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    誘導型神經(jīng)干細胞移植抑制顱腦創(chuàng)傷后補體活化的影響

    2019-02-28 03:10:42高謀徐如祥王文佳董勤丁柏勻姚慧楊志軍
    關鍵詞:補體神經(jīng)細胞腦組織

    高謀 徐如祥 王文佳 董勤 丁柏勻 姚慧 楊志軍

    補體系統(tǒng)是免疫系統(tǒng)的重要組成部分,補體系統(tǒng)激活可產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)介導顱腦創(chuàng)傷(traumatic brain injury,TBI)后炎癥反應,也可形成補體膜攻擊復合物(C5b-9)加重神經(jīng)細胞損傷[1,2]。近年來,研究發(fā)現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)內(nèi)星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞可表達補體調(diào)節(jié)分子 Crry、Cd46、Cd59a和 Cd55,減輕補體活化介導的細胞損傷[3,4]。然而,由于神經(jīng)細胞選擇性低表達補體調(diào)節(jié)分子,因此其易遭受補體系統(tǒng)的攻擊[3,4]。此外,在CNS疾病模型的腦組織中少見補體調(diào)節(jié)分子表達,而可見大量補體活化產(chǎn)物C3d和C5b-9沉積于神經(jīng)細胞上,因而調(diào)控TBI后補體活化可減輕補體介導的神經(jīng)細胞損傷[3-5]。筆者曾報道經(jīng)立體定向顱內(nèi)移植的誘導型神經(jīng)干細胞(induced neural stem cells,iNSCs)可通過調(diào)控小膠質(zhì)細胞活化狀態(tài),抑制反應性星形膠質(zhì)細胞增生,抑制TBI后炎癥反應,為神經(jīng)細胞存活創(chuàng)造適宜的微環(huán)境[6,7]。然而,目前國內(nèi)外少有研究報道iNSCs移植對TBI后補體活化的調(diào)節(jié)作用。為此,本研究用自由落體腦打擊裝置制備C57BL/6小鼠TBI模型,并將C57BL/6小鼠iNSCs經(jīng)靜脈注射到TBI小鼠體內(nèi),觀察腦組織中C3d和NeuN抗體雙陽性、C5b-9和NeuN抗體雙陽性、C3d和Map2抗體雙陽性以及C5b-9和Map2抗體雙陽性的神經(jīng)細胞的分布情況,并用流式細胞儀檢測經(jīng)TBI小鼠血清處理后iNSCs表達補體調(diào)節(jié)分子的水平,探討經(jīng)靜脈移植iNSCs對TBI后補體活化的作用及分子機制,現(xiàn)報道如下。

    材料與方法

    一、實驗動物

    健康成年雄性C57BL/6小鼠40只,8~10周齡,體質(zhì)量24~30 g,所有實驗動物(無特定病原體級)均購自北京維通利華公司。

    二、主要實驗儀器和試劑

    儀器:CO2細胞培養(yǎng)箱(Thermo公司,美國),超凈工作臺(ESCO公司,美國),倒置相差顯微鏡、CM1950冰凍切片機、TCS SP5Ⅱ激光共聚焦顯微鏡和DM3000熒光顯微鏡(Leica公司,德國),C6流式細胞儀(BD Biosciences公司,美國)。

    試劑:DMEM/F12培養(yǎng)基、Neurobasal培養(yǎng)基、B27、堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)、Accutase 酶、左旋谷酰胺和磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution,PBS)(Invitrogen 公司,美國),牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)(Sigma 公司,美國),C3d 抗體(工作濃度:5 μg/mL)(R&D Systems公司,美國),C5b-9 抗體(工作濃度:2 μg/mL)、Map2 抗體(工作濃度:2 μg/mL)、Cd46 抗體(工作濃度:10 μg/mL) 和兔 IgG,polyclonal Isotype Control抗體(工作濃度:10 μg/mL)(Abcam 公司,美國),NeuN 抗體 (工作濃度:5 μg/mL)(Millipore 公司,美國),Alexa Fluor?555標記驢抗山羊C3d抗體(工作濃度:2 μg/mL)、Alexa Fluor?555 標記山羊抗兔 C5b-9 抗體(工作濃度:2 μg/mL)、Alexa Fluor?633標記山羊抗雞 Map2抗體 (工作濃度:2 μg/mL)和Alexa Fluor?633標記山羊抗小鼠NeuN抗體(工作濃度:2 μg/mL)(Life Tech 公司, 美國),4’,6-二脒基-2-苯 基 吲 哚 (4’,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)(SouthernBiotech 公司,美國),Crry 抗體(工作濃度:5 μg/mL)、 大鼠 IgG2α,κ Isotype Control抗體(工作濃度:5 μg/mL)和APC標記山羊抗大鼠IgG抗體 (工作濃度:2 μg/mL)、PE 標記倉鼠抗小鼠Cd55抗體 (工作濃度:2 μg/mL)和 PE標記倉鼠IgG3,λ1 Isotype Control抗體 (工作濃度:2 μg/mL)(BD Biosciences公司,美國),APC標記山羊抗兔IgG 抗體(工作濃度:5 μg/mL)(Thermo 公司,美國),PE標記抗小鼠Cd59a抗體 (工作濃度:2 μg/mL)和PE標記小鼠IgG1,κ Isotype Control抗體 (工作濃度:2 μg/mL)(Biolegend 公司, 美國),PE 標記倉鼠抗小鼠 Cd55抗體(工作濃度:2 μg/mL)和 PE標記倉鼠 IgG3,λ1 Isotype Control抗體(工作濃度:2 μg/mL)(Biolegend 公司,美國)。

    三、C57BL/6小鼠iNSCs體外培養(yǎng)

    C57BL/6小鼠 iNSCs用含 2%B27、20 ng/mL bFGF、20 ng/mL EGF、0.05%BSA 和 2 mmol/L 左旋谷酰胺的DMEM/F12與Neurobasal等體積混合培養(yǎng)基培養(yǎng)。

    四、C57BL/6小鼠TBI模型制備和iNSCs移植

    用異氟烷氣體麻醉劑麻醉小鼠,并將其固定于腦立體定向儀上,備皮消毒,鋪無菌洞巾,切開皮膚,暴露前囟,以lambda縫向喙側2.0 mm、中線偏右側2.0 mm為撞擊點。用自由落體腦打擊裝置,撞針直徑3.0 mm,制備TBI模型。設置假手術(sham)組(10只),僅切開頭皮,不實施撞擊。于傷后1 h對TBI小鼠進行神經(jīng)功能缺損評分 (neurologicalseverityscore,NSS),將 NSS 為 4~8 分者(30 只)納入 TBI組,按照隨機數(shù)字表法選取10只用于制備TBI小鼠血清和熱滅活TBI小鼠血清;余下20只按照隨機數(shù)字表法分為:iNSCs移植組(10只)和 PBS處理組(10只)。于TBI后12 h,用Accutase酶消化法制備iNSCs單細胞懸液,并用PBS漂洗3遍,用PBS重懸細胞,并分別將200 μL含5×106個iNSCs單細胞懸液或等體積PBS經(jīng)尾靜脈注射到TBI小鼠體內(nèi)。

    五、腦組織冰凍切片、病理染色和雙重免疫熒光染色

    細胞移植后7 d采用隨機數(shù)字表法從各組中選取6只動物進行處死,灌注固定后取出大腦,并作大腦冠狀面連續(xù)冰凍切片,切片厚度為10 μm。用蘇木素-伊紅染色觀察腦組織病理形態(tài)學特征。根據(jù)病理染色結果挑選腦組織切片進行雙重免疫熒光染色,用10%BSA/0.3%TritonX-100封閉1 h后,分別加入 C3d 抗體(工作濃度:5 μg/mL)、C5b-9 抗體(工作濃度:2 μg/mL)、Map2 抗體 (工作濃度:2 μg/mL)和NeuN 抗體(工作濃度:5 μg/mL)在 4℃孵育過夜。用PBS漂洗后,分別加入Alexa Fluor?555標記驢抗山羊 C3d 抗體 (工作濃度:2 μg/mL)、Alexa Fluor?555標記山羊抗兔C5b-9抗體(工作濃度:2 μg/mL)、Alexa Fluor?633標記山羊抗雞Map2抗體(工作濃度:2 μg/mL) 和 Alexa Fluor?633標記山羊抗小鼠NeuN 抗體(工作濃度:2 μg/mL),室溫避光孵育 2 h。用DAPI染細胞核,封片后,在熒光顯微鏡下觀察,在20×鏡下隨機選取6個視野,計數(shù)陽性細胞數(shù)(特異性抗體標記)和總細胞數(shù)(DAPI標記),陽性細胞百分率(%)=陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

    六、流式細胞儀檢測

    于TBI后12 h,分別制備TBI小鼠血清和熱滅活TBI小鼠血清。用Accutase酶消化法制備iNSCs單細胞懸液,用PBS漂洗后離心棄去上清,分別用250 μL的TBI小鼠血清和熱滅活TBI小鼠血清重懸細胞,接種于24孔板(細胞密度為1×105個/孔),置于37℃培養(yǎng)箱中處理45 min。隨后收集細胞懸液,離心后棄去上清。用PBS漂洗3次,分別加入Crry 抗體 (工 作 濃度 :5 μg/mL)、 大 鼠 IgG2α,κ Isotype Control抗體(工作濃度:5 μg/mL)和 APC 標記山羊抗大鼠 IgG抗體(工作濃度:2 μg/mL),避光放置在4℃冰箱。反應20~30 min后,用PBS漂洗3次,并用PBS重懸細胞。用C6流式細胞儀檢測,每個樣品收集10 000~20 000個細胞。計算平均熒光強度分析iNSCs表達Crry水平。

    七、統(tǒng)計學分析

    采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學分析。小鼠腦內(nèi)C3d和NeuN抗體雙陽性、C5b-9和NeuN抗體雙陽性、C3d和Map2抗體雙陽性以及C5b-9和Map2抗體雙陽性的神經(jīng)細胞數(shù)量以及iNSCs中Crry平均熒光強度以均數(shù)±標準差(±s)表示,資料先進行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗,2組間比較采用獨立樣本t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析,各組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    結 果

    一、INSCs移植物抑制 TBI小鼠腦內(nèi) C3d和C5b-9沉積于NeuN和Map2抗體陽性的神經(jīng)細胞

    在TBI后7 d,sham組小鼠腦組織中少見C3d和NeuN抗體雙陽性、C5b-9和NeuN抗體雙陽性、C3d和Map2抗體雙陽性以及C5b-9和Map2抗體雙陽性的神經(jīng)細胞(圖1)。與之相比,TBI小鼠腦組織中明顯可見C3d和C5b-9沉積于NeuN和Map2抗體陽性的神經(jīng)細胞 (圖1)。經(jīng)統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn):與sham組相比,PBS處理組和iNSCs移植組小鼠腦組織中C3d和NeuN抗體雙陽性、C5b-9和NeuN抗體雙陽性、C3d和Map2抗體雙陽性以及 C5b-9和Map2抗體雙陽性的神經(jīng)細胞數(shù)量明顯增加,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與 PBS 處理組相比,iNSCs移植組小鼠腦組織中C3d和NeuN抗體雙陽性、C5b-9和NeuN抗體雙陽性、C3d和Map2抗體雙陽性以及C5b-9和Map2抗體雙陽性的神經(jīng)細胞數(shù)量明顯減少,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(表 1)。

    圖1 顱腦損傷7 d后的PBS處理組、iNSCs移植組和sham組小鼠腦組織雙重免疫熒光染色檢測(×400)

    二、流式細胞儀檢測iNSCs表達補體調(diào)節(jié)分子水平

    TBI小鼠血清組和熱滅活TBI小鼠血清組中iNSCs表達補體調(diào)節(jié)分子Cd46、Cd59a和Cd55水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與熱滅活TBI小鼠血清組相比,TBI小鼠血清組中iNSCs表達補體調(diào)節(jié)分子Crry水平明顯上調(diào),差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(表 2)。

    討 論

    TBI是CNS損傷性疾病,其流行病學特點呈現(xiàn)為高發(fā)病率和高致死、致殘率,嚴重危害人類生命健康[8]。有研究表明,TBI后繼發(fā)性腦損傷是由多種因素參與的復雜病理過程,直接影響患者預后,如何有效防治TBI后繼發(fā)性腦損傷是醫(yī)學研究的熱點和難點[8,9]。補體系統(tǒng)作為免疫系統(tǒng)的重要組成部分,可參與機體的免疫調(diào)節(jié)和病理損傷反應,因此調(diào)控TBI后補體活化可減輕補體介導的神經(jīng)細胞損傷,為防治TBI后繼發(fā)性腦損傷提供幫助[10,11]。目前,調(diào)控補體活化的方法主要是補體抑制劑和基因靶向藥物的應用,然而其抑制TBI后補體活化的療效并不理想[12,13]。為此,本課題組探討了iNSCs移植對TBI后補體活化的影響,結果發(fā)現(xiàn):與既往文獻報道相符,在正常動物CNS內(nèi),即在sham組小鼠腦組織中,補體活化產(chǎn)物C3d和C5b-9表達量較低[14,15]。而當CNS損傷后,即在TBI小鼠腦組織中,可觀察到大量補體活化產(chǎn)物C3d和C5b-9沉積于神經(jīng)細胞上。補體活化產(chǎn)物C3d和C5b-9來源廣泛,可從外周血液循環(huán)中經(jīng)功能紊亂的血腦屏障滲漏,也可由浸潤的免疫細胞或CNS內(nèi)固有細胞合成[5]。此外,本研究發(fā)現(xiàn),各組內(nèi)NeuN陽性和Map2陽性的神經(jīng)細胞上沉積的補體活化產(chǎn)物C3d和C5b-9具有一致性,說明TBI后神經(jīng)細胞的胞體與軸突均遭受補體系統(tǒng)的攻擊。值得注意的是,接受經(jīng)靜脈移植iNSCs的TBI小鼠腦組織中,NeuN陽性和Map2陽性的神經(jīng)細胞上沉積的補體活化產(chǎn)物C3d和C5b-9均明顯少于接受PBS處理的TBI小鼠。由此可見,iNSCs移植物可抑制TBI后補體活化,減輕補體活化對神經(jīng)細胞的損傷。

    為探討經(jīng)靜脈移植iNSCs抑制TBI后補體活化的分子機制,本研究制備了TBI小鼠血清和缺乏補體活性成分的熱滅活TBI小鼠血清分別在體外處理iNSCs,而后用流式細胞儀檢測iNSCs表達補體調(diào)節(jié)分子的水平。與既往文獻報道“干細胞可表達補體受體 CR2、C3aR和 C5aR以及補體調(diào)節(jié)分子 Crry、Cd46、Cd55和Cd59”一致,本研究發(fā)現(xiàn) TBI小鼠血清處理后,iNSCs表達補體調(diào)節(jié)分子Crry的水平明顯上調(diào)[16,17]。Crry是嚙齒類動物調(diào)節(jié)補體活化的重要成分,類似于人類補體調(diào)節(jié)分子Cd46和Cd55[18,19]??梢奀rry具有抑制C3轉化酶的作用,從而調(diào)控補體系統(tǒng)激活,并減少下游補體活化產(chǎn)物C3d和C5b-9的形成[20-22]。本研究結果提示:經(jīng)靜脈移植iNSCs可能通過增加Crry的表達量,發(fā)揮抑制補體活化的作用。此外,經(jīng)TBI小鼠血清處理的iNSCs選擇性上調(diào)Crry的表達量也是本研究的新發(fā)現(xiàn)。

    表1 顱腦損傷7 d后的各組小鼠腦內(nèi)特異性抗體標記細胞的百分率(±s,%)

    表1 顱腦損傷7 d后的各組小鼠腦內(nèi)特異性抗體標記細胞的百分率(±s,%)

    與 sham 組比較,aP<0.05;與 iNSCs移植組比較,bP<0.05

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    表2 流式細胞儀檢測iNSCs表達補體調(diào)節(jié)分子的水平

    綜上所述,經(jīng)靜脈移植iNSCs可抑制TBI后補體活化,減少補體活化產(chǎn)物C3d和C5b-9沉積于神經(jīng)細胞的胞體和軸突,從而減輕補體活化介導的神經(jīng)損傷。通過體外實驗,筆者注意到iNSCs可接受TBI小鼠血清刺激,選擇性上調(diào)補體調(diào)節(jié)分子Crry的表達量,而理論上補體調(diào)節(jié)分子Crry可發(fā)揮抑制補體活化,減少補體活化產(chǎn)物C3d和C5b-9形成的作用,為進一步探討經(jīng)靜脈移植iNSCs抑制TBI后補體活化的作用機制提供了新的方向。因此,在后續(xù)研究中,筆者仍將重點關注iNSCs選擇性上調(diào)補體調(diào)節(jié)分子Crry表達量的分子機制,以及Crry表達量與TBI后補體活化水平間的量效關系,進而揭示iNSCs移植物抑制TBI后補體活化的分子機制。

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