原花青素聯(lián)合維生素E對動脈粥樣硬化大鼠血脂及抗氧化的影響

師豪 黃世龍 張孟柯 李潁 胡文玉 牛美蘭

(黃河科技學院醫(yī)學院，河南 鄭州 450000)

近年來以動脈粥樣硬化(AS)為基礎(chǔ)的缺血性心腦血管病(包括冠心病和腦卒中)發(fā)病率逐年升高，心腦血管病已成為我國居民死亡的主要原因〔1〕。西藥在治療AS中機制明確，取得顯著作用，但往往效果單一，且副作用較大，不良反應(yīng)多。中藥以中醫(yī)理論為指導，宏觀著手，整體施治，對AS這類復(fù)雜的疾病具有獨特優(yōu)勢，且其有效成分不易散失，副作用小。葡萄籽原花青素(GSP)作為一種提取物，具有清除氧自由基、防止細胞老化和脂質(zhì)過氧化對細胞膜損傷、對抗血小板活化因子等多種藥理作用〔2〕，所以其防治AS的機制可能包括多個方面。維生素(V)E是主要的抗氧化劑之一，它本身的結(jié)構(gòu)可以清除氧自由基和過氧化物，可被VC或氧化還原系統(tǒng)復(fù)原，繼續(xù)發(fā)揮作用〔3〕。本研究分析GSP與VE的聯(lián)合抗氧化作用防治大鼠AS的機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SPF級6～8周齡雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠60只，體重180～220 g，購自南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場，許可證編號(SCXK蘇2017-0001)，存放在黃河科技學院動物房，光照12 h/d，溫度20～23℃，相對濕度40%～60%，自由飲水和攝食。

1.2飼料 基礎(chǔ)飼料，高脂飼料配方(以下均為質(zhì)量分數(shù))：3%膽固醇、0.2%膽鹽、20%豬油、10%白糖及高蛋白基礎(chǔ)飼料(批號：201733，南京盛民科研動物養(yǎng)殖場)。

1.3實驗試劑及藥品 血清總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)試劑盒(批號：20171216)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)試劑盒(批號：20171207)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)試劑盒(批號：20171201)、一氧化氮(NO)試劑盒、血清超氧化物歧化酶(SOD)(批號：20171218)、抗超氧陰離子(O2-)試劑盒(批號：20171220)、抗羥自由基(-OH)試劑盒(批號：20171219)、丙二醛(MDA)試劑盒(批號：20171214)，均購自南京建成生物工程研究所。免疫組化試劑盒(平頂山市慧眾源生物科技有限公司)，GSP(批號：20170704，河南明瑞食品添加劑有限公司)，VE軟膠囊(批號：170817Q，山東盛海保健品有限公司)，VD3注射液(批號：20170903，哈爾濱市宏達動物藥品廠)，氯化鈉注射液(批號：1705020726，辰欣藥業(yè)股份有限公司)，阿托伐他汀鈣片(批號：171134，規(guī)格10 mg，北京嘉林藥業(yè)股份有限公司)。

1.4實驗儀器及設(shè)備 電子天平(XJ320M，上海精科天美科學儀器有限公司)、離心機(GT16-3A，北京時代北利離心機有限公司)、分光光度計(UV-8000，上海元析儀器有限公司)、旋渦混勻器(DH300，杭州瑞誠儀器有限公司)、恒溫水浴槽(NKSY-15，常州諾基儀器有限公司)。

1.5造模方法 將實驗大鼠用基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)1 w，適應(yīng)環(huán)境后，將其分為空白組10只(喂基礎(chǔ)飼料)和造模組50只(喂高脂飼料)，早晚各添加1次飼料，自由飲水，觀察記錄其基本狀況。造模期間，第1周內(nèi)腹腔注射VD 360萬IU/kg后的第3、6、9周分別注射10萬IU/kg〔4〕，每周測1次大鼠體質(zhì)量。實驗9 w后，空白組和模型組各隨機抽出2只，腹腔靜脈采血測血脂水平及抗氧化指標，截取胸主動脈用免疫組化法做病理切片確認造模成功。

1.6分組給藥方法 在建立高血脂模型基礎(chǔ)4 w后，將造模組分為5組：模型組；GSP+VE低、中、高劑量組；阿托伐他汀組，每組10只，繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)。GSP+VE低、中、高劑量組分別給予GSP〔45 mg/(kg·d)〕和VE〔15 mg/(kg·d)〕、GSP〔90 mg/(kg·d)〕和VE〔5,6〕〔30 mg/(kg·d)〕、GSP〔180 mg/(kg·d)〕和VE〔60 mg/(kg·d)〕灌胃；陽性對照給予研磨碎的阿托伐他汀鈣片〔7,8〕〔1.05 mg/(kg·d)〕灌胃，以上藥物均加用生理鹽水〔1.33 ml/(kg·d)〕；模型組灌胃同劑量的生理鹽水，連續(xù)干預(yù)4 w。

1.7樣品采集與指標測定 其他條件不變，各組于第10周稱重，腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉，固定四肢，打開腹腔，促凝真空管腹腔靜脈取血，3 500 r/min離心10 min，分離血清于-4℃冰箱保存；根據(jù)試劑盒說明測其血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C的含量〔9〕及SOD、MDA、NO的含量和抗O2-、抗-OH的能力并對比分析。

1.8組織學染色 分離1 cm長的胸主動脈，10%中性甲醛固定，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋并制成4 μm石蠟切片，常規(guī)HE染色，400倍光鏡下觀察。

1.9統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析(One-way ANOVA)和組間SNK-q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1大鼠的一般狀況 實驗過程中，模型組3只，逐漸厭食、消瘦，還有突發(fā)的急性死亡，考慮與高脂飼料和注射大劑量VD3有關(guān)；GSP+VE低劑量組3只，大鼠狀況、死亡原因與模型組相似；GSP+VE中劑量組1只，狀況同模型組，因疑似肺炎，直接處死；阿托伐他汀組4只，考慮到個體差異，不能耐受藥物副作用，死亡4只。

2.2各組血脂水平 與空白組相比，模型組血清的TC、TG、LDL-C的含量均顯著增加(P<0.05)，且TC增加更顯著(P<0.01)，HDL-C的含量顯著減少(P<0.05)，各給藥組(除阿托伐他汀組HDL-C水平外)血清TC、TG含量顯著高于空白組，(除阿托伐他汀組HDL-C水平外)HDL-C、LDL-C含量無顯著差異；與模型組相比，GSP+VE中、高劑量組和阿托伐他汀組血清TC、TG、LDL-C的含量均顯著減少，HDL-C含量顯著增加(P<0.05)，GSP+VE低劑量組LDL-C水平顯著降低(P<0.05)，見表1。

表1 各組血脂水平

與空白組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組比較：3)P<0.05，4)P<0.01；表2同

2.3各組抗氧化水平 與空白組相比，模型組血清中T-SOD活力、抑制O2-、-OH的能力、NO含量降低，MDA含量升高，差異均顯著(P<0.05或P<0.01)，各給藥組抗氧化水平趨于空白組；與模型組相比，GSP+VE各劑量組血清T-SOD活力、抑制O2-的能力、NO含量依次升高(P<0.05或P<0.01)，低劑量組MDA含量及抑制-OH能力無顯著變化(P>0.05)，高劑量組MDA含量降低，抑制-OH能力增強(P<0.05)，阿托伐他汀組NO含量、T-SOD活力升高，MDA含量降低，差異顯著(P<0.05)，抑制O2-、-OH能力無顯著差異(P>0.05)，見表2。

表2 各組抗氧化水平

2.4胸主動脈形態(tài)學觀察 藥物干預(yù)4 w后，光鏡下空白組主動脈壁內(nèi)皮完整，分界較清晰，內(nèi)膜光滑，平滑肌細胞均勻排列。GSP+VE高劑量組內(nèi)皮細胞下有脂質(zhì)沉積，其形態(tài)學變化接近于空白組；模型組主動脈內(nèi)大量鈣鹽沉積并有向管腔內(nèi)凸起的斑塊，中膜內(nèi)層出現(xiàn)斷裂，平滑肌細胞發(fā)生變性壞死，GSP+VE低劑量組動脈內(nèi)膜有粥樣斑塊沉積。阿托伐他汀組動脈內(nèi)皮細胞增生腫脹并有脂肪細胞浸潤，中膜平滑肌細胞腫大增生、排列紊亂，GSP+VE中劑量組動脈內(nèi)泡沫樣脂肪沉積，內(nèi)膜增厚，細胞增生腫大明顯，排列明顯紊亂。見圖1。

圖1 各組胸主動脈病理變化(HE，×400)

3 討 論

楊小蓉等〔10〕報道，實驗開始分4 次腹腔注射VD3共70萬IU/kg，用不同TC含量的高脂飼料探討對造模的影響，本實驗在此基礎(chǔ)上用3% TC聯(lián)合腹腔注射大劑量VD3，9 w后胸主動脈病理形態(tài)學顯示復(fù)制模型成功，與文獻相符。理論上血液TC增加，由此產(chǎn)生過多的LDL積聚在血管壁內(nèi)并被游離氧氧化成氧化型LDL，進而被巨噬細胞吞噬，形成泡沫細胞吸附于血管壁，為AS形成創(chuàng)造條件。

本實驗中，造模大鼠死亡率高的原因可能是：高脂飼料中TC含量過高影響口感、食欲；灌藥干預(yù)第1周，GSP使用劑量過大，加之味苦，導致其厭食、體質(zhì)量下降，調(diào)整給藥劑量停藥1 w后再次灌藥干預(yù)，體質(zhì)量增加狀況良好；大劑量VD3導致高鈣血癥誘發(fā)消化、泌尿系統(tǒng)功能障礙和心律失常，解剖急性死亡的大鼠，發(fā)現(xiàn)肝臟、腎臟表面均有白色密集的鈣化斑，甚至出現(xiàn)尿潴留。

本實驗結(jié)果顯示：GSP聯(lián)合VE能提高大鼠的免疫力，延長其存活時間，阿托伐他汀雖有降血脂效果，卻對機體造成的毒副反應(yīng)極大，不能耐受的機體死亡率增高。與模型組相比，GSP+VE各劑量組血脂水平依次改善，另外中、高劑量組能明顯改善血清抗氧化指標(P<0.05或P<0.01)，阿托伐他汀組光鏡下的動脈管壁仍有脂肪細胞浸潤，考慮與持續(xù)食用高脂飼料和藥物治療時間短有關(guān)，建議后續(xù)的實驗中延長給藥時間，以便提供更為準確的陽性對照。

大劑量VD3引發(fā)的高鈣血癥會導致Ca的異位沉積，機體細胞在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，活性氧(ROS)產(chǎn)生過多，細胞內(nèi)鈣超載，Ca沉積線粒體使細胞色素氧化酶系統(tǒng)功能失調(diào)，氧自由基增多并作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)，氧化終產(chǎn)物為MDA，其含量可間接反映細胞損傷的程度。鈣超載時，鈣依賴性磷脂酶A2激活，使花生四烯酸(AA)生成增加，通過環(huán)加氧酶和脂加氧酶作用產(chǎn)生大量H2O2和-OH〔11〕。機體發(fā)生高脂血癥時，內(nèi)皮細胞損傷，NO合酶(NOS)基因表達減少，導致NO產(chǎn)生不足〔12〕，抑制LDL被氧化的能力下降，從而產(chǎn)生泡沫細胞進一步發(fā)展為AS。內(nèi)皮細胞損傷后，暴露出內(nèi)皮下膠原，此時在Ca2+和NO減少的作用下，血流中血小板不斷黏附聚集，血栓素A2和生長因子釋放增多，一方面促進平滑肌細胞增殖和動脈基質(zhì)層蛋白質(zhì)合成，降低血管壁的順應(yīng)性；另一方面激活凝血因子，啟動了內(nèi)源性凝血過程，因此嚴重的AS潰瘍是導致血栓形成的常見原因。GSP聯(lián)合VE的抗氧化機制是GSP通過回收脂溶性VE和減少DNA氧化損傷來發(fā)揮作用〔13〕。綜上，GSP聯(lián)合VE具有改善血脂水平和抑制脂質(zhì)過氧化的作用，從而降低AS過程中活性自由基對血管的損害。