海南島白唇竹葉青蛇擴散的初步研究

王湘君 陳 文 林熾賢 林杰曼

(1.海南熱帶海洋學院生命科學與生態(tài)學院，兩棲爬行動物研究省級重點實驗室，三亞，572022；2.南京師范大學生命科學學院，南京，201146；3.海南熱帶海洋學院海洋科學技術(shù)學院，三亞，572022)

白唇竹葉青蛇(Trimeresurusalbolabris)，白唇腺蝮隸屬于蛇亞目(Serpentes)蝰科(Viperiae)竹葉青蛇屬，棲息于平原、丘陵或低山區(qū)，各種水域附近的灌叢和雜草上。國內(nèi)分布于澳門、福建、廣東、廣西、貴州、海南、湖南、江西、臺灣、香港、云南；國外分布于尼泊爾、印度北部、緬甸、泰國、印度支那、馬來西亞、印度尼西亞[1-2]。

Avise首次提出把動物學、遺傳學、系統(tǒng)學、地理學和分子生物學的理論和方法相結(jié)合，構(gòu)建“種內(nèi)系統(tǒng)發(fā)育地理學”。其方法論基礎(chǔ)是動物線粒體DNA單倍型的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系及其群體動力學[3-5]。運用親緣地理學的理論與方法，揭示種群的歷史，例如：發(fā)生、建群、發(fā)展、隔離、分化、遷移、擴散、瓶頸和滅絕；在種內(nèi)水平上，闡述了種群演化歷程，及其與地理學的關(guān)系。其中，12S、16S、Cytb、ND2、ND4、D-loop、COI等序列，是分子標記上運用比較廣的幾個基因序列[6-10]。

作者通過研究白唇竹葉青蛇12S、16S、Cytb、ND4四個線粒體基因部分序列，分析諸多單倍型序列彼此之間的親緣以及變異程度關(guān)系，推斷竹葉青蛇的擴散方向和地理分化中心。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 PCR實驗所用標本

采集來自海南產(chǎn)白唇竹葉青蛇共12個個體，其中3個采自樂東縣(西南部) 編號為C01，C02，C03；2個采自東方市(西部)編號為C04，C05；4個采自昌江縣(西北北部)編號為C06，C07，C08，C09；采自三亞市(南部)、陵水縣(東南部)、瓊海市(東部)各1個，分別編號為C10，C11，C12。

1.1.2 從網(wǎng)上下載的竹葉青蛇序列

表1 GenBank下載的序列

Tab.1 The sequences downloaded from GeneBank

1.2 實驗方法

采集標本運用PCR法分別擴增12S、16S、Cytb、ND4四個基因片段，并測列。采用通用引物，引物序列和PCR擴增條件如下表。

表2 引物設(shè)計圖表

Tab.2 Design of primer

表3 PCR反應(yīng)條件

Tab.3 Reaction requirement for PCR

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用12S、16S、Cytb、ND4基因序列的單倍型判別相對原始及進化的序列來確定遷徙擴散路線。采用DNASTAR軟件ClustalX程序排列DNA同源序列后，人工逐項核查，將全部序列都視為無序特征。再將12S、16S、Cytb、ND4基因序列片段的seq文件分別加載到MAGA6.0軟件后，根據(jù)其堿基突變位點數(shù)逐步比較排查，從而篩選出較為原始的單倍型序列，作為起源中心。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因序列的核苷酸組成

表4 竹葉青蛇屬蛇類基因序列的核苷酸組成(bp)

Tab.4 Nucleotide composition of genus Trimeresurus sequence(bp)

從測定結(jié)果可以看出，白唇竹葉青蛇的堿基數(shù)A+T的含量都明顯高于堿基數(shù)G+C的含量，這與脊椎動物線粒體DNA的L鏈堿基組成相一致[11-12]。A的含量明顯偏高，而G明顯偏低，與其他蛇類此片段堿基組成比例相當[11，13-14]。

2.2 白唇竹葉青蛇擴散路線

樣本產(chǎn)自海南島的8個市縣，按地理距離和地理相似性被劃分在5個地理單元內(nèi)地理分布(圖1)：昌江縣、東方市為西部單元(Western unit：Changjiang，Dongfang)，瓊海市為東部單元(Easternmost unit：Qionghai)；海口市為北部單元(Northern unit：Haikou)，樂東縣、三亞市、陵水縣為南部單元(Southern unit：Ledong，Sanya，Lingshui)，白沙縣為中部單元(Central unit：Baisha)。

基于12S、16S、Cytb、ND4的基因序列片段，采用DNASTAR軟件ClustalX程序排列DNA同源序列后，再通過人工詳細核查，將全部序列都視為無序特征。再將12S、16S、Cytb、ND4基因序列片段的seq文件分別加載到Megalin軟件后，根據(jù)其堿基突變位點數(shù)逐步比較排查，從而篩選出較為原始的單倍型序列，再根據(jù)所示遺傳距離圖，逐步有選擇性的局部序列比對和原始序列的比對，尋找突變位點、突變堿基數(shù)目，嘗試判斷突變方向，繪制出單倍型簡約網(wǎng)絡(luò)圖[15]，如圖2(a)、3(a)、4(a)、5(a)所示。

2.2.1 基于12S基因，白唇竹葉青蛇擴散路線

基于12S基因下，獲得分別產(chǎn)自海南島西部、東部、南部單元共12條白唇竹葉青蛇基因序列片段，經(jīng)詳細的剪輯比對排查發(fā)現(xiàn)393個堿基位點中有15個突變位點，共定義了9個單倍型。由圖2(a)-2(b)可知，基于12S基因下的單倍型網(wǎng)絡(luò)呈現(xiàn)出較清晰的星狀聚類圖。其中產(chǎn)自海南東方的C04和產(chǎn)自海南昌江的C05、C08的白唇竹葉青為同一單倍型，產(chǎn)自海南樂東的C01、C03及產(chǎn)自海南三亞的C10為同一單倍型，其他序列均為“孤序列”，即：單獨一個序列對應(yīng)一個單倍型[15]。編號為C04、C06、C08的白唇竹葉青蛇相較原始且占主導(dǎo)優(yōu)勢，因此為中央單倍型，其他單倍型均以中央單倍型進行擴散進化。其中編號C11、C02與中央單倍型相較遠，均相差4個單倍型，因采集地點及個數(shù)較少，大多數(shù)的過渡類群的單倍體無法獲取，均以黑點表示未觀察到的中間單倍型。

根據(jù)圖2(a)，繪制出基于12S基因下，白唇竹葉青蛇擴散路線圖2(b)。由圖可知，海南產(chǎn)白唇竹葉青蛇總體呈現(xiàn)出由西部向東部擴散的趨勢，其起源中心分別是海南省的昌江縣、東方市這兩個西線市縣。根據(jù)單倍型可知，C07、C09可能由C04、C06、C08擴散進化得到，但C07、C09與C06、C08均產(chǎn)自昌江縣，地理位置相較為近，因此C07由C06、C08擴散進化得到的可能性大。同理，C04與C05均產(chǎn)自東方市，C05由C04擴散進化得到的可能性大。C05是C04擴散進化到C01、C03、C10的過渡類群，C07是C06、C09擴散進化到C01、C03、C10的過渡類群。

圖1 海南島白唇竹葉青蛇采集樣點Fig.1 Map of the sampling localities of Hainan Trimeresurus albolabris 注：黃色三角形編號1～10分別對應(yīng)B01～B10號樣本蛇；紅色三角形1～12分別對應(yīng)C01～C12號樣本蛇 Note：Yellow triangle No.1-10 corresponds to sample snake B01-B10，red triangle No.1-12 corresponds to sample snake C01-C12，respectively

圖2(a) 基于12S基因，白唇竹葉青蛇統(tǒng)計簡約網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 (a) The statistics simple network diagram of Trimeresurusalbolabris in Hainan based on 12S gene 注：未觀察到的中間單倍型用黑點表示，每一步變異用或者較長或者較短的連接單倍型的線段表示，包括觀察到的和未觀察到的單倍型，圓圈的大小大致表示共享該單倍型的個體的數(shù)量[15] Note：Unobserved intermediate haplotypes are denoted by black dots，and each variation is denoted by lines of either longer or shorter connected haplotypes，including observed and unobserved haplotypes.The size of the circle roughly denotes the number of individuals sharing the haplotype[15]

圖2(b) 基于12S基因，白唇竹葉青蛇擴散路線圖Fig.2 (b) The spread route map of Trimeresurus albolabris in Hainan based on the 12S gene 注：紅色小三角形1～12分別對應(yīng)C01～C12號樣本蛇 Note：Red small triangle No.1-12 corresponds to sample snake C01-C12

圖3(a) 基于16S基因，白唇竹葉青蛇統(tǒng)計簡約網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 (a) The statistics simple network diagram of Trimeresurus albolabris in Hainan based on 16S gene 注：未觀察到的中間單倍型用黑點表示，每一步變異用或者較長或者較短的連接單倍型的線段表示，包括觀察到的和未觀察到的單倍型，圓圈的大小大致表示共享該單倍型的個體的數(shù)量[15] Note：Unobserved intermediate haplotypes are denoted by black dots，and each variation is denoted by lines of either longer or shorter connected haplotypes，including observed and unobserved haplotypes.The size of the circle roughly denotes the number of individuals sharing the haplotype[15]

圖3(b) 基于16S基因，白唇竹葉青蛇擴散路線圖Fig.3 (b) The spread route map of Trimeresurus albolabris in Hainan based on the 16S gene 注：紅色小三角形1～12分別對應(yīng)C01～C12號樣本蛇 Note：Red small triangle No.1-12 corresponds to sample snake C01-C12

2.2.2 基于16S基因，白唇竹葉青蛇擴散路線

基于16S基因，獲得分別產(chǎn)自海南島西部、東部、南部單元共9條白唇竹葉青蛇基因序列片段及產(chǎn)自中國香港的1條白唇竹葉青蛇基因序列片段。經(jīng)詳細的比對排查發(fā)現(xiàn)358個堿基位點中有16個突變位點，共定義了7個單倍型。由圖3(a)可知，基于16S基因下的單倍型網(wǎng)絡(luò)與基于12S基因下的單倍型網(wǎng)絡(luò)相似，均呈現(xiàn)出較清晰的星狀聚類圖。其中產(chǎn)自海南樂東的C01、東方的C04、海南昌江的C08的白唇竹葉青為同一單倍型，且相較其他白唇竹葉青為原始，占主導(dǎo)優(yōu)勢，因此為中央單倍型，其他單倍型均以中央單倍型進行擴散進化。產(chǎn)自海南瓊海的C12與產(chǎn)自香港的HK為同一單倍型，其與中央單倍型相距遠，相隔7個單倍類型。其他序列均為“孤序列”(singletons)，其中C11與中央單倍型差9個單倍型。因采集地點及個數(shù)較少，所有的過渡類群的單倍體無法獲取，均以黑點表示未觀察到的中間單倍型。

圖4(a) 基于Cyt b基因，白唇竹葉青蛇統(tǒng)計簡約網(wǎng)絡(luò)圖Fig.4(a)The statistics simple network diagram of Trimeresurusalbolabris in Hainan based on Cyt b gene 注：未觀察到的中間單倍型用黑點表示，每一步變異用或者較長或者較短的連接單倍型的線段表示，包括觀察到的和未觀察到的單倍型，圓圈的大小大致表示共享該單倍型的個體的數(shù)量[15]. Note：Unobserved intermediate haplotypes are denoted by black dots,and each variation is denoted by lines of either longer or shorter connected haplotypes,including observed and unobserved haplotypes.The size of the circle roughly denotes the number of individuals sharing the haplotype[15]

圖4(b) 基于Cyt b基因，白唇竹葉青蛇擴散路線圖Fig.4(b)The spread route map of Trimeresurus albolabris in Hainan based on the Cyt b gene 注：黃色三角形編號1～10分別對應(yīng)B01～B10號樣本蛇，紅色三角形1～12分別對應(yīng)C01～C12號樣本蛇。 Note：Yellow triangle No. 1-10 corresponds to sample snakes B01-B10 and red triangle No.1-12 corresponds to sample snakes C01-C12,respectively

圖5(a) 基于ND4基因，白唇竹葉青蛇統(tǒng)計簡約網(wǎng)絡(luò)圖Fig.5(a)The statistics simple network diagram of Trimeresurusalbolabris in Hainan based on ND4 gene 注：未觀察到的中間單倍型用黑點表示，每一步變異用或者較長或者較短的連接單倍型的線段表示，包括觀察到的和未觀察到的單倍型，圓圈的大小大致表示共享該單倍型的個體的數(shù)量[13] Note：Unobserved intermediate haplotypes are denoted by black dots,and each variation is denoted by lines of either longer or shorter connected haplotypes,including observed and unobserved haplotypes.The size of the circle roughly denotes the number of individuals sharing the haplotype[13]

圖5(b) 基于ND4基因，白唇竹葉青蛇擴散路線圖Fig.5(b)The spread route map of Trimeresurus albolabrisin Hainan based on the ND4 gene 注：黃色三角形編號1～10分別對應(yīng)B01～B10號樣本蛇，紅色三角形1～12分別對應(yīng)C01～C12號樣本蛇 Note：Yellow triangle No.1-10 corresponds to sample snakes B01-1B10, red triangle No.1-12 corresponds to sample snakes C01-C12,respectively

根據(jù)圖3(a)，繪制出基于16S基因下，白唇竹葉青蛇擴散路線圖3(b)。由圖可知，海南產(chǎn)白唇竹葉青蛇總體呈現(xiàn)出由西部向東部擴散的趨勢，其起源中心分別是海南省的昌江縣、東方市、樂東縣這3個西線市縣，這與基于12S基因下，所得的起源中心為昌江縣、東方市相似。根據(jù)單倍型可知，C09可能由C01、C04、C08擴散進化得到，但C09與C08均產(chǎn)自昌江縣，地理位置相較為近，因此C09由C08擴散進化得到的可能性大。同理，C02與C01均產(chǎn)自樂東縣，地理位置近，C02由C01擴散進化得到的可能性大。

2.2.3 基于Cytb基因，白唇竹葉青蛇擴散路線

基于Cytb基因下，獲得分別產(chǎn)自海南島東部、南部、北部單元共13條白唇竹葉青蛇基因序列片段及產(chǎn)自中國香港的1條白唇竹葉青蛇基因序列片段。經(jīng)詳細的比對排查發(fā)現(xiàn)308個堿基位點中有10個突變位點，共定義了5個單倍型。由圖4(a)可知，基于Cytb基因下的單倍型網(wǎng)絡(luò)與基于12S、16S基因下的單倍型網(wǎng)絡(luò)相似，均呈現(xiàn)出較清晰的星狀聚類圖。其中產(chǎn)自海南樂東縣的C01、白沙縣的B10、?？谑械腂01、B02、B03及產(chǎn)自陵水縣的B04、B05、B06、B07、B08、B09為同一單倍型，且相較其他白唇竹葉青為原始，占主導(dǎo)優(yōu)勢，因此為中央單倍型，其他單倍型均以中央單倍型進行擴散進化。產(chǎn)自?？谑械腂03與產(chǎn)自香港的HK為同一單倍型，其與中央單倍型相隔1個單倍類型。其他序列均為“孤序列”0，其中C10與中央單倍型相距最遠差6個單倍型。因采集地點及個數(shù)較少，所有的過渡類群的單倍體無法獲取，均以黑點表示未觀察到的中間單倍型。

根據(jù)圖4(a)，繪制出基于Cytb基因下，白唇竹葉青蛇擴散路線圖4(b)。由圖可知，海南產(chǎn)白唇竹葉青蛇總體呈現(xiàn)出由西部向東部擴散的趨勢，其起源中心分別是海南省的?？谑?、白沙縣、樂東縣、陵水縣這4個市縣，起源中心相對分散，這可能與沒測序出產(chǎn)自海南島西部單元的蛇序列有關(guān)。根據(jù)單倍型親緣地理位置可知，B03由B01、B02擴散進化得到的可能性比較大，C11由B04、B05、B06、B07、B08、B09擴散進化得到的可能性大。

2.2.4 基于ND4基因，白唇竹葉青蛇擴散路線

基于ND4基因下，獲得分別產(chǎn)自海南島西部、東部、南部、北部單元共21條白唇竹葉青蛇基因序列片段及產(chǎn)自中國香港的1條白唇竹葉青蛇基因序列片段。經(jīng)詳細的比對排查發(fā)現(xiàn)666個堿基位點中有13個突變位點，共定義了9個單倍型。由圖5(a)可知，基于ND4基因下的單倍型網(wǎng)絡(luò)與基于12S、16S、Cytb基因下的單倍型網(wǎng)絡(luò)相似，均呈現(xiàn)出較清晰的星狀聚類圖。其中產(chǎn)自海南東方市的C05、昌江縣的C08、C09為同一單倍型，且相較其他白唇竹葉青為原始，占主導(dǎo)優(yōu)勢，為中央單倍型，其他單倍型均以中央單倍型進行擴散進化。B01、B02、B04、B05、B07、B08、B09、B10、C12、HK為同一單倍型，其與中央單倍型相差4個單倍類型且是中央單倍型擴散進化為B03的過渡類群單倍型。C03、C10、C11為同一單倍型其與中央單倍型相隔2個單倍類型且是中央單倍型擴散進化為C02的過渡類群的單倍型。C06是中央單倍型擴散進化為C01的過渡類群的單倍型。因采集地點及個數(shù)較少，一部分的過渡類群的單倍體無法獲取，均以黑點表示未觀察到的中間單倍型。

根據(jù)圖5(a)，繪制出基于ND4基因下，白唇竹葉青蛇擴散路線圖5(b)。由圖可知，海南產(chǎn)白唇竹葉青蛇總體呈現(xiàn)出由西部向東部擴散的趨勢，其起源中心分別是海南省的昌江縣、東方市這兩個西線市縣。根據(jù)單倍型及地理親緣關(guān)系可知，C06、C07由C08、C09擴散進化得到的可能性較大，C04由C05擴散進化得到的可能性大，C02由C03擴散進化得到的可能性大，B03由B01、B02擴散進化得到的可能性大。

3 討論與結(jié)論

根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育的分枝格局來推測種群的擴散線路和方向，有很多成功的示例[16]，特別適合于對島嶼種群和擴散能力較弱的兩棲爬行動物種群的研究[17]。

由圖可知，基于12S、16S、Cytb、ND4基因序列片段的海南產(chǎn)白唇竹葉青蛇單倍型網(wǎng)絡(luò)圖均顯示了較清晰的星狀聚類圖。暗示了局部種群可能的地理起源和較距離的遷移事件，也證明了本研究的地理采樣有一個較好的覆蓋度，但因獲取的個體數(shù)目較少以致一部分的單倍型過渡類群無法獲取，均以黑點表示未觀察到的中間單倍型?；诓煌幕蛐蛄械玫降钠鹪粗行拇嬖诓町?，但總體擴散進化水平均呈現(xiàn)出由西部單元向東部單元擴散的趨勢。但仍無法推斷出海南產(chǎn)白唇竹葉青蛇樣本與中國大陸、東南亞白唇竹葉青蛇的擴散方向和較為準確的起源地點。雖然海南島的氣候地理條件非常適合竹葉青蛇的生活習性，但是海南島與大陸存在著無可爭議的地理隔離。

DNA不僅是主要的遺傳物質(zhì)，同時也是生物進化史的重要記錄者[18]。與核基因組相比，線粒體基因沿著一條直接而又簡單的路線進化，可由后代追溯到單一祖先；因此使得該分子適合用于親緣地理學研究和種群[15，19]。ND2和D-loop區(qū)域又因為進化速率快最早成為該領(lǐng)域研究熱點[15]。Cytb基因在線粒體中，進化速率中等[13]，為常被用作分子標記的典型基因。但本實驗所獲的Cytb基因單倍型較少，待獲取更多樣本后，進一步分析。ND4基因進化速率相對較快[6-7，10]，且PCR實驗條件要求很低，因此經(jīng)常用于種下分子研究。本實驗獲取的單倍型中，個體數(shù)最多的單倍型并未處于變化的中心區(qū)域，這與采樣點少、樣本隨機性較強有關(guān)。

就本實驗中的12S、16S、Cytb、ND4基因序列片段而言，12S基因和16S基因的效果相對較好。其處于星圖的中心單倍型個體相對較多，拓撲結(jié)構(gòu)清晰，且兩個基因的星圖一致性較高。由于本實驗樣本量少且討論的地域面積不大，進化速率相對較慢的12S和16S基因[8-9]，呈現(xiàn)出更清晰的結(jié)果。

竹葉青常生活于丘陵及山區(qū)，棲于溪邊灌叢、竹林、壁巖上或石縫間，喜陰雨天氣活動[1-2]。而海南島地勢為四周低中間高，呈現(xiàn)出彎隆形態(tài)，其是由山地、丘陵、盆地、平原構(gòu)成階梯式環(huán)形層狀地貌[20]。再根據(jù)海南島歷年的降雨量，發(fā)現(xiàn)海南東部地區(qū)的降雨量遠遠多于海南島西部地區(qū)[21-22]。因此，推斷海南產(chǎn)白唇竹葉青蛇由西部地區(qū)向東部地區(qū)擴散，尋求更適宜的棲息環(huán)境?；蛟S正是因海南島適宜的氣候及地理條件使得白唇竹葉青蛇能夠在此大量繁殖，迅速擴大種群數(shù)量，豐富了白唇竹葉青蛇的基因庫，但因盆地、平原等居民密集區(qū)對白唇竹葉青蛇的大量捕食也可能是造成白唇竹葉青蛇數(shù)目銳減，而山地、丘陵等居民稀疏區(qū)多發(fā)現(xiàn)竹葉青蛇的原因之一。

因此作者得出初步結(jié)論，從親緣地理學上分析，海南產(chǎn)白唇竹葉青蛇整體呈現(xiàn)出西部地區(qū)往東部地區(qū)遷徙擴散。