK1單克隆抗體，均購于美國Santa Cruz公司；β-actin和辣根過氧化酶標(biāo)記羊抗兔IgG，購于DAKO公司。

SPF級SD雄性大鼠60只，體重均為180～200 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，動物許可證號SCXK（京）2015-0001，飼養(yǎng)于本院動物中心實(shí)驗(yàn)室，保持室溫恒定為25℃，模擬晝夜，自由攝食與飲水。

1.2 動物造模及給藥60只大鼠預(yù)飼養(yǎng)一周后，將其隨機(jī)分為對照組、模型組、法舒地爾組、3-MA組和法舒地爾+3-MA組各12只。除對照組外，所有大鼠均采用高脂飲食法聯(lián)合小劑量鏈脲佐菌素誘導(dǎo)T2DM大鼠模型[7]，飼喂高脂高糖飼料，連續(xù)喂養(yǎng)4周后，對DM組大鼠進(jìn)行單次腹腔注射STZ（40 mg/kg），對照組大鼠飼喂普通飼料，注射等體積枸櫞酸鹽緩沖液，若72 h后造模大鼠血糖≥16.7 mmol/L，說明建模成功，造模過程中共2只大鼠死亡[6]。造模后，法舒地爾組和法舒地爾+3-MA組大鼠腹腔注射法舒地爾（10 mg/kg/d，分兩次注射）；3-MA組和法舒地爾+3-MA組大鼠腹腔注射自噬抑制劑3-MA（15 mg/kg/d），法舒地爾+3-MA組兩次注射時間間隔1 h；模型組和對照組注射等體積生理鹽水，連續(xù)4周。治療后處死大鼠，取大鼠心臟，稱重并計(jì)算心臟肥厚指數(shù)，將左心室組織進(jìn)行光鏡觀察。

1.3 HE染色觀察大鼠心肌組織病理學(xué)取大鼠左心室組織，采用4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水、透明、包埋和切片及HE染色，在光鏡下觀察組織的病理變化，每張切片隨機(jī)取5個視野拍照。

1.4 RT-PCR檢測大鼠心肌組織ROCK1、ROCK2、PCⅠ、PCⅢ mRNA的表達(dá)取大鼠左心室組織，勻漿，采用Trziol裂解液提取總RNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)確定其濃度，采用RT-PCR進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，參考已有文獻(xiàn)，設(shè)計(jì)引物、反應(yīng)條件、反應(yīng)體系。進(jìn)行RT-PCR，以GAPDH為內(nèi)參，進(jìn)行半定量分析。

1.5 Western Blot檢測心肌組織MYPT1、p-MYPT1、LC3-I、 LC3-Ⅱ、Beclin 1、p62、p-ULK1、ULK1的表達(dá)取大鼠左心室組織，勻漿，使用細(xì)胞裂解提取總蛋白，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量，取50 ng總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，電轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，室溫密封2 h，采用洗膜緩沖液洗膜并加一抗4℃孵育過夜，洗膜加二抗室溫孵育2 h。再用ECL化學(xué)發(fā)光顯示，收集影像，選用β-actin作為內(nèi)參，采用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析對比條帶強(qiáng)弱。

1.6 大鼠心肌成纖維細(xì)胞的分離與鑒定參考已有文獻(xiàn)進(jìn)行大鼠心肌成纖維細(xì)胞分離與鑒定[8]。取大鼠左心室組織，采用0.2%膠原酶Ⅱ反復(fù)吹打混勻，于37℃、200 r/min的搖床上消化60 min，加入等體積含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液終止，離心（1000 rpm，5 min），棄上清，重復(fù)3次，加10 ml含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱差速貼壁60～90 min，貼壁的細(xì)胞為心肌成纖維細(xì)胞，每隔1 d換液。取2代的心肌原代成纖維細(xì)胞以105個接種于放有無菌蓋玻片的6孔板，4%多聚甲醛固定30 min，加入0.2% TritonX-100室溫封閉20 min，200 μl非免疫動物血清室溫封閉30 min，滴加兔抗大鼠Vimentin一抗（1：100稀釋），4℃過夜，然后 TRITC標(biāo)記的二抗 200 μl（1：100稀釋），避光孵育1.5 h，DAPI染核后甘油封片，在熒光顯微鏡下觀察。

1.7 MTT法檢測大鼠心肌成纖維細(xì)胞的增殖取原代培養(yǎng)的原代成纖維細(xì)胞，采用常規(guī)胰酶消化，制成細(xì)胞懸液，調(diào)整濃度為2.0×104個/ml，每孔加入100 μl，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于0 h、24 h、48 h和72 h進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測，每孔加入20 μl MTT溶液（5 mg/ml），培養(yǎng)4 h，采用酶標(biāo)儀檢測波長為490 nm處各孔的吸光度值。

1.8 大鼠心肌成纖維細(xì)胞內(nèi)PCⅠ、PCⅢ含量取原代培養(yǎng)的心肌成纖維細(xì)胞，胰酶消化后，收集上清液，采用ELISA法測定心肌成纖維細(xì)胞培養(yǎng)PCⅠ和PCⅢ水平，嚴(yán)格按照說明書操作；采用RT-PCR檢測成纖維細(xì)胞內(nèi)PCⅠ和PCⅢ水平。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，對計(jì)量資料先行正態(tài)性檢驗(yàn)，各組均滿足正態(tài)性且兩組間方差齊，采用單因素方差分析比較組間差異性，若組間比較有差異，采用SNK-q比較差異性，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心肌組織病理變化HE染色結(jié)果顯示，對照組大鼠心肌組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，排列整齊；模型組、3-MA組和法舒地爾+3-MA組大鼠心肌組織細(xì)胞排列紊亂，心肌纖維斷裂，伴隨大量炎性細(xì)胞浸潤；法舒地爾組大鼠心肌組織細(xì)胞較整齊，伴隨少量炎性細(xì)胞浸潤。與對照組相比，模型組大鼠心臟肥厚指數(shù)明顯增加（P＜0.05）；與模型組相比，法舒地爾組大鼠心臟肥厚指數(shù)明顯降低（P＜0.05）；與法舒地爾組相比，法舒地爾+3-MA組大鼠心臟肥厚指數(shù)明顯增加（P＜0.05）（圖1，表1）。

圖1 各組大鼠心肌組織病理變化（×200倍）

2.2 各組大鼠心肌組織ROCK1、ROCK2、PCⅠ和PCⅢ mRNA的表達(dá)與對照組相比，模型組大鼠心肌組織ROCK1、ROCK2、PCⅠ和PCⅢ mRNA的表達(dá)均明顯上調(diào)（P均＜0.05）；與模型組相比，法舒地爾組大鼠心肌組織ROCK1、ROCK2、PCⅠ和PCⅢ mRNA的表達(dá)均明顯下調(diào)（P均＜0.05），3-MA組大鼠心肌組織ROCK1、ROCK2、PCⅠ和PCⅢ mRNA的表達(dá)均明顯上調(diào)（P均＜0.05）；與法舒地爾組相比，法舒地爾+3-MA組大鼠心肌組織ROCK1、ROCK2、PCⅠ和PCⅢ mRNA的表達(dá)均明顯上調(diào)（P均＜0.05）（表2）。

2.3 各組大鼠心肌組織MYPT1、p-MYPT1、LC3-Ⅰ、 LC3-Ⅱ、Beclin 1、p62、p-ULK1蛋白的表達(dá)與對照組相比，模型組大鼠心肌組織p-MYPT1/MYPT1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin 1、p62、p-ULK1/ULK1的表達(dá)均明顯上調(diào)（P均＜0.05）；與模型組相比，法舒地爾組大鼠心肌組織p-MYPT1/MYPT1和p62的表達(dá)均明顯下調(diào)（P均＜0.05），LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin 1和p-ULK1/ULK1的表達(dá)均明顯上調(diào)（P均＜0.05），3-MA組大鼠心肌組織p-MYPT1/MYPT1的表達(dá)均明顯上調(diào)（P均＜0.05），LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin 1和p-ULK1/ULK1的表達(dá)均明顯下調(diào)（P均＜0.05）；與法舒地爾組相比，法舒地爾+3-MA組大鼠心肌組織p-MYPT1/MYPT1和p62的表達(dá)均明顯上調(diào)（P均＜0.05），LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin 1和p-ULK1/ULK1的表達(dá)均明顯下調(diào)（P＜0.05）（圖2，表3）。

2.4 各組大鼠心肌成纖維細(xì)胞的分離鑒定免疫熒光染色顯示，各組大鼠心肌成纖維細(xì)胞Vimentin抗原免疫熒光呈陽性反應(yīng)，表明實(shí)驗(yàn)分離細(xì)胞為高純度成纖維細(xì)胞（圖3）。

2.5 各組大鼠心肌成纖維細(xì)胞的增殖情況MTT結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組大鼠心肌成纖維細(xì)胞的增殖活性明顯增加（P＜0.05）；與模型組相比，法舒地爾組大鼠心肌成纖維細(xì)胞的增殖活性明顯降低（P＜0.05），3-MA組大鼠心肌成纖維細(xì)胞的增殖活性明顯增加（P＜0.05）；與法舒地爾組相比，法舒地爾+3-MA組大鼠心肌成纖維細(xì)胞的增殖活性明顯增加（P＜0.05）（表4）。

2.6 各組大鼠心肌成纖維細(xì)胞內(nèi)PCⅠ和PCⅢ含量與對照組相比，模型組大鼠心肌成纖維細(xì)胞PCⅠ和PCⅢ的水平均明顯增加（P均＜0.05）；與模型組相比，法舒地爾組大鼠心肌成纖維細(xì)胞PCⅠ和PCⅢ的水平均明顯下降（P均＜0.05），3-MA組大鼠心肌成纖維細(xì)胞PCⅠ和PCⅢ的水平均明顯升高（P均＜0.05）；與法舒地爾組相比，法舒地爾+3-MA組大鼠心肌成纖維細(xì)胞PCⅠ和PCⅢ的水平均明顯增加（P均＜0.05）（表5）。

3 討論

表1 各組大鼠的心臟肥厚指數(shù)

DCM主要是由于心臟組織的膠原沉積引起，近年來研究顯示[11]，DCM的發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞內(nèi)自噬障礙有關(guān)，減弱的自噬可以加快DCM的惡性發(fā)展。RhoA是一種自噬相關(guān)蛋白，可以激活下游的ROCK，調(diào)控自噬障礙，法舒地爾是RhoA的選擇性抑制劑，可以作用于ROCK的激酶區(qū)域ATP結(jié)合位點(diǎn)上，保護(hù)心肌細(xì)胞損傷[12]。3-MA是目前最常用的一種自噬抑制劑，因此，本研究采用法舒地爾和3-MA來研究RhoA激酶信號通路介導(dǎo)的自噬障礙在T2DM心肌纖維化中的作用。本研究中，3-MA作用后T2DM大鼠的心肌組織病理變化明顯加重，心臟肥厚指數(shù)明顯增加，法舒地爾可以明顯減輕T2DM大鼠的心肌組織病變，降低心臟肥厚指數(shù)，提示RhoA激酶信號通路被抑制后，可以促進(jìn)自噬的過程，減輕T2DM大鼠的心肌組織病變。研究顯示[13]，糖尿病患者的高血糖可以破壞心肌細(xì)胞線粒體膜的完整性，引起心肌細(xì)胞能量代謝障礙，出現(xiàn)心肌肥大，導(dǎo)致心室結(jié)構(gòu)和功能的變化。邱軒等[14]研究顯示，T2DM大鼠心肌組織中RhoA的表達(dá)水平與心臟肥厚指數(shù)均呈正相關(guān)，提示RhoA激酶信號通路可能通過抑制自噬過程，增加心臟肥厚指數(shù)，加重心肌組織損傷。

表2 各組大鼠心肌組織ROCK1、ROCK2、PCⅠ和PCⅢ mRNA的表達(dá)

圖1 各組大鼠心肌組織病理變化（×200倍）

圖2 各組大鼠心肌成纖維細(xì)胞的分離鑒定（×200倍）

表3 各組大鼠心肌組織p-MYPT1/MYPT1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin 1、p62、p-ULK1/ULK1蛋白的表達(dá)

表4 各組大鼠心肌成纖維細(xì)胞的增殖情況

表5 各組大鼠心肌成纖維細(xì)胞PCⅠ和PCⅢ水平

本研究中，T2DM大鼠體內(nèi)的ROCK1和ROCK2水平明顯上調(diào)，MYPT-1的磷酸化水平明顯上調(diào)。MYPT-1是ROCK作用的主要靶蛋白之一，其磷酸化水平反應(yīng)了ROCK的活性[15]，提示T2DM大鼠體內(nèi)的ROCK激酶被激活，參與調(diào)控DCM的發(fā)生發(fā)展。本研究中T2DM大鼠體內(nèi)的LC3-Ⅱ/LC3-I、Beclin 1、p62、p-ULK1水平明顯上調(diào)。ULK1是自噬啟動和進(jìn)展的關(guān)鍵調(diào)控因子，磷酸化的ULK1可以激活Beclin1，激活自噬過程[16]。LC3是一種典型的自噬體標(biāo)志蛋白，在自噬狀態(tài)下，LC3-I會轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N膜結(jié)合形式即LC3-II，臨床常用LC3-II/LC3-I比值來衡量自噬活性，提示T2DM大鼠體內(nèi)存在異常增強(qiáng)的自噬活性[17]。p62是自噬的特異性降解底物，可以與LC3結(jié)合，并通過自噬降解，一般情況下，其表達(dá)水平與機(jī)體的自噬活性呈反比[18]，提示T2DM大鼠體內(nèi)的自噬流受損，存在清除障礙。劉婷婷等[19]研究顯示，自噬流受損與DCM的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，心肌細(xì)胞的自噬對于維持心臟功能和活性具有重要作用。本研究中，法舒地爾干預(yù)可降低MYPT-1的磷酸化，下調(diào)ROCK1、ROCK2、p62的表達(dá)，上調(diào)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin 1、p-ULK1的表達(dá)，提示法舒地爾可抑制RhoA激酶信號通路，抑制ROCK的活性，修復(fù)受損的自噬流，保護(hù)心肌組織損傷。葉紅偉等[20]研究顯示，法舒地爾可抑制RhoA激酶信號通路，修復(fù)自噬過程，保護(hù)缺血再灌注大鼠的心肌組織損傷，與本研究相符，提示RhoA激酶信號通路介導(dǎo)的自噬障礙在T2DM大鼠心肌組織損傷中有重要作用。

臨床研究顯示[21]，心肌纖維化是心肌成纖維細(xì)胞過度增殖，引起Ⅰ型和Ⅲ型膠原過度沉積的一種病理過程。本研究中，T2DM大鼠的心肌成纖維細(xì)胞的增殖活性明顯增加，自噬抑制劑3-MA可以進(jìn)一步促進(jìn)其增殖活性，而法舒地爾可以抑制T2DM大鼠成纖維細(xì)胞的增殖活性，提示法舒地爾可以抑制RhoA激酶信號通路，修復(fù)自噬過程，抑制成纖維細(xì)胞的增殖活性。本研究中，T2DM大鼠的心肌組織和成纖維細(xì)胞中Ⅰ型和Ⅲ型前膠原的水平均明顯升高，法舒地爾可以降低T2DM大鼠的Ⅰ型和Ⅲ型前膠原的水平。Ⅰ型和Ⅲ型膠原主要由成纖維細(xì)胞分泌，是細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成成分。Tao等[22]研究顯示，DCM大鼠體內(nèi)的高糖環(huán)境可以刺激心肌成纖維細(xì)胞的過度增殖，促進(jìn)Ⅰ型和Ⅲ型膠原沉積，誘導(dǎo)心肌纖維化的產(chǎn)生，提示法舒地爾可以抑制RhoA激酶信號通路，抑制成纖維細(xì)胞的增殖及膠原沉積，從而抑制T2DM大鼠的心肌纖維化。

綜上所述，法舒地爾可以抑制RhoA激酶信號通路，促進(jìn)自噬的修復(fù)，抑制成纖維細(xì)胞的增殖以及膠原沉積，降低心臟肥厚指數(shù)，抑制T2DM大鼠的心肌纖維化，為法舒地爾的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。