降鈣素基因相關(guān)肽受體單克隆抗體的制備與初步鑒定

王佳星，許永亮，付楚溪，張丹雨，薛沖，張惟材，王升厚，熊向華

1.沈陽師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 沈陽110034；2.軍事科學(xué)院 軍事醫(yī)學(xué)研究院 生物工程研究所，北京100071；3.遼寧大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 沈陽110036

偏頭痛是臨床常見的慢性神經(jīng)血管性疾病，于兒童和青春期開始發(fā)病，發(fā)病高峰期在25～50歲，患病率為5%～10%，且女性常高于男性[1]。多項(xiàng)研究證實(shí)，當(dāng)偏頭痛發(fā)作時(shí)體內(nèi)降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）水平明顯增高，且頭痛強(qiáng)度與CGRP 水平呈正相關(guān)[2]。CGRP 通過與位于細(xì)胞膜上的CGRP 受體（CGRP receptor，CGRPR）結(jié)合激活環(huán)磷酸腺苷信號(hào)通路，因此，阻斷CGRP與CGRPR的結(jié)合從而抑制CGRP 信號(hào)傳導(dǎo)是治療偏頭痛的關(guān)鍵。目前CGRPR 被認(rèn)為是偏頭痛治療和預(yù)防最具潛力的靶點(diǎn)，靶向結(jié)合CGRPR 阻斷其與CGRP 結(jié)合的單克隆抗體可作為緩解偏頭痛的候選藥物[3-5]。

CGRPR 是G 蛋白偶聯(lián)受體家族B 類成員，該家族是體內(nèi)最大的膜蛋白受體家族，參與多種生理功能的調(diào)節(jié)，并且與很多疾病緊密相關(guān)，目前市場(chǎng)上近50%的藥物都以G 蛋白偶聯(lián)受體家族為作用靶點(diǎn)[6]。CGRPR 由1個(gè)N端胞外域、7 次跨膜結(jié)構(gòu)域和1個(gè)C端胞內(nèi)域組成，并與1個(gè)跨膜蛋白受體活性修飾蛋白（receptor activity modifying protein 1，RAMP1）和1個(gè)胞內(nèi)蛋白（receptor com?ponent protein，RCP）組成功能性受體[7]。CGRP與CGRPR的N端胞外域結(jié)合后將信號(hào)傳遞至細(xì)胞內(nèi)，因而本研究截取人源CGRPR的N端胞外域23～146 氨基酸殘基區(qū)域作為篩選靶點(diǎn)，利用原核系統(tǒng)表達(dá)，經(jīng)包涵體復(fù)性、純化得到的CGRPR 胞外區(qū)蛋白作為抗原，通過雜交瘤技術(shù)篩選特異性結(jié)合CGRPR的單克隆抗體并進(jìn)行分析測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF 級(jí)BALB/c 雌鼠（北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司）；Sp2/0 骨髓瘤細(xì)胞、pGEX-4T 質(zhì)粒（本實(shí)驗(yàn)室保存）；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α、BL21（DE3）（北京天根生化科技有限公司）；pMD-18T 載體[寶生物工程（大連）有限公司]；CGRPR（安徽通用有限公司合成）；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑（Sigma 公司）；單抗亞類鑒定試劑盒（北京博奧龍免疫技術(shù)公司）；GSTrap FF 親和層析柱、Protein-G 親和層析柱（GE 公司）；DMEM（Kccell 公司）；HAT、胎牛血清（Gibco 公司）；Ultra?pure RNA Kit、HiFiScript gDNA Removal cDNA Synthesis Kit（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、XhoⅠ，標(biāo)記HRP 羊抗鼠二抗（Thermo 公司）；96 孔板（NEST 公司）；PVDF 膜（Millipore 公司）；SDS-PAGE 樣品緩沖液[生工生物工程（上海）股份有限公司]。

1.2 重組質(zhì)粒構(gòu)建

參照NCBI 數(shù)據(jù)庫的人源CGRPR 序列（NP_005786）進(jìn)行全基因合成，設(shè)計(jì)上游引物（5'-GG AATTCgaattagaagagagtcctgaggactcaatt-3'，下 劃 線 序列為EcoRⅠ酶切位點(diǎn)）、下游引物（5'-GGCTCGA Gtatggtcaggtaaaacaaatttagtgcagtcttc-3'，下 劃 線 序 列為XhoⅠ酶切位點(diǎn)），PCR 擴(kuò)增CGRPR 胞外區(qū)片段（N端胞外域23～146 位氨基酸殘基），經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后切膠回收，回收片段與pGEX-4T 載體分別用EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)電泳回收后，用T4DNA 連接酶連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，次日挑取單克隆接種至LB（含氨芐青霉素）培養(yǎng)基中，200 r/min、37℃培養(yǎng)，菌液PCR 鑒定的陽性克隆送測(cè)序。

1.3 蛋白表達(dá)及純化

將構(gòu)建的pGEX-4T-CGRPR 胞外區(qū)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，次日挑取單克隆進(jìn)行活化，當(dāng)活化菌液D600nm值約0.5 時(shí)加入IPTG 至終濃度為0.5 mmol/L，于200 r/min、16℃條件下誘導(dǎo)表達(dá)過夜；菌液于4℃、12 000 r/min 離心10 min，棄上清，菌體沉淀用緩沖液（10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA）重懸后超聲波破碎，離心得到包涵體沉淀；將包涵體沉淀用洗滌液（2 mol/L 尿素，50 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，1% Tween）清洗3 次，再用溶解液（8 mol/L 尿 素，20 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，1 mol/L DTT）溶解；離心去雜質(zhì)，上清逐步于4、2、0.8 mol/L 尿素復(fù)性液以及PBS 溶液中梯度復(fù)性；用GSTrap FF 親和層析柱純化復(fù)性蛋白，采用洗脫液（10 mmol/L 磷酸鈉緩沖液，150 mmol/L NaCl，10 mmol/L 還原性谷胱甘肽）進(jìn)行洗脫，收集洗脫峰進(jìn)行SDS-PAGE 分析。

1.4 動(dòng)物免疫

選擇5只健康的SPF 級(jí)6～8周齡BALB/c 雌性小鼠，取純化抗原GST-CGRPR 胞外區(qū)融合蛋白與等量弗氏完全佐劑充分混合后，100 μg/只皮下多點(diǎn)注射于小鼠背部進(jìn)行基礎(chǔ)免疫；每間隔2周取抗原與等量弗氏不完全佐劑混合，50 μg/只背部皮下免疫，共加強(qiáng)免疫3 次；最后一次加強(qiáng)免疫完成2周后，取小鼠尾靜脈血測(cè)定效價(jià)，選擇效價(jià)最高的小鼠腹腔注射抗原100 μg 進(jìn)行沖擊免疫。

1.5 雜交瘤細(xì)胞株建立

沖擊免疫后3 d，無菌環(huán)境下取免疫小鼠脾臟制成細(xì)胞懸液并與Sp2/0 按5∶1 混合，PEG 法進(jìn)行細(xì)胞融合[8]，HAT 選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，7 d后替換為HT 培養(yǎng)基。待細(xì)胞克隆生長至培養(yǎng)孔面積1/3～1/2 時(shí)，采用間接ELISA 法篩選陽性細(xì)胞株。陽性雜交瘤細(xì)胞通過有限稀釋法進(jìn)行連續(xù)克隆化，至少3 次，直至陽性率達(dá)到100%，即獲得能穩(wěn)定分泌特異性抗體的單克隆細(xì)胞株。

1.6 腹水制備及純化

選擇健康的SPF 級(jí)8～10周齡BALB/c 雌性小鼠，腹腔注射0.5 mL 弗氏不完全佐劑進(jìn)行預(yù)免疫，7 d后將生長狀態(tài)良好的陽性細(xì)胞株（約1×106/只）接種于小鼠腹腔制備腹水，并以相同方法將Sp2/0細(xì)胞接種于小鼠腹腔獲得腹水作為陰性對(duì)照；7～10 d 小鼠腹部出現(xiàn)明顯隆起、精神萎靡、食欲不振、活動(dòng)受限等狀態(tài)時(shí)收集腹水[9]，4℃、5000 r/min 離心15 min后棄上層油脂與下層沉淀，收集中間層上清置-20℃保存；取得的腹水用Protein G 柱進(jìn)行親和層析，經(jīng)0.1 mol/L（pH2.7）的甘氨酸緩沖液洗脫，收集洗脫峰，用1 mol/L（pH9.0）的Tris-HCl 溶液調(diào)節(jié)洗脫液pH值至7.0，進(jìn)行還原型SDS-PAGE 分析。

1.7 抗體亞類鑒定及效價(jià)測(cè)定

用抗體亞類鑒定試劑盒對(duì)篩選到的陽性細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行亞型鑒定，間接ELISA 法測(cè)定陽性細(xì)胞培養(yǎng)上清及腹水效價(jià)。

1.8 抗體可變區(qū)基因調(diào)取

將陽性細(xì)胞株培養(yǎng)至增殖期，輕輕吹起細(xì)胞并計(jì)數(shù)，將細(xì)胞懸液于800 r/min 離心5 min，棄上清，用細(xì)胞總RNA 提取試劑盒提取總RNA，1%瓊脂糖電泳檢測(cè)RNA的完整性，Nano 核酸定量儀測(cè)定RNA 濃度；用HiFiScript gDNA Removal cDNA Synthesis 試劑盒，以提取的總RNA 為模版逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并以之為模板，利用輕、重鏈可變區(qū)通用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增；1%瓊脂糖凝膠電泳后回收輕、重鏈可變區(qū)基因片段，連入pMD-18T 載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，挑白斑培養(yǎng)后進(jìn)行菌液PCR 鑒定，陽性克隆送測(cè)序，通過IgBLAST 數(shù)據(jù)庫對(duì)輕、重鏈可變區(qū)序列進(jìn)行比對(duì)和分析。

1.9 抗體特異性鑒定

將純化的GST-CGRPR 融合蛋白、GST-PD1 融合蛋白和GST 標(biāo)簽蛋白進(jìn)行12.5% SDS-PAGE，半干法電轉(zhuǎn)至PVDF 膜上；用5%脫脂奶粉37℃封閉2 h，PBST 洗膜5 次；加入腹水制備的單抗室溫孵育1 h，PBST 洗膜5 次；HRP 標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗室溫孵育1 h，PBST 洗膜后，立即進(jìn)行利用Western 印跡顯影分析。

1.10 抗體親和力測(cè)定

采用非競(jìng)爭(zhēng)ELISA 法測(cè)定2株抗體的親和力常數(shù)[10]。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分別設(shè)定1F9、1F10 抗體對(duì)應(yīng)抗原起始濃度為32、10 μg/mL，1/2 梯度稀釋成5 組濃度，100 μL/孔加入酶標(biāo)板中，4℃包被過夜；次日PBST 洗滌5 次，5%脫脂奶粉37℃封閉2 h；PBST 洗滌5 次，分別加入一抗1F9、1F10，起始濃度均為1000 μg/mL，1/2 梯度稀釋為20個(gè)濃度梯度，100 μL/孔依次加入對(duì)應(yīng)孔內(nèi)，37℃孵育1 h，PBST 洗滌5 次；HRP 標(biāo)記的羊抗鼠IgG 作為二抗37℃孵育1 h，PBST 洗滌5 次；100 μL/孔加入TMB 顯色液進(jìn)行顯色，37℃反應(yīng)10 min；50 μL/孔加入2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，測(cè)定D450nm值。

2 結(jié)果

2.1 重組表達(dá)載體構(gòu)建

將pGEX-4T和CGRPR 胞外區(qū)的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，次日挑取單克隆培養(yǎng)后進(jìn)行菌液PCR 鑒定。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，PCR 產(chǎn)物大小為372 bp，與理論值相符（圖1）；陽性克隆測(cè)序結(jié)果經(jīng)DNAMAN 軟件分析顯示與目的基因序列一致，表明pGEX-4T-CGRPR 胞外區(qū)重組表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.2 目的蛋白純化

GST-CGRPR 胞外區(qū)融合蛋白以包涵體形式表達(dá)，包涵體經(jīng)4、2、0.8 mol/L 尿素及PBS 梯度復(fù)性后用GSTrap FF 柱親和層析，洗脫組分進(jìn)行SDS-PAGE 分析，結(jié)果表明在相對(duì)分子質(zhì)量約42×103處可見特異性蛋白條帶，與目的蛋白理論大小相符（圖2），Gelpro32 軟件分析目的蛋白純度為92.3%，滿足動(dòng)物免疫蛋白純度要求（＞90%）。

2.3 單克隆抗體篩選

圖1 pGEX-4T-CGRPR 胞外區(qū)重組質(zhì)粒菌落PCR 鑒定

圖2 GST-CGRPR 胞外區(qū)蛋白的SDS-PAGE 鑒定

以GST-CGRPR 胞外區(qū)融合蛋白為抗原免疫雌性BALB/c 小鼠，4 次免疫后2周取小鼠尾靜脈血測(cè)定效價(jià)，結(jié)果顯示5只小鼠尾血效價(jià)均大于1∶6400。選擇尾血效價(jià)最高的2 號(hào)鼠（效價(jià)為1∶25 600）進(jìn)行沖擊免疫，3 d后取其脾臟制成細(xì)胞懸液與骨髓瘤細(xì)胞融合，篩選到的陽性細(xì)胞經(jīng)有限稀釋法進(jìn)行3 次克隆化，最后得到2株能穩(wěn)定分泌抗體的陽性細(xì)胞株1F9和1F10。

2.4 抗體亞型分析及細(xì)胞上清效價(jià)測(cè)定

取1F9和1F10細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行抗體亞型鑒定和效價(jià)測(cè)定，結(jié)果顯示2株抗體重鏈和輕鏈均分別為鼠源單抗中最常見的IgG1和κ亞型，而細(xì)胞上清效價(jià)均大于1∶1600（表1）。

2.5 抗體可變區(qū)基因序列分析

培養(yǎng)1F9、1F10細(xì)胞株至增殖期，克隆抗體輕、重鏈可變區(qū)基因分別連入pMD-18T 載體進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)IgBLAST 數(shù)據(jù)庫比對(duì)分析，結(jié)果顯示抗體輕鏈可變區(qū)與IGKV3-12*01 胚系基因同源性均高達(dá)98.3%，重鏈可變區(qū)與IGHV5-4*02 胚系基因同源性分別為98.0%和98.3%。2株抗體輕鏈可變區(qū)序列完全一致，而重鏈僅有1個(gè)氨基酸殘基有差別（表2）。

2.6 抗體制備

1F9、1F10細(xì)胞腹腔注射雌性BALB/c 小鼠制備腹水，ELISA檢測(cè)腹水效價(jià)均達(dá)到105。腹水離心后經(jīng)Protein G 親和層析純化，SDS-PAGE 結(jié)果顯示在相對(duì)分子質(zhì)量25×103和50×103處出現(xiàn)特異性蛋白條帶，與抗體輕、重鏈大小相符，Gelpro32軟件分析表明蛋白純度大于95%（圖3）。

2.7 單抗特異性鑒定

GST-CGRPR 胞外區(qū)融合蛋白、GST 蛋白、GST-PD1 蛋白SDS-PAGE 電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，分別以1F9、1F10 純化抗體為一抗、HRP 標(biāo)記的羊抗鼠IgG 為二抗進(jìn)行Western 印跡，結(jié)果顯示1F9、1F10 抗體只和GST-CGRPR 融合蛋白特異性結(jié)合，與GST 蛋白和GST-PD1 蛋白不結(jié)合（圖4），說明1F9、1F10 抗體特異性地結(jié)合在CGRPR 胞外區(qū)，且結(jié)合表位為線性表位。

表1 抗體亞型及細(xì)胞上清效價(jià)測(cè)定

表2 抗體輕、重鏈可變區(qū)序列分析

2.8 抗體親和力常數(shù)測(cè)定

通過非競(jìng)爭(zhēng)ELISA 測(cè)定抗體1F9和1F10與抗原GST-CGRPR 胞外區(qū)融合蛋白的親和力常數(shù)，如圖5 所示，1F9、1F10 抗體的親和力常數(shù)分別為3.95×10-8、1.49×10-8mol/L。雜交瘤篩選得到的鼠源單克隆抗體親和力常數(shù)一般為10-6～10-9mol/L，1F9和1F10 親和力常數(shù)測(cè)定結(jié)果表明兩者均具有較高的親和力。

3 討論

CGRPR的膜蛋白特性使得我們很難大量獲得CGRPR 全長蛋白[11]，而CGRPR的N端胞外結(jié)構(gòu)域可以與配體CGRP 分子特異性識(shí)別和結(jié)合，所以在本研究中，我們使用CGRPR 蛋白的N端胞外結(jié)構(gòu)域代替全長蛋白作為免疫原來篩選CGRPR特異性單克隆抗體。

圖3 純化抗體1F9和1F10的SDS-PAGE 分析

圖4 1F9和1F10 抗體的Western 印跡

圖5 ELISA 法測(cè)定抗體與抗原的親和力常數(shù)

本研究采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)CGRPR蛋白N端胞外結(jié)構(gòu)域，并通過包涵體復(fù)性和純化得到純度大于90%的重組蛋白來免疫小鼠篩選鼠源單克隆抗體。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)在于能簡(jiǎn)單、快速、大量地制備目的蛋白。本研究也嘗試同時(shí)采用高等真核表達(dá)系統(tǒng)如畢赤酵母及哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)CGRPR 全長N端胞外結(jié)構(gòu)域，但都沒有成功。后續(xù)計(jì)劃通過細(xì)胞和動(dòng)物水平實(shí)驗(yàn)來評(píng)價(jià)用原核表達(dá)抗原篩選到的1F9和1F10 抗體的藥效。

采用雜交瘤技術(shù)制備得到的鼠源單克隆抗體具有親和力高、特異性強(qiáng)、性質(zhì)均一且易于大量生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)實(shí)踐及生命科學(xué)研究中[12]。本研究采用GST-CGRPR 胞外區(qū)融合蛋白作為抗原，通過雜交瘤技術(shù)最終篩選得到兩株高親和力特異性單抗，藥效確證后將通過鼠源抗體人源化改造，如嵌合抗體、CDR 移植或SDR移植來制備全人源抗體。