熱毒寧注射液對(duì)甲型流感病毒感染小鼠肺組織炎癥和相關(guān)炎癥因子水平的影響*

劉 玉 謝 緯 賈 丹 張小瑾 祝慶華 陳 生

（廣東省深圳市中醫(yī)院，廣州中醫(yī)藥大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 深圳 518003）

流感病毒感染是上呼吸道相關(guān)疾病發(fā)病的一個(gè)重要原因，也是導(dǎo)致人急性肺損傷而引起死亡的主要原因之一。目前發(fā)現(xiàn)的流感病毒有甲、乙、丙3種類型，其中甲型流感病毒是目前導(dǎo)致流感感染的主要病原體。由于流感病毒抗原的變異，新的病毒株以及新的亞型不斷形成，從而使得甲型流感病毒可以反復(fù)多次突破人類的過(guò)往免疫保護(hù)進(jìn)而引起流行性感冒中小型流行甚至世界性的大流行［1］。世界范圍內(nèi)每年因季節(jié)性的流感導(dǎo)致了300～500萬(wàn)人罹患流感相關(guān)的嚴(yán)重疾?。?］。據(jù)報(bào)道僅在2016年底至2017年初的不到5個(gè)月的時(shí)間里，中國(guó)有1 258名患者感染H7N9禽流感病毒，死亡率高達(dá)41%［3］。研究表明流感疫苗只是部分地起作用［2］。故此流感預(yù)防策略及治療方法顯得非常的重要，近年來(lái)越來(lái)越多的國(guó)內(nèi)外學(xué)者把研究方向聚焦于流感的防治。流行性感冒屬于中醫(yī)學(xué)“時(shí)行感冒”的范疇，其主要病因?yàn)轱L(fēng)熱毒邪外感肺衛(wèi)，未得及時(shí)祛除，風(fēng)熱毒邪內(nèi)傳，進(jìn)而內(nèi)襲于肺，致使風(fēng)熱毒邪蘊(yùn)結(jié)肺部。其基本的病理機(jī)制為風(fēng)熱外襲、熱毒蘊(yùn)肺。常以辛涼解表、清熱解毒為主要治法和治則?；谘C方法的前期臨床試驗(yàn)證實(shí)，熱毒寧注射液治療流感具有較好的臨床療效［4］。為了深層次地了解其作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)制備小鼠甲型流感病毒性肺損傷模型，研究熱毒寧注射液對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠肺組織病理改變、血清及肺組織腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）水平的影響，以圖通過(guò)抗炎癥反應(yīng)渠道初步探討熱毒寧注射液治療流感的機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)的BALB/c小鼠共48只，平均體質(zhì)量波動(dòng)于14～17 g，由中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證編號(hào)：SCXK-（軍）2016-0035。飼料批號(hào)：SCXK（京）2016-0017。

1.2 病毒株 本實(shí)驗(yàn)所用甲1型流感病毒鼠肺適應(yīng)株FM1由廣州醫(yī)科大學(xué)呼研所病毒室提供，先由10日齡的雞胚尿囊腔進(jìn)行接種培養(yǎng)傳代，采用微量血凝試驗(yàn)進(jìn)行病毒效價(jià)的滴定，其中血凝效價(jià)在1∶640以上者可供本試驗(yàn)所用。在正式試驗(yàn)前進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)測(cè)定小鼠的病毒半數(shù)致死劑量（LD50），正式試驗(yàn)采用50倍的半數(shù)致死劑量（50LD50）的病毒液。

1.3 試藥與儀器 熱毒寧注射液購(gòu)自江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司（批號(hào)1511525945）；利巴韋林注射液購(gòu)自河北石家莊石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司 （國(guó)藥準(zhǔn)字H20123033）。小鼠IL-1β ELISA試劑盒、小鼠TNF-α ELISA試劑盒、小鼠IL-6 ELISA試劑盒（欣博盛生物科技有限公司）。超凈工作臺(tái)（BCM-1300A，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；石蠟切片機(jī)（Leica RM2235）；酶標(biāo)儀（Multiskan Ascent）；超低溫冰箱（BC-163D，海爾集團(tuán)）；低溫高速離心機(jī)（Microfuge 22R，美國(guó)Beckman公司）；倒置顯微鏡（Nikon-TE300，Leica dmil公司）；全自動(dòng)生化分析儀（7020，日本日立公司）；精密電子分析天平 （上海良平儀器儀表有限公司）；超純水器（Millpore）；微量加樣器（德國(guó) Eppendorf公司）；一次性注射器、眼科鑷、平皿、小鼠灌胃針等。

1.4 分組與模型制備 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用隨機(jī)數(shù)字表法將48只BALB/c小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分成正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、熱毒寧注射液組、利巴韋林注射液組各12只。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后稱取體質(zhì)量，除正常對(duì)照組小鼠外，其余各組小鼠均制備病毒感染實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。具體模型制備方法流程如下：首先行乙醚輕度麻醉，之后每只小鼠鼻內(nèi)滴種50LD50的流感病毒液50 μL。正常對(duì)照組小鼠在同等條件下的動(dòng)物房進(jìn)行隔離飼養(yǎng)，并按上述流程鼻腔接種0.9%氯化鈉注射液 50 μL。

1.5 干預(yù)方法 各治療組在病毒接種感染后的第24小時(shí)進(jìn)行給藥處理，連續(xù)給藥5 d。熱毒寧注射液組每次給予熱毒寧注射液7.2 mL/（kg·d）腹腔注射；利巴韋林注射液組每次給予利巴韋林注射液150 mg/（kg·d）腹腔注射；正常組和模型組給予同步腹腔注射0.9%氯化鈉注射液每日1 mL。各組實(shí)驗(yàn)小鼠在標(biāo)本采集前最后1次給藥后予禁水、禁食8 h。

1.6 標(biāo)本采集與檢測(cè) 分別在造模后第3日和第5日采集標(biāo)本，每次每組取6只，將實(shí)驗(yàn)小鼠稱質(zhì)量后，通過(guò)摘除眼球法取血，血液采集于促凝管中，立即放入低溫離心機(jī)中，4 000 r/min離心5 min，離心后取上層血清存于EP管中，放入-80℃冰箱中冷藏以備本實(shí)驗(yàn)ELISA檢測(cè)。之后采取頸椎脫臼的方法將小鼠處死，在無(wú)菌操作臺(tái)上將小鼠仰臥位固定，用醫(yī)用消毒酒精將其頸部及胸腹部消毒，無(wú)菌外科剪剪開胸骨，打開胸腔，取出整個(gè)肺臟組織，立即用微量天平稱取肺組織的質(zhì)量，計(jì)算各個(gè)小鼠的肺指數(shù) （肺質(zhì)量/體質(zhì)量×100%）。取左側(cè)肺組織，將之放入4%的多聚甲醛固定液中進(jìn)行固定，行常規(guī)脫水后石蠟包埋并進(jìn)行HE染色。根據(jù)相關(guān)的參考文獻(xiàn)［3］進(jìn)行實(shí)驗(yàn)小鼠的肺組織病理學(xué)評(píng)分。剪取右肺50 mg置于EP管中，加入1 mL的0.9%氯化鈉注射液，采用組織勻漿機(jī)將肺組織進(jìn)行充分地研磨，之后儲(chǔ)存于-80℃冰箱以備本實(shí)驗(yàn)相關(guān)指標(biāo)的ELISA檢測(cè)所用。采用ELISA法進(jìn)行急性肺損傷實(shí)驗(yàn)小鼠的血清和肺組織中TNF-α、IL-1β、IL-6含量的測(cè)定。具體的檢測(cè)程序嚴(yán)格遵循ELISA試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（x±s）表示。采用單因素方差分析（ONEWAY ANOVNA），組間比較采用LSD檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠肺指數(shù)比較 見表1。模型組第3和第5日的肺指數(shù)均高于正常組（P＜0.05）。藥物治療后第3日和第5日，各治療組與模型組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；治療后第5日，熱毒寧注射液組與利巴韋林注射液組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 各組肺指數(shù)比較（x±s）

2.2 各組小鼠肺組織病理改變觀察 見圖1。正常組：肺組織未見異常，氣管和肺泡結(jié)構(gòu)清晰，管腔內(nèi)無(wú)滲出物，血管無(wú)擴(kuò)張充血，基本無(wú)明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組：小鼠肺泡組織結(jié)構(gòu)不清，部分肺泡萎陷不張，肺泡間隔明顯增寬，肺間質(zhì)和肺泡內(nèi)有蛋白質(zhì)水腫液及大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺微血管充血、出血、微血栓。利巴韋林注射液組：肺泡結(jié)構(gòu)較模型組有改善，肺泡萎陷、充氣不良，較模型組有一定好轉(zhuǎn)，肺間隔內(nèi)炎細(xì)胞滲出有一定好轉(zhuǎn)。熱毒寧注射液組：肺泡萎陷、充氣不良明顯改善，肺間質(zhì)和肺泡水腫不明顯，肺泡間隔見少量纖維性滲出。

圖1 各組小鼠肺組織病理改變（HE染色，100倍）

2.3 各組小鼠血清及肺組織中TNF-α、IL-1β、IL-6含量的比較 見表2。流感病毒感染小鼠后，模型組血清及肺組織中TNF-α、IL-1β、IL-6水平均較正常組明顯升高，且在第5日達(dá)峰值；治療后第3日和第5日，熱毒寧注射液組、利巴韋林注射液組TNF-α、IL-1β、IL-6含量均較模型組有所降低（P＜0.05）；治療第3日和第5日，熱毒寧注射液組血清和肺組織TNF-α水平較利巴韋林注射液組均降低更明顯（P＜0.05）；治療第3日，熱毒寧注射液組血清和肺組織IL-1β、IL-6水平較利巴韋林注射液組均降低更明顯（P＜0.05）。

表2 各組小鼠血清及肺組織中TNF-α、IL-1β、IL-6含量比較（x±s）

3 討 論

自2016年10月至2017年2月，中國(guó)有1 258名患者感染H7N9禽流感病毒，其致死率為41%［3］。每年因季節(jié)性的流感導(dǎo)致300～500萬(wàn)人罹患流感相關(guān)的嚴(yán)重疾病，目前疫苗只是部分有效［2］。流感病毒主要侵入機(jī)體呼吸道黏膜上皮細(xì)胞，引起內(nèi)皮細(xì)胞大量釋放炎癥因子，介導(dǎo)過(guò)度的炎癥反應(yīng)，進(jìn)而細(xì)胞產(chǎn)生空泡、變性，并迅速產(chǎn)生子代病毒體擴(kuò)散至鄰近細(xì)胞，重復(fù)病毒增殖周期，最終導(dǎo)致肺組織損傷［5］。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)流感病毒感染小鼠的肺組織中出現(xiàn)黏膜水腫、充血、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)等，且流感病毒性肺炎模型小鼠的肺部炎癥病變程度與肺組織TNF-α、IL-1β、IL-6的水平相一致。

研究表明，純化的流感病毒神經(jīng)氨酸酶可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放 IL-1、TNF-α［6］，全病毒可誘導(dǎo)外周血單個(gè)核細(xì)胞產(chǎn)生 IL-1、IL-6 和 TNF-α［7］，流感病毒誘導(dǎo)機(jī)體免疫反應(yīng)產(chǎn)生的TNF-α、IL-6可直接作用于細(xì)胞、微血管等，造成組織損傷［8-9］。另有研究證實(shí)，流感病毒性肺炎模型小鼠的肺部炎癥病變程度與細(xì)胞因子TNF-α、IL-6 直接相關(guān)［10-12］，用 TNF-α 抗體治療能減輕肺部炎癥病變［13］。本研究選取流感病毒感染初期早期啟動(dòng)的特異性細(xì)胞因子 TNF-α、IL-6、IL-1β為檢測(cè)指標(biāo)來(lái)觀察熱毒寧注射液對(duì)流感病毒感染小鼠的炎癥反應(yīng)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小鼠在感染初期血清及肺組織中TNF-α、IL-1β、IL-6水平均呈上升趨勢(shì)，采用熱毒寧注射液和利巴韋林注射液均能降低TNF-α、IL-1β、IL-6水平，尤以熱毒寧注射液更為顯著，提示減輕由炎性因子過(guò)度釋放引起的病理?yè)p傷，改善肺指數(shù)狀。

甲型H1N1流感屬于中醫(yī)學(xué) “瘟疫病”“疫癘病”“瘟病”的范疇，風(fēng)熱犯衛(wèi)證或熱毒襲肺證為初期多見證候。熱毒寧注射液具有清熱、疏風(fēng)、解毒的功效，故在衛(wèi)生部頒布的 《甲型H1N1流感治療方案 （2010年版）》［14］中，被推薦用于治療流感患者。前期臨床研究證實(shí)熱毒寧注射液可明顯縮短流感患者病程［4］，降低流感患者外周血炎性因子［15］。熱毒寧注射液主要成分包括環(huán)烯醚萜類、有機(jī)酸及黃酮類成分等［16］。給實(shí)驗(yàn)大鼠靜脈注射熱毒寧注射液后，通過(guò)藥代動(dòng)力學(xué)的方法發(fā)現(xiàn)其循環(huán)系統(tǒng)中存在熱毒寧注射液的46種化合物（19種環(huán)烯醚萜類，16種有機(jī)酸，11種黃酮類）［17］。 現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，熱毒寧注射液組方中的金銀花、梔子、青蒿具有解熱抗炎、抗氧化、抗病毒等作用。梔子苷在體外能有效抑制甲型H1N1流感病毒對(duì)MDCK細(xì)胞的CPE，在體內(nèi)能有效減輕甲型H1N1流感病毒對(duì)小鼠肺部的損傷。大量體外試驗(yàn)研究表明青蒿素類藥物具有抗病毒作用，對(duì)甲型流感病毒等具有較好的抑制作用。基于活性導(dǎo)向的研究表明，金銀花不同成分對(duì)H3N2和H1N1甲型流感病毒神經(jīng)氨酸酶均有抑制作用［18-20］。

綜上所述，熱毒寧注射液具有抗流感病毒感染的作用，能夠減輕肺組織病變程度，正向調(diào)節(jié)炎癥因子，減緩流感感染小鼠的炎性反應(yīng)，降低肺組織和血清中TNF-α、IL-1β、IL-6 水平的表達(dá)。