水中病毒的濃縮檢測(cè)與處理技術(shù)研究進(jìn)展

楊月琴

(重慶工商大學(xué) 環(huán)境與資源學(xué)院，重慶 400067)

據(jù)世界衛(wèi)生組織的數(shù)據(jù)顯示，大約每年有220萬(wàn)人因飲用水的問(wèn)題而死亡，水中攜帶的病原微生物嚴(yán)重威脅著人類的健康安全，因病原微生物導(dǎo)致的疾病占總數(shù)的26%[1]。水中常見(jiàn)的病毒有腸道病毒、杯狀病毒、輪狀病毒、腺病毒、甲型肝炎病毒、星狀病毒等[2-3]。

目前相關(guān)研究者已經(jīng)從污水、地表水、地下水、海水甚至飲用水中都檢測(cè)出了一定量的病毒。蘇聯(lián)的研究報(bào)告指出在自來(lái)水供水系統(tǒng)中，一年四季均可分離出腸道病毒[4]。我國(guó)也常在水環(huán)境中檢測(cè)到病毒，中國(guó)武漢長(zhǎng)江3座水廠出廠水中檢測(cè)到了腺病毒、輪狀病毒和腸道病毒[5]。水中病毒會(huì)使人感染多種疾病，如:胃腸道感染、呼吸道感染、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染、心臟感染、肌肉和關(guān)節(jié)疾病、出疹性熱病、結(jié)膜炎等[6]。目前，病原體污染已經(jīng)成為大家重點(diǎn)關(guān)注的環(huán)境問(wèn)題，不斷優(yōu)化處理和檢測(cè)的方法是相關(guān)研究者重點(diǎn)研究方向。

1 水環(huán)境中病毒的前處理技術(shù)

病毒的感染性很強(qiáng)，在環(huán)境中很容易存活，且病毒極其微小，即使經(jīng)過(guò)了水處理設(shè)施還是極有可能被排放到水體當(dāng)中，其在水中的濃度也很低，直接進(jìn)行檢測(cè)較為困難，需將病毒進(jìn)行濃縮富集后再進(jìn)行檢測(cè)，這里提出的濃縮富集即為前處理技術(shù)。

1.1 濾膜過(guò)濾法

濾膜過(guò)濾法廣泛應(yīng)用于實(shí)際中，其中的重點(diǎn)是濾膜的選用。一種濾膜是負(fù)電荷濾膜，例如尼龍膜、混合纖維素濾膜等，正電荷濾膜有玻璃纖維濾膜、納米鋁濾膜等[7]，該法原理是用帶有正電荷或者負(fù)電荷的濾膜來(lái)吸附水中表面帶相反電荷的病毒，然后用洗脫液把病毒洗脫出來(lái)，達(dá)到濃縮效果。張崇淼等[8]濃縮地表水中的病毒就是利用混合纖維素濾膜進(jìn)行處理，回收率在70%左右。

濾膜過(guò)濾法操作簡(jiǎn)單、且回收效率高，但是這種方法價(jià)格昂貴，對(duì)于渾濁度較高的水樣處理效果不是很好，會(huì)發(fā)生堵塞，這一缺點(diǎn)導(dǎo)致了該法對(duì)地表水有較好的處理效果，而對(duì)于生活污水效果欠佳[9]。

1.2 吸附-洗脫法

吸附-洗脫法是利用各種吸附劑(如硅膠、硅藻土、玻璃粉、活性炭、樹(shù)脂、瀝青等)來(lái)吸附病毒粒子，然后再用洗脫劑將病毒洗脫下來(lái)，該法也是常用的方法之一。而且與濾膜過(guò)濾法相比較，吸附洗脫法可以處理渾濁度較大的水樣。Jothikumar等[10]用活性炭作為濾料來(lái)吸附飲用水中的病毒，且有較好效果。Gantzer等[11]用玻璃粉作為濾料，采用吸附-洗脫法處理污水處理廠出水具有很好的效果 。

吸附-洗脫法的優(yōu)點(diǎn)：①是檢測(cè)速度快，相比濾膜法要快得多，大大縮短了水樣處理時(shí)間[10]；②是回收率高，且各影響因素(如水樣的渾濁度、溫度、pH等)都對(duì)其處理效率影響不大；③是成本較低，吸附劑價(jià)格低廉，且裝置簡(jiǎn)單，無(wú)需昂貴儀器。所以吸附-洗脫法有很好的前景，有望在實(shí)際工程中大面積推廣。

1.3 絮凝沉淀法

由于Al(OH)3膠體帶正電，可以用它來(lái)吸附帶負(fù)電的病毒，然后通過(guò)物理方法(如過(guò)濾法和離心法)收集被吸附了的病毒，最后利用洗脫液來(lái)洗脫病毒粒子，這就是絮凝沉淀法[12]。Calgua等[13]用絮凝沉淀法處理城市污水，用甘氨酸-堿性緩沖液洗脫病毒，效果良好。

但該法只可以處理數(shù)升的水樣，且水樣本身的水質(zhì)狀況在一定程度上會(huì)影響Al(OH)3的吸附能力，故應(yīng)用到實(shí)際中仍具有一定局限性。

1.4 超速離心法

超速離心法濃縮病毒是通過(guò)60 000 r/min以上的轉(zhuǎn)速來(lái)獲得約為重力加速度50萬(wàn)倍的離心力，從而達(dá)到濃縮病毒的目的。其原理是利用每個(gè)顆粒都有不同的質(zhì)量、密度、大小及形狀等，使其在條件相同的離心場(chǎng)中有不同的沉降速度，由此便可以實(shí)現(xiàn)物質(zhì)之間的分離，達(dá)到濃縮效果[14]。

但這種方法使用的超速離心機(jī)價(jià)格較高，而且要求樣品的體積很小，一般用作二次濃縮[15]。

1.5 免疫磁珠分離法

免疫磁珠分離法的原理是利用抗體和抗原特異性結(jié)合，把抗體包裹在磁珠表面，并將其裝填成柱，水樣通過(guò)柱子與其中的免疫磁珠充分接觸后，最后再用洗脫液洗脫病毒，這樣就可以分離出被檢測(cè)病毒[16]。

免疫磁珠分離法的優(yōu)勢(shì)是效率高、效果好，可快速高效的實(shí)現(xiàn)分離，可去除各種干擾雜質(zhì)，且兼容性好，可以和各種檢測(cè)方法相結(jié)合(如PCR法)[17]。

1.6 超濾法

超濾法是利用小孔徑的濾膜(水和小分子的物質(zhì)才能通過(guò))，大分子物質(zhì)包括病毒則被攔截?zé)o法通過(guò)，用這種小孔徑濾膜過(guò)濾水樣從而將病毒分離出來(lái)[12]。在此方法的基礎(chǔ)上發(fā)明了超濾筒，能將水樣濃縮至1 mL以下，且回收率高，操作簡(jiǎn)單[18-19]。但由于超濾法使用的濾膜孔徑太小，很容易堵塞，所以要先用其他方法去除較大的雜質(zhì)。且只能處理幾十毫升的少量水樣，用時(shí)較長(zhǎng)，所以不適宜用于實(shí)際工程當(dāng)中。

因此在選擇濃集病毒的方法時(shí)，要根據(jù)實(shí)際需要選擇適合的方法，良好的病毒濃集方法應(yīng)滿足以下特點(diǎn)：①回收效率高且性能穩(wěn)定；②不僅能達(dá)到濃縮富集病毒的目的，還能將水樣中的干擾雜質(zhì)去除；③時(shí)間短、成本低、易推廣；④最后的濃縮液體積小，可用于直接檢測(cè)；⑤結(jié)果具有良好的重復(fù)性。

2 水環(huán)境中病毒的檢測(cè)技術(shù)

現(xiàn)階段的檢測(cè)方法主要有細(xì)胞培養(yǎng)法、免疫學(xué)法、PCR檢測(cè)法和生物芯片法等，并在此基礎(chǔ)上結(jié)合和發(fā)展了多種新型檢測(cè)方法，以下是對(duì)現(xiàn)階段常用的病毒檢測(cè)方法的介紹。

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)法

病毒本身沒(méi)有繁殖能力，它是通過(guò)感染宿主細(xì)胞來(lái)繁殖，細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)就是根據(jù)宿主細(xì)胞病變來(lái)檢測(cè)病毒[12]。它是最常規(guī)和傳統(tǒng)的檢測(cè)技術(shù)，被認(rèn)為是目前檢測(cè)病毒感染性的最可靠方法[20]，廣泛用于直接檢測(cè)病毒感染。

但由于該方法需要特定的培養(yǎng)細(xì)胞，有些病毒需要培養(yǎng)較長(zhǎng)時(shí)間，或有些病毒根本無(wú)法培養(yǎng)，例如諾瓦克病毒則無(wú)法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)[21]，且該法費(fèi)用昂貴。

2.2 免疫學(xué)檢測(cè)法

利用抗原-抗體反應(yīng)的高度特異性來(lái)測(cè)定病毒的抗原，這是免疫學(xué)檢測(cè)法的原理，它包括有免疫熒光法、酶聯(lián)免疫吸附法等。原理是使用熒光素或酶對(duì)抗原或抗體進(jìn)行標(biāo)記，當(dāng)其與相對(duì)應(yīng)的抗原與抗體結(jié)合后觀測(cè)顯色，然后用熒光檢測(cè)儀或酶標(biāo)儀測(cè)定[22]。

免疫學(xué)檢測(cè)法在實(shí)際當(dāng)中應(yīng)用廣泛，如在臨床診斷中檢測(cè)病毒，例如可用于SARS 病毒的快速診斷[23]。

2.3 PCR檢測(cè)法

PCR檢測(cè)法的原理是在體外擴(kuò)增特異性DNA(或RNA)片段，用雜交或者熒光檢測(cè)來(lái)鑒定結(jié)果。由于該方法使用簡(jiǎn)便快速，可在大范圍內(nèi)的流行病調(diào)查以及病毒檢測(cè)中進(jìn)行實(shí)踐，已經(jīng)成為病毒檢測(cè)的一種普遍方法，目前已用于在地表水、河水、自來(lái)水中檢測(cè)病毒[24-25]。Soule等[26]用PCR方法對(duì)水中的病毒進(jìn)行檢測(cè)有非常好的效果，該法在環(huán)境檢測(cè)方面有很好的發(fā)展前景。

但該方法僅能檢測(cè)病毒的核酸，但卻不可以表明病毒的感染性。細(xì)胞培養(yǎng)與 PCR 法相結(jié)合的檢測(cè)方法，其靈敏度高，彌補(bǔ)了PCR檢測(cè)方法不能表征病毒的感染性的缺陷，可以檢測(cè)到具有感染性的病毒，且相對(duì)于原本的兩種方法更加靈敏[27]。

2.4 生物芯片技術(shù)

生物芯片技術(shù)檢測(cè)過(guò)程是一種將基因有序固定在微小的介質(zhì)(可以是硅片、玻璃片、 纖維膜、尼龍膜等)表面，然后與標(biāo)記后被檢測(cè)基因的堿基序列雜交并發(fā)出信號(hào)，最后由計(jì)算機(jī)檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)雜交的信號(hào)[12]。

該技術(shù)具有高敏感性、高特異性、快速等優(yōu)勢(shì)，可在實(shí)際中用于篩選大批量環(huán)境樣品，具有良好的發(fā)展前景。

3 水環(huán)境中病毒的處理

水環(huán)境中病毒的處理原理主要分為兩種類型，分別是對(duì)其進(jìn)行分離和滅活處理[28]。

3.1 病毒的分離

病毒的分離是指運(yùn)用沉淀、絮凝、過(guò)濾等方式將病毒去除，此時(shí)的去除是指將病毒與水分離，即將其從液相中轉(zhuǎn)移出來(lái)[28]。

例如在常規(guī)污水處理過(guò)程中應(yīng)用的物理沉淀法、活性污泥法等，原理是病毒被吸附在污泥、絮凝劑上，然后再將產(chǎn)生的沉淀去除。此時(shí)的病毒大多數(shù)只是被吸附和包埋，還存在于沉淀之中，并沒(méi)有被滅活[29]。因此如何處理沉淀中的病毒也是十分重要的，可以將污泥或沉淀進(jìn)行干燥，干燥過(guò)程中病毒脫水，使病毒的核酸滅活，還可以在干燥過(guò)程中加入石灰等物質(zhì)提高 pH 值從而對(duì)病毒進(jìn)行滅活[30]，另外水質(zhì)情況、病毒濃度、絮凝劑類型都可能會(huì)影響病毒的去除效果[31]。

3.2 病毒的滅活

病毒的滅活的意思是使其失去感染的能力，現(xiàn)在常用的消毒技術(shù)有紫外消毒、氯化消毒、二氧化氯、TiO2-光催化消毒等。

紫外消毒的原理是紫外光可使病毒核酸鍵斷裂，遺傳物質(zhì)發(fā)生突變無(wú)法進(jìn)行復(fù)制及轉(zhuǎn)錄，從而沒(méi)有了繁殖能力。Hijnen等[31]的實(shí)驗(yàn)證明紫外線對(duì)多種病毒(輪狀病毒、杯狀病毒等)均有良好的滅活效果。紫外消毒技術(shù)具有無(wú)副產(chǎn)物、操作簡(jiǎn)單、效率高等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已在實(shí)際的水處理工程中廣泛應(yīng)用。值得一提的是，由于病毒自身具有修復(fù)機(jī)制，可以利用自身的光復(fù)活機(jī)制對(duì)紫外線造成的損傷進(jìn)行修復(fù)[31]，故研究和解決病毒的自身修復(fù)問(wèn)題是熱點(diǎn)的研究方向。

氯化消毒是通過(guò)加入消毒劑形成具有強(qiáng)氧化性的次氯酸，然后使病毒的核酸受到破壞[32]或使病毒的蛋白質(zhì)外殼變性讓病毒無(wú)法增殖[33]，從而達(dá)到病毒滅活的目的。

二氧化氯消毒原理是ClO2分子破壞病毒的核酸和蛋白質(zhì)使其滅活[34]。雖然普遍認(rèn)為二氧化氯的效果更好，但根據(jù)研究顯示，二氧化氯對(duì)大腸桿菌和SARS 冠狀病毒的去除效果還不如氯化消毒[35]，故消毒效率高低與具體的病毒類型有關(guān)。

近年來(lái)光催化材料TiO2被廣泛用于環(huán)境中去除各種污染物，也被用于滅活水中的病原微生物，顧霓濤等[36]研究證明納米TiO2-光催化滅活污水廠出水病毒具有可行性，且用太陽(yáng)光比紫外光照射效果要好。

4 總結(jié)與結(jié)論

對(duì)于水環(huán)境中的病毒檢測(cè)和去除有以下幾點(diǎn)展望。

(1)雖然已有相關(guān)研究人員從水體當(dāng)中檢測(cè)出了許多種病毒，但是目前大多數(shù)的國(guó)家還沒(méi)有在水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)中建立針對(duì)病毒的專項(xiàng)指標(biāo)，水環(huán)境中病毒會(huì)對(duì)人類健康有很大的影響，建立相關(guān)指標(biāo)是十分有必要的，應(yīng)引起足夠的重視。

(2)在現(xiàn)有技術(shù)和方法上不斷優(yōu)化創(chuàng)新，結(jié)合各種方法的優(yōu)缺點(diǎn)，揚(yáng)長(zhǎng)避短，選擇合適的方法。

(3)建立更加快速高效的檢測(cè)分析水環(huán)境中病毒的方法，研究分析水處理過(guò)程對(duì)病毒的實(shí)際去除效率，監(jiān)測(cè)水環(huán)境中病毒的存在情況，為人們創(chuàng)造更加健康的飲水環(huán)境。