細(xì)胞因子與新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎的相關(guān)性

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(浙江省慈溪市人民醫(yī)院新生兒科，浙江 慈溪 315300)

壞死性小腸結(jié)腸炎(necrotizing enterocolitis，NEC)是早產(chǎn)兒常見病，主要臨床癥狀有腹脹、腸梗塞、便血等[1]。NEC病因尚不明確，目前認(rèn)為異常細(xì)菌感染、腸道內(nèi)缺血/氧、不當(dāng)食用配方奶以及早產(chǎn)是NEC的高危因素。也有研究表明cdx1、cdx2、Lgr5、PTEN等基因的異常表達(dá)會增加NEC風(fēng)險[2-6]。早產(chǎn)兒腸道發(fā)育不成熟，微血管物理性的張力失衡等原因也會導(dǎo)致腸道菌群脫離其原生環(huán)境，引起腸道內(nèi)菌群種類與數(shù)量失衡，而胃腸道致病菌感染引起的炎癥介質(zhì)釋放導(dǎo)致腸道損傷是導(dǎo)致NEC發(fā)生發(fā)展的重要因素，NEC的發(fā)生與炎癥介質(zhì)腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor， TNF)、血小板活化因子(platelet activating factor， PAF)、白細(xì)胞介素-4(interleukin 4， IL-4)、白細(xì)胞介素-6(interleukin 6， IL-6)密切相關(guān)[7-8]。NEC一般從小腸粘膜開始發(fā)病，然后累及腸壁全層甚至導(dǎo)致穿孔，如不及時控制，有引發(fā)敗血癥和其他嚴(yán)重威脅生命的疾病[9]，因此，及早診斷、準(zhǔn)確判斷NEC病情并采取正確治療有重要意義。為進(jìn)一步評估NEC與炎癥因子的相關(guān)性，本文對124例NEC患兒血清中IL-6、TNF-α、IL-4濃度進(jìn)行了測試，發(fā)現(xiàn)疾病活動程度不同的患兒血清中IL-6、TNF-α、IL-4濃度具有顯著差異，具體研究報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2015年7月至2018年5月浙江省慈溪市人民醫(yī)院收治的NEC患兒124例為研究對象，其中男性患兒64例，女性患兒60例，平均胎齡為(34.7±0.5)周，順產(chǎn)71例，剖宮產(chǎn)53例，體重(1 697.82±52.37)g 。

根據(jù)NEC的BELL劃分標(biāo)準(zhǔn)，觀察組包括Ⅰ期68例(均為ⅠB期)，Ⅱ期40例(ⅡA期29例，ⅡB期11例)，Ⅲ期16例(均為ⅢA期)。為了直觀的比較細(xì)胞因子水平與NEC的關(guān)系，另外選取同時期本院出生的100例足月、健康新生兒為對照組，兩組年齡、性別、母親年齡組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，而NEC組胎齡、體重、順產(chǎn)比例均低于對照組(均P<0.05)，見表1。

項目NEC組(n=124)對照組(n=100)χ2/tP胎齡(周)34.71±0.5338.85±1.164.910.01年齡(天)13.85±4.4815.64±5.821.830.38性別0.010.94 男75(60.48)61(61.00) 女49(39.52)39(39.00)體重(g)1 697.82±52.373 372.93±983.059.95<0.01生產(chǎn)方式 順產(chǎn)27(21.77)73(73.00)58.78<0.01 剖宮產(chǎn)97(78.23)27(27.00)母親年齡(歲)28.95±5.5826.06±4.722.960.49

1.2方法

1.2.1 NEC患兒分期

參照Bell等人設(shè)計的NEC臨床分期標(biāo)準(zhǔn)，具體情況見表2。

1.2.2 IL-6、TNF-α、IL-4濃度的測試

兩組新生兒均取頭皮靜脈血1mL，常規(guī)EDTA抗凝，3 000r/min離心10min，4℃冰箱保存至檢測。本研究中IL-4、IL-6和TNF-α檢測采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)，試劑盒均購自Sigma，操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行，樣品的提取及保存也嚴(yán)格按照說明書要求進(jìn)行。

表2 Bell關(guān)于NEC的臨床分期標(biāo)準(zhǔn)及其對應(yīng)的癥狀

Table 2 Bell’s clinical staging criteria for NEC and their corresponding symptoms

NEC臨床分期對應(yīng)的癥狀Ⅰ期可疑NEC階段 ⅠA期體溫或高或低、呼吸暫停、心跳低于正常值、嗜睡,有輕微腹脹,偶有嘔吐,MRI可檢測到輕微腸梗塞 ⅠB期臨床NEC階段在IA期的基礎(chǔ)上有便血的情況出現(xiàn)Ⅱ期確診NEC ⅡA期在ⅠB期的基礎(chǔ)上腸鳴音消失,部分患兒有腹部壓痛感,MRI可見明顯的腸道擴張、梗塞 ⅡB期在ⅡA期的基礎(chǔ)上出現(xiàn)門靜脈積氣,幾乎所有患兒有腹部壓痛感,可見腹部積水Ⅲ期進(jìn)展期NEC ⅢA期在ⅡB期的基礎(chǔ)上出現(xiàn)腹膜炎,腹部積水更加明顯 ⅢB期同ⅢA期,但是各項內(nèi)容更加顯著

1.2.3糞便DNA的提取

兩組新生兒均取新鮮糞便，排便需用統(tǒng)一、無菌容器進(jìn)行收集，然后使用無菌藥勺取糞便中間樣本1g，置于1.5mL的無菌的一次性無菌糞便采集管中，要求每一例患兒取樣4管，以防止實驗失敗需要重復(fù)。將本置于干冰盒內(nèi)冷鏈運送至微基生物科技(上海)有限公司，進(jìn)行糞便DNA提取與分析。 以16S rRNA 的 V3～V4 區(qū)域作為目標(biāo)DNA序列，進(jìn)行 PCR擴增。以 通 用 引 物 338F ( 5′-ACTCC￣TACGGGAGGCAGCA-3′) 和 506R ( 5′-GGAC￣TACHVGGGTWTCTAAT-3′) 對 16s rDNA 的 V3～V4 進(jìn)行擴增。 PCR反應(yīng)條件為 95℃預(yù)變性 3min，95℃ 變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45s，25個循環(huán)；72℃延伸20min。擴增結(jié)束后，PCR擴增產(chǎn)物使用 2% 瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳[10]。檢查擴增效果，合格樣品送Illumina-MiSeq平臺進(jìn)行高通量測序，菌落豐富度以Shannon指數(shù)和Simpson 指數(shù)表示。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

本研究中的所有數(shù)據(jù)全部采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 19.0進(jìn)行分析，計量資料均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，其計數(shù)資料采用比例(%)表示，計量資料組間差異采用t檢驗，組內(nèi)差異采用方差分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗；采用Pearson相關(guān)分析比較Shannon和Simpson菌群豐富度指數(shù)與細(xì)胞因子濃度的相關(guān)性，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1兩組新生兒IL-6、TNF-α、IL-4濃度比較

NEC組的IL-6、TNF-α和IL-4濃度均高于對照組，組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，見表3。

Table 3 Comparison of serum IL-6, TNF-α and IL-4 concentrations between two

2.2 NEC患兒細(xì)胞因子濃度與NEC臨床分期的關(guān)系

NEC組各期IL-6、TNF-α、IL-4濃度逐漸升高，組內(nèi)比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，其中Ⅱ期高于Ⅰ期(t值分別為5.96、7.81、6.00，均P<0.05)，Ⅲ期高于Ⅱ期(t值分別為6.95、5.01、5.01，均P<0.05)，見表4。

Table 4 The relationship between cytokine concentrations and NEC clinical

2.3 NEC患兒促炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-6濃度與腸道菌群豐富度相關(guān)性

TNF-a和IL-6濃度與Shannon指數(shù)呈負(fù)相關(guān)性(P<0.05)，與Simpson 指數(shù)呈正相關(guān)(P<0.05)，見表5。

表5 NEC患兒促炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-6濃度與腸道菌群豐富度相關(guān)性

Table 5 Relationship between proinflammatory cytokines TNF-α and IL-6 concentration and richness of intestinal flora

研究內(nèi)容Shannon指數(shù)Simpson 指數(shù)PTNF-α濃度r=-0.56r=0.47均<0.05IL-6 濃度r=-0.35r=0.81均<0.05

3討論

3.1 NEC的研究現(xiàn)狀及其與抗炎或促炎細(xì)胞因子的關(guān)系

NEC是一種獲得性疾病，其高發(fā)部位為回場末端，典型特征是腸道粘膜甚至腸深層的壞死。NEC的發(fā)病原因多樣，其中細(xì)菌感染是導(dǎo)致NEC發(fā)生的最主要原因之一。人體腸道中大約存在500～1 000多種細(xì)菌，這些細(xì)菌數(shù)量巨大，會通過代謝或繁殖對身體狀況造成重大影響。最為常見的腸道細(xì)菌是革蘭氏陰性桿菌，它們可產(chǎn)生內(nèi)毒素脂多糖對腸道起到直接作用，引發(fā)腸道炎癥反應(yīng)，使免疫因子如白細(xì)胞介素以及細(xì)胞壞死因子的異常表達(dá)，損傷腸道內(nèi)壁。與此同時，內(nèi)毒素多糖脂可以增加患兒體內(nèi)信號肽分子的活性，增高腸道細(xì)胞的黏附性，從而抑制腸道上皮細(xì)胞修復(fù)的過程[11]。

引起新生兒NEC的另外一個原因是腸壁缺氧、缺血和再灌注損傷等，新生兒在出生時若出現(xiàn)缺氧、窒息等會導(dǎo)致腸系膜的血流量減少，并且有可能導(dǎo)致小腸缺血部位壞死，嚴(yán)重?fù)p傷腸黏膜屏障。腸系膜是人體最主要的三大免疫器官之一，上面有豐富的淋巴結(jié)，對腸道菌群的穩(wěn)定、平衡起到重要作用，所以腸系膜的損傷至少從兩個方面導(dǎo)致了NEC發(fā)生[12]。此外早產(chǎn)和喂養(yǎng)不當(dāng)也是引發(fā)NEC的重要原因[13-14]。有研究證明TNF-α、PAF、促炎和抗炎細(xì)胞因子等多種細(xì)胞因子與信號通路參與到NEC的發(fā)生[15]。對于NEC的治療，目前臨床上主要有保守治療和手術(shù)治療兩種方式，但是對于Ⅲ期NEC患兒，其治愈效果較差，因此，NEC的預(yù)防和及早診斷具有重要意義。在本研究中，我們比較了NEC患兒與正常新生兒IL-6、TNF-α、IL-4的濃度差異，發(fā)現(xiàn)NEC組各因子濃度高于健康新生兒，而且隨著NEC嚴(yán)重程度的增加，IL-6、TNF-α、IL-4的濃度也有上升趨勢，說明這些細(xì)胞因子對于反映NEC病情也有一定的參考價值，可以作為輔助指標(biāo)。

3.2分子微生物技術(shù)研究腸道微生物概況

通過微生物的分離培養(yǎng)及生化性狀和特定表型的鑒定，可以有效的評價微生物的抗生素敏感性和致病性。但是一般情況下環(huán)境中的微生物含量較少，對絕大多數(shù)微生物的群落功能及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系無法進(jìn)行深度研究。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的引入，我們可以對環(huán)境中的優(yōu)勢菌群進(jìn)行辨識，但是檢測分辨率、精度仍不盡如人意，且費時費力。隨著第二代高通量測序技術(shù)的普及，讓我們?nèi)嬲J(rèn)識腸道微生物群落結(jié)構(gòu)、組成變化及其與宿主的相互作用關(guān)系成為了可能[16]。憑借高通量測序，我們可以準(zhǔn)確測定NEC患兒糞便中的異常菌群，從而選取合適的抗生素進(jìn)行治療。Shannon指數(shù)(即香農(nóng)威納指數(shù))是估算樣本中微生物多樣性的重要指標(biāo)，其值越大，說明菌群多樣性就越高。Simpson 指數(shù)則描述從一個群落種連續(xù)兩次抽樣所得到的個體屬于同一種屬的概率，故該值越大，物種(菌群)多樣性越低。在本研究中測量了124例NEC患兒的Shannon指數(shù)法和Simpson 指數(shù)，發(fā)現(xiàn)TNF-a和IL-6濃度越高，Shannon指數(shù)越小，二者之間具有密切的負(fù)相關(guān)性，與此相對應(yīng)，TNF-a和IL-6濃度越高，Simpson 指數(shù)越大。說明NEC會導(dǎo)致患兒腸道中菌群豐度的下降，且這種原因與促炎和抗炎細(xì)胞因子IL-6、TNF-α、IL-4的濃度有密切聯(lián)系。

綜上所述，抗炎或促炎細(xì)胞因子濃度與NEC的臨床分期及腸道菌群豐富度密切相關(guān)，可作為NEC病情診斷的輔助指標(biāo)。

[專業(yè)責(zé)任編輯:史曉薇]