諾麗莖段愈傷組織誘導(dǎo)優(yōu)化及細(xì)胞懸浮系的建立

鄒瑞，藍(lán)增全，吳田，賈丹丹，楊自云

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諾麗莖段愈傷組織誘導(dǎo)優(yōu)化及細(xì)胞懸浮系的建立

鄒瑞1，藍(lán)增全2，吳田1，賈丹丹1，楊自云1

1 西南林業(yè)大學(xué) 園林學(xué)院 國家林業(yè)局西南風(fēng)景園林工程技術(shù)研究中心，云南 昆明 650224 2 西南綠色發(fā)展研究院，云南 昆明 650224

鄒瑞, 藍(lán)增全, 吳田, 等. 諾麗莖段愈傷組織誘導(dǎo)優(yōu)化及細(xì)胞懸浮系的建立.生物工程學(xué)報(bào), 2019, 35(2): 298–306.Zou R, Lan ZQ, Wu T, et al. Optimization of noni callus induction and establishment of callus suspension system. Chin J Biotech, 2019, 35(2): 298–306.

為獲取諾麗莖段中的次生代謝物并為建立遺傳轉(zhuǎn)化體系奠定基礎(chǔ)，以諾麗莖段(無腋芽)為外植體誘導(dǎo)愈傷組織，并建立細(xì)胞懸浮系，對影響愈傷組織的誘導(dǎo)及細(xì)胞懸浮系的因子進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：愈傷組織誘導(dǎo)的最優(yōu)培養(yǎng)基是MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L 2,4-D；懸浮培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L 2,4-D+3%蔗糖，pH為5.85，當(dāng)初始接種量為37.5 g/L、搖床轉(zhuǎn)速為110 r/min且(25±2)℃ 暗培養(yǎng)時，懸浮細(xì)胞生長良好，生長速率最大；諾麗莖段懸浮細(xì)胞生長曲線呈“S”型，最適繼代周期為12–20 d；培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基的pH呈先下降后緩慢升高的變化趨勢，諾麗莖段愈傷組織懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的最適pH在4.5–5.0之間。文中成功建立了以諾麗莖段為外植體的穩(wěn)定的細(xì)胞懸浮系。

諾麗，莖段，愈傷組織，細(xì)胞懸浮系，生長曲線

諾麗 (Linn.) 又稱海巴戟、諾尼、蘿梨、印桑椹、四季果等[1]，是一種常綠多年生闊葉小喬木、灌木，茜草科 (Rubiales)巴戟天屬 () 植物[2]，它的樹皮可提取黃色染料，皮中含有袖木醒二酚 (Soranjidiol)、巴戟醌 (Morindone)，印度尼西亞民間作藥用[3]。樹皮的提取物用于治療風(fēng)濕、發(fā)熱、創(chuàng)傷、潰瘍、腫瘤[4]。然而諾麗在全球分布都十分稀少，國外主要分布在南太平洋諸島，在夏威夷、印度、印度尼西亞、馬來西亞及中南美洲等國家地區(qū)都有生長[5-6]，在我國僅分布于少數(shù)幾個地方如海南省、西沙群島及臺灣地區(qū)，近年來在云南省進(jìn)行引種栽培，并在云南熱帶地區(qū)引種成功[7]。諾麗陸續(xù)在植物組織培養(yǎng)方面取得一些研究進(jìn)展，如黃騏以諾麗種子為試料進(jìn)行誘導(dǎo)不定芽生根研究[8]；吳田用諾麗莖尖及帶芽莖段作為外植體進(jìn)行離體培養(yǎng)，成功建立了諾麗離體再生體系[9]；潘曉晴以不含腋芽的諾麗莖段薄片為外植體進(jìn)行離體培養(yǎng)研究[10]。

諾麗莖段中富含袖木醒二酚、巴戟醌等次生代謝物，這些次生代謝物有治療風(fēng)濕、發(fā)熱、創(chuàng)傷、潰瘍、腫瘤等作用。提取植物有效成分，同時不對植株本身造成損害，可以在建立諾麗莖段細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系的基礎(chǔ)上進(jìn)行誘導(dǎo)。另外，植物懸浮細(xì)胞是遺傳轉(zhuǎn)化理想的受體之一，建立穩(wěn)定的細(xì)胞懸浮系對遺傳轉(zhuǎn)化起到巨大促進(jìn)作用。植物細(xì)胞培養(yǎng)將常規(guī)植物育種技術(shù)與細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合，可以獲得常規(guī)技術(shù)無法得到的種質(zhì)材料，縮短育種周期，提高育種效率，同時植物細(xì)胞的全能性使得懸浮細(xì)胞培養(yǎng)再生植株具有母本優(yōu)良性狀，采用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)保存植物種質(zhì)節(jié)省人力物力的同時避免不可預(yù)測因素對種質(zhì)資源造成的損失。本研究擬在諾麗莖段愈傷組織誘導(dǎo)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行細(xì)胞懸浮系的建立，為后續(xù)次生代謝物的誘導(dǎo)和遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所用外植體為西南林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院組培室的諾麗無菌組培苗，組培苗每90 d左右繼代一次，繼代培養(yǎng)基為MS+0.2 mg/L NAA。

1.2 方法

1.2.1 愈傷組織的誘導(dǎo)

無菌苗剪去葉片，去除莖段兩端腋芽，取莖段中間部分切成2 mm的薄片，平放于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上 (表1)，30 d后將誘導(dǎo)出的愈傷組織轉(zhuǎn)接至原培養(yǎng)基中繼續(xù)增殖培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中每5 d觀察1次，30 d后統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)物的形態(tài)、顏色、生長情況、愈傷組織誘導(dǎo)率。愈傷組織誘導(dǎo)率=(產(chǎn)生愈傷組織外植體數(shù)∕接種外植體數(shù))×100%。數(shù)據(jù)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行計(jì)算和單因素方差分析及獨(dú)立樣本檢驗(yàn)，顯著水平<0.05。

1.2.2 愈傷組織的增殖

挑取黃綠色、松散性好、活性高的愈傷組織接種于原培養(yǎng)基上繼代增殖培養(yǎng)。

表1 諾麗莖段愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中激素的種類與濃度配比

6-BA: 6-benzylaminopurine; 2,4-D: 2,4-dichlorophenoxyacetic acid;NAA:1-naphthalene acetic acid.

1.2.3 諾麗懸浮系的建立

選取黃綠色、分散性好且質(zhì)地疏松的繼代愈傷組織，用鑷子輕輕夾碎后接種在液體培養(yǎng)基中，每250 mL的培養(yǎng)瓶中加入液體培養(yǎng)基50?100 mL，pH為5.85，搖床轉(zhuǎn)速為110 r/min，溫度 (25±2) ℃，暗培養(yǎng)。懸浮初期，除去大細(xì)胞團(tuán)，保留分散程度良好的小細(xì)胞團(tuán)和單細(xì)胞，每隔10 d繼代1次按1∶2的體積轉(zhuǎn)入新鮮培養(yǎng)液，連續(xù)繼代5?8次逐漸形成穩(wěn)定的懸浮細(xì)胞系。

1) 不同起始接種量對諾麗懸浮細(xì)胞生長的影響。將不同重量 (12.5、25、37.5、62.5 g/L) 諾麗莖段誘導(dǎo)出的愈傷組織接種到液體培養(yǎng)基中，每種處理接種5瓶液體培養(yǎng)基，20 d后計(jì)算細(xì)胞生長速度，接種量和收獲量以濕細(xì)胞鮮重計(jì)，取2 mL培養(yǎng)液，4 ℃、5 000 r/min離心5 min，棄去上清液，稱量底部沉淀細(xì)胞鮮重，細(xì)胞生長速度以比生長速率計(jì)。

2) 細(xì)胞形態(tài)觀察。培養(yǎng)液搖勻，取一滴培養(yǎng)液于倒置光學(xué)顯微鏡下觀測細(xì)胞生長情況。

3) 培養(yǎng)液pH值的測定。采用pH儀測定懸浮培養(yǎng)液pH值，使用前經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)試劑液校準(zhǔn)，每2 d測定一次培養(yǎng)液pH值，繪制pH曲線。

4) 細(xì)胞生長曲線的測定。用血球計(jì)數(shù)板法檢測細(xì)胞數(shù)。培養(yǎng)過程中，每2 d取懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，先用5%鉻酸對細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行處理，使其分散均勻，持續(xù)檢測，取平均值繪制細(xì)胞懸浮生長曲線。

1.2.4 TTC法測定細(xì)胞活力

1) TTC染色所需藥品配置

磷酸鹽緩沖液 (pH 7.0，0.1 mmol/L)：稱取磷酸氫二鈉3.12 g溶于無菌蒸餾水，定容至100 mL；稱取磷酸二氫鈉7.17 g溶于無菌蒸餾水，定容至100 mL；取30.5 mL磷酸氫二鈉溶液與19.5 mL磷酸二氫鈉溶液充分混合。

0.4% TTC溶液：0.4 g紅四氮唑溶于少量乙醇，加入磷酸鹽緩沖液，定容至100 mL。

2) TTC染色

用TTC法測定細(xì)胞活力。每3 d取諾麗莖段懸浮細(xì)胞液，抽濾去除培養(yǎng)液并用蒸餾水沖洗以去除培養(yǎng)基。用濾紙吸取細(xì)胞上的水分，稱取200 mg (鮮重) 細(xì)胞置于10 mL離心管中，向離心管中加入2.5 mL 0.4% TTC溶液，并加入2.5 mL pH 7.0的磷酸緩沖液混勻，靜止25 ℃暗處理13–16 h，細(xì)胞會變成紅色，棄上清，加入蒸餾水洗滌3?5次，加入5 mL 95%的乙醇，置60 ℃水浴30 min，其間輕搖試管1?2次，靜止于室溫下至細(xì)胞完全無色，取上清在分光光度計(jì)上于485 nm處測吸光值 (Abs)，初始培養(yǎng)基按以上程序操作為空白對照。

1.2.5 細(xì)胞存活率的測定

懸浮細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，取少量懸浮細(xì)胞，先用5%鉻酸對細(xì)胞懸液進(jìn)行處理，使其分散均勻，再用0.1%的酚藏花紅染色液染色，活細(xì)胞無色或僅有液泡呈淡淡的紅色，死細(xì)胞核和細(xì)胞碎片被染成紅色。顯微鏡下計(jì)數(shù)500個懸浮細(xì)胞，計(jì)算活細(xì)胞所占的比例。懸浮細(xì)胞存活率(%)=(活細(xì)胞總數(shù)/懸浮細(xì)胞總數(shù))×100%。

1.2.6 平板培養(yǎng)及懸浮細(xì)胞植株再生

將滅菌后的培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿1/2處，待培養(yǎng)基凝固后，將穩(wěn)定的懸浮培養(yǎng)液接種于培養(yǎng)基上，再將40 ℃的培養(yǎng)基覆蓋一層在接種的細(xì)胞上。將諾麗莖段細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液接種于MS+2.0 mg/L 2,4-D+0.1 mg/L 6-BA培養(yǎng)基上誘導(dǎo)分化愈傷組織，再將分化出的愈傷組織轉(zhuǎn)接至MS+1.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化不定根不定芽。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素組合對莖愈傷組織誘導(dǎo)影響及增殖

采用6種培養(yǎng)基對諾麗莖段愈傷組織進(jìn)行誘導(dǎo) (表2)，在6-BA和NAA配合使用的培養(yǎng)基上，可誘導(dǎo)出綠色愈傷組織 (圖1A)，質(zhì)地堅(jiān)硬緊實(shí)，誘導(dǎo)的同時伴隨植株分化；在6-BA和2,4-D配合使用的培養(yǎng)基上，可誘導(dǎo)出疏松愈傷組織 (圖1B、C、E)，當(dāng)6-BA濃度一定時，愈傷組織長勢隨2,4-D的增加而逐漸變差。綜合誘導(dǎo)率、愈傷組織長勢和分化能力的因素，諾麗莖段誘導(dǎo)愈傷組織最佳培養(yǎng)基為MS+2.0 mg/L 2,4-D+0.1 mg/L 6-BA，將愈傷組織代入原培養(yǎng)基可繼代增殖 (圖2)。

表2 不同培養(yǎng)基配方對諾麗莖段愈傷組織誘導(dǎo)的影響

+ Callus growth is poor; ++ Callus growth is general; +++ Callus growth is well; ++++ Callus growth is best. There were significant differences between different lower-case letters in the same column (<0.05), but no significant differences between the same letters (>0.05).

圖1 諾麗莖段愈傷組織誘導(dǎo)

圖2 諾麗莖段愈傷組織繼代

2.2 諾麗莖段懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的研究

2.2.1 不同初始接種量對諾麗根、莖、葉懸浮細(xì)胞生長影響

諾麗莖段懸浮細(xì)胞接種量低于25 g/L時，懸浮細(xì)胞生長速度較低，接種量37.5 g/L時懸浮細(xì)胞生長速度高 (圖3)，當(dāng)懸浮細(xì)胞接種量高達(dá)62.5 g/L，細(xì)胞生長速率較低。因此諾麗莖段懸浮細(xì)胞在液體培養(yǎng)基中接種量以37.5 g/L為宜。

2.2.2 莖段懸浮細(xì)胞形態(tài)觀察

諾麗莖段為外植體的懸浮細(xì)胞，初代多為規(guī)則型桿狀細(xì)胞 (圖4)，隨著繼代次數(shù)的增加，在第6代后為20個左右小細(xì)胞團(tuán)居多，形態(tài)穩(wěn)定。

2.2.3 懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液pH的變化曲線

諾麗莖段懸浮細(xì)胞培養(yǎng)過程中pH變化近似“V”形曲線 (圖5)。整個實(shí)驗(yàn)過程中培養(yǎng)液的pH值在小范圍內(nèi)呈先下降后緩慢升高的變化趨勢。在接種后1?12 d的范圍內(nèi)pH不斷下降，從5.85降到最低點(diǎn)4，此時細(xì)胞增殖緩慢；隨后進(jìn)入對數(shù)生長期，pH值逐漸回升；pH在4.5?5.0范圍內(nèi)細(xì)胞增殖最快，而后培養(yǎng)液的pH仍在緩慢增加。有可能是諾麗莖段懸浮細(xì)胞產(chǎn)生的大量代謝物使培養(yǎng)液的pH值升高。

2.2.4 諾麗莖段細(xì)胞懸浮生長曲線

諾麗莖段細(xì)胞懸浮系，在0?6 d細(xì)胞數(shù)目增長不明顯 (圖6)，生長緩慢，此時為停滯期；在6?12 d進(jìn)入對數(shù)生長期，懸浮細(xì)胞狀態(tài)良好，具有較高的活力，細(xì)胞數(shù)目急劇增加；在6?20 d進(jìn)入直線生長期，細(xì)胞數(shù)量達(dá)到峰值22.6×104個/mL，后增長減緩，直至下降。

圖3 諾麗莖段不同初始接種量對細(xì)胞懸浮培養(yǎng)影響

圖4 諾麗莖段懸浮細(xì)胞不同培養(yǎng)時期倒置顯微鏡觀察圖(×100)

圖5 諾麗莖段懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液pH值變化

圖6 諾麗莖段細(xì)胞懸浮生長曲線

2.2.5 細(xì)胞活力測定

對諾麗懸浮細(xì)胞活力曲線進(jìn)行測定，細(xì)胞新陳代謝越旺盛其485值越高 (圖7A)，且細(xì)胞呈深紅色 (圖7B)。以莖段為外植體的懸浮細(xì)胞，值隨培養(yǎng)時間的增加而增加，在第18天達(dá)到最大1.9，隨后緩慢下降。

綜上，細(xì)胞懸浮生長曲線、懸浮液pH值、細(xì)胞活力曲線之間存在一定對應(yīng)關(guān)系。諾麗莖段細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液細(xì)胞生長曲線在18 d達(dá)到峰值，數(shù)量為18.97×104個/mL，而此時懸浮液的pH值下降后回升至pH值5.52，用細(xì)胞存活力在第18天細(xì)胞活力值最大485=1.9，對應(yīng)了細(xì)胞生長曲線與pH，此時期細(xì)胞懸浮液生長狀態(tài)較好。

2.2.6 細(xì)胞存活力測定

細(xì)胞懸浮培養(yǎng)在繼代5?8次以后，形成穩(wěn)定的懸浮培養(yǎng)液，將培養(yǎng)結(jié)束的穩(wěn)定懸浮培養(yǎng)液進(jìn)行細(xì)胞存活力測定，染色后活細(xì)胞無色 (圖8)，死細(xì)胞呈紅色，以莖段為外植體的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)細(xì)胞存活力達(dá)到78.8%。說明培養(yǎng)懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)基和繼代周期可行。

2.2.7 懸浮細(xì)胞平板培養(yǎng)

將諾麗莖段細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液，接種于MS+ 2.0 mg/L 2,4-D+0.1 mg/L 6-BA培養(yǎng)基上，25 d誘導(dǎo)分化出嫩黃色泥狀愈傷組織 (圖9)。

圖7 諾麗莖段懸浮細(xì)胞活力測定

圖8 諾麗懸浮細(xì)胞染色后活細(xì)胞和死細(xì)胞

圖9 諾麗莖段細(xì)胞懸浮液的平板培養(yǎng)

3 結(jié)論與討論

不同植物激素及濃度對愈傷組織的誘導(dǎo)的影響差別較大，其中2,4-D和6-BA對愈傷組織的誘導(dǎo)必不可少，這與張志強(qiáng)等[11]誘導(dǎo)諾麗愈傷組織最適激素組合一致，但培養(yǎng)基的種類不同，他們采用的是B5培養(yǎng)基而在本實(shí)驗(yàn)中采用的是MS培養(yǎng)基，這與實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌嘘P(guān)，用B5培養(yǎng)基更利于次生代謝產(chǎn)物的積累[12]，而我們更關(guān)注穩(wěn)定的細(xì)胞懸浮系的產(chǎn)生，以利于后續(xù)用細(xì)胞懸浮系進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。此外，張志強(qiáng)等用的外植體是田間諾麗苗頂芽的葉脈，不僅需要消毒步驟，而且可取材范圍較窄，而本課題組有大批量可用的諾麗無菌試管苗，幾乎所有的莖段都可以作為本實(shí)驗(yàn)外植體，取材范圍廣。當(dāng)6-BA的濃度為1 mg/L時，隨著2,4-D濃度的增大，會對愈傷組織誘導(dǎo)及生長產(chǎn)生抑制作用，愈傷組織生長緩慢且易老化，與呂冬霞等[13]的研究結(jié)果一致。同時，當(dāng)2,4-D濃度為0.1 mg/L時，隨著6-BA濃度的增大，愈傷組織的生長速度不會減慢，愈傷組織的老化程度加快。因此，0.1 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA為誘導(dǎo)諾麗莖段愈傷組織的最佳濃度組合。

采用適宜的接種量對建立穩(wěn)定的懸浮培養(yǎng)體系起關(guān)鍵性作用[14-18]。懸浮培養(yǎng)體系的增殖速率與初始接種量密切相關(guān)，接種量過低或過高均不利于懸浮細(xì)胞的生長和增殖。初始接種量過低，限制了增長量；反之，過高，則可能由于細(xì)胞團(tuán)過多而造成培養(yǎng)基養(yǎng)分不足或過多有害分泌物積累而限制了細(xì)胞的快速分裂與生長[19-20]。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，諾麗莖段懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的最適宜接種量為37.5 g/L，當(dāng)接種量達(dá)到62.5 g/L時，細(xì)胞生長量顯著降低。

本研究對諾麗莖段進(jìn)行細(xì)胞懸浮培養(yǎng)研究，獲得了諾麗莖段穩(wěn)定的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液，后續(xù)可對諾麗細(xì)胞懸浮系進(jìn)行次生代謝物的誘導(dǎo)，同時與諾麗植株本身的功能性物質(zhì)相對比，以及建立諾麗細(xì)胞懸浮培養(yǎng)動力學(xué)模型。穩(wěn)定的諾麗細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液可再生愈傷組織及外植體，從單細(xì)胞直接進(jìn)行轉(zhuǎn)化，這將成為諾麗遺傳轉(zhuǎn)化的優(yōu)良受體材料，為諾麗遺傳轉(zhuǎn)化高頻轉(zhuǎn)化體系奠定了基礎(chǔ)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)擬采用真菌[21-22]、寡糖類物質(zhì)[23]及重金屬離子[24]等誘導(dǎo)因子在諾麗莖段愈傷組織建立的細(xì)胞懸浮系中，以誘導(dǎo)袖木醒二酚、巴戟醌等物質(zhì)。最新研究發(fā)現(xiàn)，采用復(fù)合誘導(dǎo)子誘導(dǎo)處理其他植物細(xì)胞時可以合成更高含量的生物活性物質(zhì)，這可能得益于復(fù)合誘導(dǎo)子具有協(xié)同增效的作用，起到增強(qiáng)誘導(dǎo)能力的效果[25-26]。此外，后續(xù)擬將穩(wěn)定生長的諾麗細(xì)胞懸浮系，經(jīng)短暫離心后直接用于遺傳轉(zhuǎn)化，后接種于篩選培養(yǎng)基上。具體的方法、結(jié)論有待進(jìn)一步研究。

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Optimization of noni callus induction and establishment of callus suspension system

Rui Zou1, Zengquan Lan2, Tian Wu1, Dandan Jia1, and Ziyun Yang1

1 Southwest Landscape Architecture Engineering Research Center of State Forestry Administration, College of Horticulture and Gardening, Southwest Forestry University, Kunming 650224, Yunnan, China 2 Southwest Institute of Green Development, Kunming 650224, Yunnan, China

The aim of the study was to obtain the secondary metabolites in the stem segment of noni and to establish genetic transformation system. The stem segments (no axillary buds) of noni were used as explants to induce the callus, and then to establish the cell suspension system. The factors affecting callus induction and cell suspension were studied. The results showed that the optimal culture medium for induction was MS with 1.0 mg/L 6-Benzylaminopurine (6-BA) and 0.1 mg/L 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), and the optimum culture medium for suspension was MS with 1.0 mg/L 6-BA and 0.1 mg/L 2,4-D, 3% sucrose and the pH of 5.85, with the initial inoculation amount of 37.5 g/L, and the speed of 110 r/min and 25±2 °C applying darkness culture. The suspension cells grew well and showed the maximum growth rate. The growth curve of the suspension cells from the stem segment of noni was in “S-typed” trend, and it should be transformed to the fresh medium between 12 and 20 d. During the culture, the pH of the culture medium decreased and then slowly increased, and the optimum pH for the suspension cells culture of callus from noni’s stem segments was 4.5–5.0. In this study, the stable cell suspension system of the stem segment of noni was successfully established.

Linn., stem, callus, suspension culture, growth curve

April 15, 2018;

June 26, 2018

Yunnan Applied Basic Research Project (No. 2016FB049), Science and Technology Innovation Fund Project of Southwest Forestry University in 2017–2018 (No. C17071), State Forestry Bureau Promotion Project (No. [2015]27), National Spark Program (No. 2014GA830017).

Tian Wu. Tel: +86-871-63862056; E-mail: 2351417655@qq.com

10.13345/j.cjb.180141

云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目 (No. 2016FB049)，2017–2018年度西南林業(yè)大學(xué)科技創(chuàng)新基金項(xiàng)目 (No. C17071)，國家林業(yè)局推廣項(xiàng)目 (No. [2015]27號)，國家星火計(jì)劃 (No. 2014GA830017) 資助。

(本文責(zé)編 陳宏宇)