苓甘五味姜辛湯對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷大鼠免疫細(xì)胞和炎性細(xì)胞因子的影響*

王寶娟 崔利鋒 李冬霞 張?jiān)坪?楊偉鋒 馬國(guó)安

（1.河北省衡水市第二人民醫(yī)院，河北 衡水 053000；2.河北省衡水市哈勵(lì)遜國(guó)際和平醫(yī)院，河北 衡水 053000）

急性肺損傷（ALI）是由各種肺內(nèi)外致病因素引起的以肺內(nèi)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和滲出、肺泡上皮及毛細(xì)血管內(nèi)皮屏障發(fā)生急性炎癥損傷，肺泡、肺間質(zhì)水腫等為主要特征的肺部炎性綜合反映，臨床上主要表現(xiàn)為急性進(jìn)行性血氧過(guò)低的呼吸窘迫癥、非心源性肺水腫等，最終導(dǎo)致呼吸衰竭，其臨床病死率高達(dá)30%～50%［1-2］，是呼吸系統(tǒng)的危急重癥之一，嚴(yán)重威脅到人類(lèi)的生命健康。細(xì)菌內(nèi)毒素是臨床上造成ALI的主要病因之一，其中又以革蘭陰性細(xì)菌內(nèi)毒素為主導(dǎo)，而其內(nèi)毒素的主要活性成分為脂多糖（LPS）。氣管內(nèi)滴入LPS與呼吸道細(xì)菌感染的過(guò)程相似，LPS進(jìn)入肺內(nèi)后能夠引起肺內(nèi)炎癥細(xì)胞增多、肺微血管通透性增高等病理改變［3］，從而造成肺部的嚴(yán)重炎性反應(yīng)及炎性損傷，進(jìn)而影響肺部結(jié)構(gòu)功能改變，最終導(dǎo)致ALI的發(fā)生［4］。

苓甘五味姜辛湯源于《金匱要略》，全方由茯苓、甘草、五味子、干姜、細(xì)辛組成。方中干姜為君，既能溫肺散寒以化飲，又能溫運(yùn)脾陽(yáng)以化濕；細(xì)辛溫肺散寒，助干姜治其已聚之痰；茯苓健脾滲濕利水，既能杜其生痰之源，又能導(dǎo)水飲之邪從小便而去，二者共為臣藥，從源流配合消除痰濕，以復(fù)肺之宣降之用；五味子斂肺氣以平咳喘，與細(xì)辛配伍，一收一散，共奏斂不留邪、散不傷正之功，且能調(diào)節(jié)肺司開(kāi)合之職；甘草調(diào)和諸藥。全方共奏具有溫肺化飲之功效，常用于寒飲內(nèi)停之咳喘。目前臨床多用于治療咳嗽、慢性支氣管炎、慢性阻塞性肺疾病、支氣管哮喘等肺系疾?。?-8］。本研究擬觀察苓甘五味姜辛湯對(duì)LPS致ALI大鼠動(dòng)脈血T淋巴細(xì)胞亞群和支氣管肺泡灌洗液 （BALF）中白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-8（IL-8）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的影響，并探討其對(duì)ALI的可能作用及其機(jī)制。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取健康清潔級(jí)的2月齡SD大鼠90 只，雌雄各半，體質(zhì)量（200±20） g，由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供，合格證號(hào)：SCXK（京）2012-0068。飼養(yǎng)條件：無(wú)特殊病原菌（SPF）級(jí)環(huán)境，恒溫22～25℃，恒濕50%～65%。

1.2 試藥與儀器 苓甘五味姜辛湯方藥組成：茯苓12 g，甘草 9 g，五味子 5 g，干姜 9 g，細(xì)辛 5 g，桂枝 9 g。將藥材加4倍量水煎煮60 min，紗布過(guò)濾后將濾液另器置放，濾渣再加入3倍量水煎煮30 min后過(guò)濾，2次煎煮液混合后水浴濃縮至原藥材含量為0.8 g/mL，4℃放置備用，臨用時(shí)用蒸餾水稀釋。地塞米松注射液（批號(hào)130257，天津天藥藥業(yè)股份有限公司）；LPS（批號(hào)20161019，Sigma公司，德國(guó)）；FITC標(biāo)記的抗大鼠CD3單克隆抗體、PE標(biāo)記的抗大鼠CD4和CD8單克隆抗體（美國(guó) Caltag公司）；IL-1β、IL-6、IL-8 和 TNF-α 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒（法國(guó)Diaclone公司）。主要儀器設(shè)備：大鼠固定操作臺(tái) （PENN-CENTURY公司，美國(guó)）；3K15 型低溫高速離心機(jī)（Sigma公司，德國(guó)）；CO2培養(yǎng)箱（Yamato公司，日本）；光學(xué)顯微鏡（Olympus公司，日本）；DYZ-22A型雙恒定時(shí)電泳儀（北京市六一儀器廠(chǎng)）；DYY-Ⅲ橋式電泳槽 （北京市六一儀器廠(chǎng)）；BD-LSR型流式細(xì)胞儀 （Becton Dichinson公司，美國(guó)）；2016型切片機(jī)（上海萊卡儀器有限公司）。

1.3 動(dòng)物分組 90只大鼠實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按隨機(jī)數(shù)字表法分成6組，每組15只，分別為空白對(duì)照組、ALI模型組、地塞米松組和苓甘五味姜辛湯高、中、低劑量組（以下簡(jiǎn)稱(chēng)中藥高、中、低劑量組）。

1.4 造模與給藥 1）動(dòng)物造模。采用LPS暴露式氣管滴注方法制備大鼠ALI模型［10］：末次給藥24 h后，除空白對(duì)照組外的5組大鼠用10%水合氯醛3.5 mL/kg腹腔麻醉后，仰臥位固定于手術(shù)板上，頸部消毒，縱向切開(kāi)頸部皮膚，剝離皮下組織，暴露氣管，用2 mL注射器從氣管兩氣管環(huán)間快速刺入，在大鼠直立位下滴入脂多糖溶液10 mg/kg，輕度晃動(dòng)數(shù)次以使液體能夠均勻分布于肺內(nèi)后縫合切口以制作ALI模型。大鼠自然清醒后自由活動(dòng)，禁食，未禁水。2）干預(yù)方法。大鼠給藥劑量按人與大鼠之間體表面積折算［9］等效劑量為4 g/kg，高劑量為2倍等效劑量，低劑量為1/2倍等效劑量，按上述給藥量，用蒸餾水將苓甘五味姜辛湯煎煮液配置成中藥高、中、低劑量濃度分別為0.8、0.4、0.2 g/mL?？瞻讓?duì)照組和模型組給予等劑量的0.9%氯化鈉注射液灌胃，地塞米松組取地塞米松注射液1.0 mg/kg腹腔注射，每日1次，連續(xù)用藥27 d。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè) 1）實(shí)驗(yàn)取材：10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，經(jīng)舌靜脈注入肝素抗凝，收集大鼠腹主動(dòng)脈血保存待用；處死大鼠后將其仰臥位固定，使用無(wú)菌剪刀剪開(kāi)大鼠頸部和胸部的皮膚組織，暴露胸腔，將大鼠右主支氣管結(jié)扎后，用注射器在主氣管上向肺部注入磷酸鹽緩沖液2 mL進(jìn)行左肺灌洗，重復(fù)3次后留取支氣管肺泡灌洗液（BALF）備用。2）肺組織病理學(xué)檢測(cè)及病理學(xué)評(píng)分：取大鼠右肺中葉組織，用10%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋后切片（片厚5 μm），取切片進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色；光鏡下觀察肺組織病理形態(tài)學(xué)改變，并進(jìn)行病理學(xué)評(píng)分［11］。 3）肺濕/干質(zhì)量比測(cè)定：取大鼠右肺下葉組織，先除去表面脂肪組織，再用濾紙吸干組織表面的液體后稱(chēng)量肺組織的濕質(zhì)量；將肺組織置于70℃烘箱48 h至恒重后再次稱(chēng)量其干質(zhì)量，并計(jì)算肺組織濕/干質(zhì)量比（W/D）值，用來(lái)評(píng)估肺組織水腫程度。4）大鼠動(dòng)脈血中CD3+、CD4+和CD8+的測(cè)定［12］：按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟，采用流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)大鼠腹主動(dòng)脈血中T淋巴細(xì)胞亞群進(jìn)行測(cè)定［1］。5）大鼠 BALF 中 IL-1β、IL-6、IL-8 和 TNF-α水平的測(cè)定［13］：按試劑盒說(shuō)明書(shū)方法，采用ELISA法測(cè)定 IL-1β、IL-6、IL-8和 TNF-α 因子的濃度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（x±s）表示，組間比較用單因素方差分析，兩組間比較用q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠肺組織病理形態(tài)改變及病理學(xué)評(píng)分見(jiàn)圖1，表1。顯微鏡下觀察見(jiàn)空白對(duì)照組大鼠肺組織形態(tài)、肺泡結(jié)構(gòu)正常，肺泡壁薄，間隔無(wú)水腫，無(wú)明顯炎癥改變。ALI模型組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)破壞，部分肺泡塌陷，肺泡水腫明顯，肺泡間隔明顯增厚，肺泡壁有大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)及滲出物，肺泡腔內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺間質(zhì)彌漫性充血水腫。地塞米松組及中藥高劑量、中劑量組的肺組織上述變化較模型組明顯減輕，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量減少，充血、水腫程度減輕，且肺組織結(jié)構(gòu)明顯改善。中藥低劑量組肺組織結(jié)構(gòu)改善不明顯，肺泡腔內(nèi)仍有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺間質(zhì)部分充血水腫。病理學(xué)評(píng)分方面，ALI模型組評(píng)分明顯高于空白對(duì)照組（P＜0.05），經(jīng)不同藥物干預(yù)后，地塞米松組和中藥高、中劑量組評(píng)分均明顯降低（P＜0.05），中藥低劑量組評(píng)分降低不明顯（P＞0.05），中藥各組與地塞米松組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 各組大鼠肺組織病理形態(tài)改變（HE染色，200倍）

表1 各組大鼠病理學(xué)評(píng)分及W/D比值比較（x±s）

2.2 各組大鼠肺組織W/D比值情況比較 見(jiàn)表1。與空白對(duì)照組相比，ALI模型組肺組織水腫明顯，W/D比值明顯增加，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。地塞米松組與中藥高劑量組、中劑量組肺組織水腫現(xiàn)象較ALI模型組明顯減輕，W/D比值降低，有顯著差異（P＜0.05）。中藥低劑量組肺組織W/D比值較ALI模型組降低不明顯（P＞0.05）。

2.3 各組大鼠動(dòng)脈血 CD3+、CD4+、CD8+和 CD4+/CD8+水平比較 見(jiàn)表2。ALI模型組動(dòng)脈血中CD3+、CD4+、和CD4+/CD8+水平較空白對(duì)照組明顯降低（P＜0.05），CD8+水平明顯升高（P＜0.05）。 與 ALI模型組比較，中藥高劑量組、中劑量組動(dòng)脈血中CD3+、CD4+和CD4+/CD8+水平明顯升高（P＜0.05），CD8+水平明顯降低（P＜0.05）；地塞米松組和中藥低劑量組與ALI模型組相比各項(xiàng)指標(biāo)變化不明顯（P＞0.05）。

表2 各組大鼠CD3+、CD4+、CD8+和CD4+/CD8+水平比較（%，x±s）

2.4 各組大鼠 BALF中 IL-1β、IL-6、IL-8和 TNF-α水平比較 見(jiàn)表3。LPS造模后大鼠BALF中IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α水平均升高，與空白對(duì)照組比較差異顯著（P＜0.05）；經(jīng)高、中劑量的中藥處理可顯著降低各項(xiàng)指標(biāo)的水平，與地塞米松組效果相當(dāng)，與ALI模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 各組大鼠 IL-1β、IL-6、IL-8 和 TNF-α 水平比較（x±s）

3 討 論

近年來(lái)，采用氣管內(nèi)滴入LPS的方式制作ALI動(dòng)物模型的方法已經(jīng)廣泛運(yùn)用于ALI發(fā)病機(jī)理和藥物防治的研究［14］。因?yàn)長(zhǎng)PS不僅能損傷肺臟，還能激活多種炎癥細(xì)胞，使其釋放大量炎癥介質(zhì)或細(xì)胞因子，進(jìn)而導(dǎo)致肺組織損傷［15］。本研究中大鼠氣管內(nèi)滴注LPS后，出現(xiàn)大鼠肺組織結(jié)構(gòu)破壞、肺泡炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等典型的ALI病理改變，提示本研究成功建立了ALI的動(dòng)物模型。同時(shí)ALI模型大鼠肺組織病理學(xué)評(píng)分以及W/D比值升高，表明LPS氣管內(nèi)滴藥能引起明顯的大鼠肺組織損傷。而苓甘五味姜辛湯干預(yù)后能明顯減輕損傷，降低肺組織病理學(xué)評(píng)分和W/D比值，提示苓甘五味姜辛湯對(duì)ALI大鼠的肺臟有明顯的保護(hù)作用。

T淋巴細(xì)胞亞群是細(xì)胞免疫的主要組成部分，其中，CD3+是鑒定 T 細(xì)胞的重要標(biāo)記［16］；CD4+能誘導(dǎo)和輔助細(xì)胞毒T細(xì)胞前身成為細(xì)胞毒T細(xì)胞，輔助其他免疫細(xì)胞功能的發(fā)揮，其數(shù)量的減少代表機(jī)體免疫功能的降低［17］；CD8+主要分布在抑制性和殺傷性T淋巴細(xì)胞表面，通過(guò)自身和抑制因子在免疫反應(yīng)中起負(fù)向調(diào)節(jié)作用，若其細(xì)胞數(shù)量過(guò)多反而會(huì)對(duì)機(jī)體造成損傷；CD4+/CD8+則能反映機(jī)體免疫功能是否紊亂，并且其下降程度與疾病的嚴(yán)重程度、預(yù)后均密切相關(guān)［18］。本研究結(jié)果顯示，ALI大鼠動(dòng)脈血中CD3+、CD4+和CD4+/CD8+值降低，CD8+升高，提示LPS造模后能引起T淋巴細(xì)胞亞群的表達(dá)異常，從而導(dǎo)致ALI和免疫抑制。而經(jīng)高、中劑量苓甘五味姜辛湯干預(yù)后，以上指標(biāo)均有所恢復(fù)，表明苓甘五味姜辛湯能提高機(jī)體免疫力，糾正機(jī)體細(xì)胞免疫抑制狀態(tài)。

ALI的主要特點(diǎn)是炎癥介質(zhì)大量合成和釋放，IL-1β，IL-6、IL-8以及TNF-α等促炎介質(zhì)的水平，可反映肺組織炎癥反應(yīng)的強(qiáng)度［19］。IL-1β是急性炎癥反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)物質(zhì)，并且能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-6和IL-8等［20］。IL-6是強(qiáng)有力的促炎因子，主要參與肺損傷時(shí)肺內(nèi)炎癥的過(guò)度反應(yīng)，其不僅能對(duì)組織直接造成傷害，還能增強(qiáng)組織細(xì)胞對(duì)TNF-α的敏感性［21］。IL-8是中性粒細(xì)胞最有效和最主要的趨化因子，能促使中性粒細(xì)胞活化和遷移，釋放出大量的損傷介質(zhì)引起肺損傷［22］。TNF-α是ALI最重要的啟動(dòng)因子，能趨化炎癥細(xì)胞在肺內(nèi)聚集、黏附，從而損傷肺血管內(nèi)皮細(xì)胞［23］。TNF-α還能使炎癥細(xì)胞釋放IL-1β、IL-6和IL-8等二級(jí)炎癥因子，加重肺組織炎癥損傷［24］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，LPS造模后大鼠 BALF 中 IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α 水平顯著升高，其原因可能是因?yàn)锳LI后導(dǎo)致肺泡毛細(xì)血管屏障下降，白細(xì)胞向肺泡內(nèi)遷移，被激活的細(xì)胞進(jìn)而產(chǎn)生 IL-1β、IL-6、IL-8等多種炎性遞質(zhì)以及 TNF-α等前炎性遞質(zhì)；而經(jīng)苓甘五味姜辛湯干預(yù)后可顯著降低其水平，表明苓甘五味姜辛湯可以抑制IL-1β、IL-6、IL-8以及TNF-α等炎性因子的合成和釋放，從而減輕肺組織的炎性損傷程度。

綜上所述，苓甘五味姜辛湯能減輕肺損傷，改善肺水腫，提高機(jī)體免疫力，糾正機(jī)體細(xì)胞免疫抑制狀態(tài)，抑制 IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α 的合成和釋放，為臨床救治ALI提供了新思路。