正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化酶解預(yù)處理提取銀杏葉黃酮和內(nèi)酯的工藝

馮自立，趙正棟，孫茜，朱志斌，李穎，任曉峰

(1.陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723000；2.陜西理工大學(xué) 維生素D生理與應(yīng)用研究所，陜西 漢中 723000； 3.漢中市植物提取產(chǎn)業(yè)研發(fā)中心，陜西 漢中 723000)

銀杏(GinkgobilobaL.)為銀杏科銀杏屬落葉喬木，為我國(guó)特產(chǎn)植物[1]。銀杏葉為銀杏的重要藥用部位，其主要有效成分為黃酮類和內(nèi)酯類化合物[2]。銀杏黃酮具有抗衰老、抗腫瘤、抗菌、消炎等功效[3-5]，銀杏內(nèi)酯對(duì)改善腦缺血、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈血管、增強(qiáng)心肌收縮力和保護(hù)神經(jīng)中樞效果顯著。銀杏葉提取物藥理活性廣泛且不良反應(yīng)較少[6]，被廣泛的應(yīng)用到藥品和功能食品領(lǐng)域。

目前，銀杏葉提取物生產(chǎn)工藝主要有有機(jī)溶劑提取、微波提取、超臨界流體萃取、超聲提取以及酶解提取等[7-9]。銀杏葉中黃酮和內(nèi)酯類化合物主要存在于細(xì)胞壁內(nèi)，傳統(tǒng)方法提取效率較低。采用酶解的方法對(duì)銀杏葉粉進(jìn)行預(yù)處理，可有效破壞銀杏葉細(xì)胞壁，使其中有效成分銀杏黃酮和銀杏內(nèi)酯更好的溶出[10-12]。為生產(chǎn)高質(zhì)量銀杏葉提取物提供數(shù)據(jù)參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

銀杏葉(2016年8月采摘自陜西省寧強(qiáng)縣，6年齡樹(shù)，60 ℃烘干、粉碎后過(guò)40目篩)，總黃酮含量8.8 mg/g，總內(nèi)酯含量3.7 mg/g；纖維素酶(5×104U/g)、果膠酶(3×104U/g)、復(fù)合酶(纖維素酶∶果膠酶=1∶1)均為食品級(jí)；槲皮素、山奈酚、異鼠李素、銀杏內(nèi)酯A、B、C和白果內(nèi)酯對(duì)照品；乙醇、鹽酸、乙酸乙酯、醋酸鈉均為分析純；正丙醇、磷酸、四氫呋喃、甲醇均為色譜純；LX-5大孔吸附樹(shù)脂，工業(yè)級(jí)；超純水，自制。

JA 2603B電子天平；JB 90-D電動(dòng)強(qiáng)力攪拌器；SY21-K恒溫水浴鍋；N-1200B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；SHZ-D循環(huán)水真空泵；BS50-1A雙通道恒流泵；7D5A-WS離心機(jī)；Thermo UltiMate 3000高效液相色譜儀(HPLC-UV)；Agilent 1260高效液相色譜儀；串聯(lián)UM5000蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(HPLC-ELSD)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品酶解預(yù)處理 稱取干燥銀杏葉粉末50.0 g，放入1 L三口燒瓶，加入質(zhì)量1/300的酶粉，加水200 mL，進(jìn)行機(jī)械攪拌，用0.1 mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)pH值，在溫度50 ℃酶解4 h。

1.2.2 黃酮和內(nèi)酯提取 酶解結(jié)束后，加乙醇水溶液，調(diào)整體系乙醇濃度為20%，料液比為1∶10 g/mL，回流提取2次，每次2 h，合并提取液，過(guò)濾,濃縮至無(wú)醇味后，上LX-5大孔吸附樹(shù)脂柱進(jìn)行純化，10%乙醇溶液除雜，70%乙醇水溶液洗脫，濃縮、干燥、粉碎后，得銀杏葉提取物。分別用HPLC-UV和HPLC-ELSD法檢測(cè)總黃酮和總內(nèi)酯含量。

1.3 黃酮和內(nèi)酯含量測(cè)定

1.3.1 對(duì)照品溶液制備

1.3.1.1 總黃酮對(duì)照品溶液制備 精密稱取槲皮素、山奈酚和異鼠李素對(duì)照品各6.0 mg，定容至5 mL，制成銀杏黃酮混合對(duì)照品母液。再將該母液分別稀釋2倍、4倍、8倍、16倍，搖勻、過(guò)濾，即得。

1.3.1.2 總內(nèi)酯對(duì)照品溶液制備 精密稱取白果內(nèi)酯和銀杏內(nèi)酯A、B、C各8.0 mg，定容至5 mL,制成銀杏內(nèi)酯混合對(duì)照品母液。再將該母液分別稀釋2倍、4倍、8倍、16倍，搖勻、過(guò)濾，即得。

1.3.2 供試品溶液制備[13]

1.3.2.1 銀杏黃酮供試品溶液制備 精密稱取酶解法制備的銀杏葉提取物35.0 mg，加25 mL甲醇-25%鹽酸(4∶1)的混合溶液，加熱回流0.5 h，冷卻至室溫，定容至50 mL，搖勻、過(guò)濾、取續(xù)濾液即得。

1.3.2.2 銀杏內(nèi)酯供試品溶液制備 精密稱取酶解法制備的銀杏葉提取物150.0 mg，加水10 mL，50 ℃超聲10 min,使樣品充分溶散。滴加2.0%鹽酸0.5 mL，用乙酸乙酯萃取4次，每次10 mL，合并萃取液。用20 mL 5%的醋酸鈉洗滌，醋酸鈉溶液用10 mL乙酸乙酯洗滌。合并乙酸乙酯萃取液及洗滌液，用40 mL水分2次洗滌，水液合并用10 mL乙酸乙酯洗滌，合并乙酸乙酯提取液及洗液，減壓蒸干，殘?jiān)眉状既芙?，并定容? mL，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液即得。

1.3.3 色譜條件

1.3.3.1 銀杏黃酮檢測(cè)色譜條件 高效液相色譜儀，AcclaimTM120 C185 μm，4.6 mm×250 mm色譜柱，柱溫25 ℃，流動(dòng)相為甲醇∶0.4%磷酸溶液(50∶50)，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量10 μL。

1.3.3.2 銀杏內(nèi)酯檢測(cè)色譜條件 高效液相色譜儀串聯(lián)UM5000蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，AcclaimTM120 C185 μm，4.6 mm×250 mm色譜柱，流動(dòng)相為正丙醇∶四氫呋喃∶水=1∶15∶84，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，柱溫35 ℃，載氣為氮?dú)?，流?.5 L/min，飄移管溫度90 ℃。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用統(tǒng)計(jì)分析軟件Design-Expert 8.05對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，按照公式(1)和公式(2)計(jì)算黃酮提取率(X)和內(nèi)酯提取率(Y)。

(1)

(2)

2 結(jié)果與討論

2.1 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)課題組前期做的銀杏葉酶解單因素實(shí)驗(yàn)以及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[9-12]，選取酶用量、酶解時(shí)間、酶解溫度、酶解pH值4個(gè)因素，各取3個(gè)水平，采用L9(34)正交表進(jìn)行酶解實(shí)驗(yàn)，以銀杏總黃酮和銀杏總內(nèi)酯提取率為指標(biāo)，同時(shí)以兩者的最大數(shù)值為參考，進(jìn)行數(shù)據(jù)歸一，得出權(quán)重系數(shù)。將銀杏總黃酮提取率的權(quán)重系數(shù)設(shè)為0.5，銀杏總內(nèi)酯的權(quán)重系數(shù)也設(shè)為0.5，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。綜合評(píng)分M=0.5X×100/94.24+0.5Y×100/93.35。因素水平見(jiàn)表1，結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

表1 因素水平表

由表3可知，因素A和C對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有顯著影響(0.01>P>0.05)，因素B對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有一定的影響(0.05>P>0.10)，其影響順序?yàn)槊赣昧?A)> 酶解溫度(C) >酶解時(shí)間(B)>酶解pH值(D)，銀杏葉酶解最佳工藝組合為A2B3C2D2，即酶用量為銀杏葉的1/300，酶解時(shí)間4.0 h，酶解溫度50 ℃，酶解pH值為5.0。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析

注：F0.10(2,2)=9.00，F(xiàn)0.05(2，2)=19.00，F(xiàn)0.01(2，2)=99.00。

2.2 酶解驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

按照優(yōu)選工藝組合，取銀杏葉粉末3份，每份50.0 g，加酶0.17 g，加水200 mL攪拌均勻后，用0.1 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)酶解液pH=5.0，于50 ℃酶解4.0 h。

結(jié)果銀杏黃酮平均提取率為92.38%，RSD(n=3)為1.18%，銀杏內(nèi)酯平均提取率為91.74%，RSD(n=3)為1.47%，表明該工藝重復(fù)性好，穩(wěn)定可靠。

提取物中黃酮含量最高可達(dá)30.32%，總內(nèi)酯含量最高可達(dá)8.85%，比商務(wù)部《國(guó)際商務(wù)標(biāo)準(zhǔn) 植物提取物銀杏葉提取物 SW/T 1—2013》和《2015版中國(guó)藥典 銀杏葉提取物》所規(guī)定的黃酮24.0%、內(nèi)酯6.0%分別高出6.32和2.85個(gè)百分點(diǎn)。

3 結(jié)論

銀杏葉酶解預(yù)處理最佳工藝為：酶用量為銀杏葉的1/300，酶解4.0 h，酶解溫度50 ℃，酶解pH值為5.0。銀杏黃酮平均提取率為92.38%，RSD(n=3)為1.18%，銀杏內(nèi)酯平均提取率為91.74%，RSD(n=3)為1.47%，工藝重復(fù)性好，穩(wěn)定性高。提取物中總黃酮含量最高可達(dá)30.32%，總內(nèi)酯含量最高可達(dá)8.85%，比商務(wù)部《國(guó)際商務(wù)標(biāo)準(zhǔn) 植物提取物銀杏葉提取物 SW/T 1—2013》和《2015版中國(guó)藥典 銀杏葉提取物》所規(guī)定的黃酮24.0%、內(nèi)酯6.0%分別高出6.32和2.85個(gè)百分點(diǎn)。該工藝的研究為酶法預(yù)處理制備高規(guī)格銀杏葉提取物的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)，可以有效降低生產(chǎn)工藝成本，促進(jìn)國(guó)內(nèi)銀杏葉提取物產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量的提升。