HBcrAg在慢性乙型肝炎臨床診療中的研究進(jìn)展

王施剛，楊 春

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院感染科，重慶400016)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是一個全球性問題，全世界約有2.4億慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者[1]。有8%～20%的CHB患者在5年內(nèi)發(fā)展為肝硬化，10%～17%的肝硬化患者在5年內(nèi)發(fā)展為肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)[1-2]。被HBV感染的肝細(xì)胞的細(xì)胞核中存在共價閉合環(huán)狀DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)，其導(dǎo)致了治療中斷后高復(fù)發(fā)率的問題[3]。目前，通常以乙型肝炎e抗原(hepatitis B e antigen,HBeAg)的血清學(xué)轉(zhuǎn)換以及血清HBV DNA水平檢測不出來作為抗病毒治療的終點(diǎn)[3]。然而，即使血清HBeAg轉(zhuǎn)陰、血清HBV DNA檢測不到后，部分患者仍可能發(fā)生肝硬化和肝癌[3]。肝活檢對肝內(nèi)cccDNA和肝內(nèi)HBV DNA進(jìn)行定量檢測能最準(zhǔn)確地反映病毒載量，但由于是侵入性檢測方法，存在抽樣誤差，且缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的檢測方法，目前在臨床實施較為困難。乙型肝炎核心相關(guān)抗原(hepatitis B core-related antigen,HBcrAg)作為HBV感染的一種血清學(xué)標(biāo)志物，其水平可較好地反映HBV DNA和肝內(nèi)cccDNA的情況[4]。HBcrAg檢測方法簡便、臨床可操作性強(qiáng)，具有良好臨床應(yīng)用前景。現(xiàn)就HBcrAg在CHB中的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 HBcrAg的組成及檢測方法

HBcrAg是HBV感染的一種血清學(xué)標(biāo)志物，由HBeAg、乙型肝炎核心抗原(hepatitis B core antigen,HBcAg)以及一種核心相關(guān)蛋白(p22cr)組成，主要在不含HBV DNA的病毒顆粒中發(fā)現(xiàn)[5]。HBcAg、HBeAg以及p22cr均是前c/c區(qū)的編碼產(chǎn)物，有相同的149個氨基酸序列[4]。HBV進(jìn)入肝細(xì)胞內(nèi)，并在細(xì)胞核中形成穩(wěn)定的cccDNA后，HBV開始轉(zhuǎn)錄形成各種信使RNA(messenger RNA，mRNA)。這些mRNAs編碼各種結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白。HBcAg是病毒衣殼的結(jié)構(gòu)成分，可在成熟病毒體中發(fā)現(xiàn)。HBeAg是一種非結(jié)構(gòu)性HBV蛋白，是前c區(qū)N端加工產(chǎn)物。與HBeAg一樣，p22cr也是一種前c區(qū)核心蛋白的加工產(chǎn)物，且可以存在HBV DNA陰性和HBcAg缺乏的Dane樣顆粒中。

目前主要采用化學(xué)發(fā)光酶免疫分析檢測HBcrAg[6]。因HBcAg、HBeAg和p22cr具有相同的氨基酸序列，故一株單克隆抗體即可檢測這3種蛋白質(zhì)。將血清樣品與抗HBcrAg包被的微孔板混合形成抗原-抗體免疫復(fù)合物，再用堿性磷酸酶標(biāo)記的抗HBcrAg結(jié)合微孔板上的免疫復(fù)合物，最終形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，通過測定復(fù)合物的發(fā)光強(qiáng)度定量樣品中HBcrAg的含量。該方法檢測的下限為2.0 lgU/mL，線性范圍為3.0～7.0 lgU/mL(1 kU/mL=3 lgU/mL)。對于HBcrAg>7 lgU/mL的樣品，可通過樣品稀釋來定量HBcrAg的水平。

2 HBcrAg與肝內(nèi)cccDNA和HBV DNA的關(guān)系

目前，肝內(nèi)總HBV DNA與肝內(nèi)cccDNA的相關(guān)性最強(qiáng)(r=0.83，P<0.000 1)，血清HBcrAg、HBV DNA與cccDNA的相關(guān)性較強(qiáng)(r均=0.70，P<0.000 1)，乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)與cccDNA的相關(guān)性較弱(r=0.40，P<0.000 1)[7]。肝內(nèi)HBV DNA的檢測受肝活檢的限制。接受核苷酸類似物[nucleotide analog，NA(s)]治療的患者，在1年的時間內(nèi)通常檢測不到血清HBV DNA。因此，不能使用血清HBV DNA作為cccDNA的替代指標(biāo)，用血清HBV DNA反映cccDNA含量的可靠性也較差[7]。理論上，HBsAg是反映病毒活性和肝內(nèi)cccDNA水平的血清標(biāo)志物，但在接受NA(s)治療的患者中，即使HBV DNA檢測不到時，HBsAg仍可檢測到，HBsAg與cccDNA只有弱相關(guān)性[8]。與cccDNA相關(guān)性較弱的一個原因可能是肝內(nèi)HBV的復(fù)制率較低，此外也存在大量循環(huán)空HBsAg顆粒。HBsAg與cccDNA的弱相關(guān)性在其他研究中也有報道[9]，因此HBsAg并不是一個較理想的cccDNA替代指標(biāo)。

盡管肝內(nèi)總HBV DNA、血清HBV DNA以及HBcrAg均與cccDNA具有良好的相關(guān)性，但HBcrAg與前兩種標(biāo)志物相比具有一定的優(yōu)勢。與血清HBV DNA一樣，測量HBcrAg不需要肝活檢，因此較肝內(nèi)HBV DNA測量更有可行性。此外，HBcrAg測量相對于血清HBV DNA也具有優(yōu)勢，即使血清HBV DNA檢測不到時大部分患者仍可檢測到HBcrAg。在305例接受NA(s)療法的患者中有130例患者檢測不到血清HBV DNA，進(jìn)一步對這130例患者進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，78%的患者可檢測到HBcrAg，且HBcrAg與cccDNA呈正相關(guān)(r=0.42，P<0.000 1)[7]。綜上，在HBV的標(biāo)志物中，HBcrAg是最適合反映肝內(nèi)cccDNA水平的標(biāo)志物。

無論是在臨床還是實驗室環(huán)境中，HBcrAg的檢測都很方便。與血清HBV DNA檢測不同，HBcrAg檢測不需要使用聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增技術(shù)。同時，HBcrAg檢測所需的血清樣本量(150 μL)也低于大部分血清HBV DNA檢測所需的血清樣本量(通常為0.5～1 mL)[7]。

3 HBcrAg有助于確定CHB的階段

對于HBeAg陽性患者，較低的HBcrAg水平提示患者處于強(qiáng)烈的免疫控制之下[10]。Seto等[10]研究發(fā)現(xiàn)，HBeAg陽性的HBV感染者和HBeAg陽性的CHB患者HBcrAg的水平分別為8.54 lgU/mL和7.92 lgU/mL，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，但HBcrAg水平能否反映免疫清除活性還需要進(jìn)一步研究。此外該研究還發(fā)現(xiàn)，HBeAg陽性者HBcrAg的水平高于HBeAg陰性者[10]，這與HBeAg血清轉(zhuǎn)換后HBeAg的產(chǎn)生減少有關(guān)。與HBeAg陽性者不同，若HBeAg陰性者(盡管HBcrAg的水平低于HBeAg陽性者)在HBeAg血清轉(zhuǎn)換后仍有較高的HBcrAg水平，提示患者免疫清除水平較低。研究表明，HBeAg陰性HBV感染者HBcrAg的水平明顯低于HBeAg陰性的CHB患者(2.60 lgU/mL比4.92 lgU/mL，P<0.001)；與HBeAg陰性的HBV感染者相比，HBeAg陰性CHB患者的HBcrAg水平升高，與更明顯的壞死性炎癥和纖維化有關(guān)[11]。

另外，對于發(fā)生了HBsAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換的55例患者來說，71%的患者無法檢測到血清HBsAg的水平，這表明病情較為穩(wěn)定，但仍可在12例患者的血清中檢測到HBcrAg，其HBcrAg的中值為2.7 lgU/mL[10]。HBsAg的血清清除并不意味著HBV的清除。有研究發(fā)現(xiàn)，對發(fā)生HBsAg血清轉(zhuǎn)換的CHB患者進(jìn)行肝活檢仍可檢測到cccDNA，且有46.2%(6/13)的患者血清HBcrAg陽性[12]。

上述發(fā)現(xiàn)為HBcrAg進(jìn)一步確定CHB的感染階段提供了潛在的證據(jù)。最新歐洲肝病學(xué)會指南指出，HBcrAg有助于確定慢性HBV感染的階段，尤其是HBeAg陰性者[13]。目前各階段劃分的最佳截止值仍有待確定，未來期待有更多大樣本、更長周期的前瞻性研究進(jìn)一步探索。

4 HBcrAg檢測的臨床意義

4.1對抗病毒治療的監(jiān)測

4.1.1聚乙二醇干擾素治療 聚乙二醇干擾素可調(diào)節(jié)免疫力，直接抑制病毒，還可以抑制病毒DNA和cccDNA的復(fù)制。病毒HBcrAg的動態(tài)變化可以評估聚乙二醇干擾素治療CHB的效果。Chuaypen等[14]對46例接受聚乙二醇干擾素處理48周的HBeAg陽性CHB患者外周血中HBcrAg的水平進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，15例(32.6%)患者在治療24周后出現(xiàn)病毒學(xué)應(yīng)答(定義為HBeAg清除和HBV DNA <2 000 IU/mL)。與無應(yīng)答者相比，應(yīng)答者cccDNA顯著下降，基線HBcrAg水平與cccDNA相關(guān)(r=0.564，P=0.001)，治療期間相應(yīng)標(biāo)志物的變化與cccDNA的減少相關(guān)(r=0.503，P=0.005)；與無應(yīng)答者相比，應(yīng)答者在治療期間HBcrAg的水平下降更快，且與cccDNA一致；多變量分析顯示，第12周時血清HBcrAg的水平是病毒學(xué)應(yīng)答的預(yù)測因子，HBcrAg的最佳臨界值是8 lgU/mL。治療12周和24周時病毒學(xué)應(yīng)答的陰性預(yù)測值(negative predictive value，NPV)分別為94.4%和100%。因此可根據(jù)HBcrAg的水平預(yù)測CHB患者對抗病毒治療的反應(yīng)。

對于HBeAg陰性的CHB患者，定量HBcrAg已被提議作為定量HBsAg的額外標(biāo)志物。Chuaypen等[15]對121例HBeAg陰性的CHB患者進(jìn)行48周聚乙二醇干擾素單獨(dú)或與恩替卡韋聯(lián)合治療。持續(xù)病毒學(xué)緩解(持續(xù)HBV DNA<2 000 IU/mL)和治療3年后HBsAg的清除率分別為29%(35/121)和9%(11/121)；基線HBcrAg與HBV DNA和cccDNA相關(guān)，但與HBsAg無關(guān)；基線HBsAg的水平以及HBsAg和HBcrAg的下降與持續(xù)病毒學(xué)緩解相關(guān)，而HBsAg的下降可預(yù)測HBsAg的清除率；高基線抗原水平(HBsAg≥3 400 IU/mL以及HBcrAg≥3.7 lgU/mL)導(dǎo)致高的持續(xù)病毒學(xué)緩解陰性預(yù)測值和HBsAg清除率[15]。Martinot-Peignoux等[16]對62例HBeAg陰性CHB患者使用聚乙二醇干擾素單獨(dú)或聯(lián)合替諾福韋酯治療，隨訪發(fā)現(xiàn)，基線血清HBcrAg水平預(yù)測治療1年的持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答的受試者工作特征曲線下面積是0.668，臨界值為3.45 lgU/mL時的陰性預(yù)測值是72%，HBcrAg與HBsAg聯(lián)合時受試者工作特征曲線下面積可達(dá)0.745[16]。定量HBcrAg與HBeAg陰性CHB患者的cccDNA顯著相關(guān)，與HBsAg聯(lián)合可以識別長期隨訪中持續(xù)病毒學(xué)緩解和HBsAg清除率低的患者[16]。

4.1.2核苷酸類似物治療 治療前，HBeAg陽性或陰性的CHB患者均可檢測到HBcrAg，HBeAg陰性者HBcrAg的水平低于HBeAg陽性者[17]。雖然HBcrAg與HBV載量高度相關(guān)，但抗病毒治療后HBcrAg的下降與HBV DNA相比并不太明顯。NA(s)治療期間血清HBV DNA的水平低于最低檢測限時，大部分患者的HBcrAg仍可檢測[7]。兩者的差異可用NA(s)對逆轉(zhuǎn)錄和HBV DNA復(fù)制的抑制來解釋，而HBcrAg是由cccDNA轉(zhuǎn)錄的mRNA翻譯產(chǎn)生，故HBcrAg的產(chǎn)生不受抗病毒藥物的影響[18]。對94例接受過8年連續(xù)NA(s)治療的患者進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，無論是HBeAg陰性還HBeAg陽性者，血清定量HBcrAg的水平從基線到第8年呈現(xiàn)逐年下降的趨勢[19]。經(jīng)過8年的NA(s)治療后，根據(jù)血清HBcrAg和HBsAg評分系統(tǒng)危險分層規(guī)律，只有3.2%的患者可達(dá)到NA(s)戒斷后低復(fù)發(fā)風(fēng)險的標(biāo)準(zhǔn)，說明目前長期NA(s)治療是必要且重要的[19]。

4.2對病情復(fù)發(fā)和耐藥性的預(yù)測 由于NA(s)不能直接抑制cccDNA，部分患者在停藥后易復(fù)發(fā)，因而必須長時間服用藥物，甚至終身服藥[20]。在長期抗病毒治療期間，一些患者可能發(fā)生與耐藥相關(guān)的基因突變，從而導(dǎo)致HBV DNA重新出現(xiàn)，肝炎復(fù)發(fā)，甚至發(fā)生肝功能衰竭。因此，預(yù)防患者產(chǎn)生耐藥以及停藥后復(fù)發(fā)非常重要。HBcrAg可能是監(jiān)測藥物耐藥和停藥后復(fù)發(fā)的潛在生物標(biāo)志物。

血清HBcrAg的水平可預(yù)測病情復(fù)發(fā)，特別是對于HBeAg陰性的CHB患者[13]。對113例達(dá)到NA(s)停藥標(biāo)準(zhǔn)后停藥的CHB患者進(jìn)行隨訪發(fā)現(xiàn)，停止NA(s)治療后1年內(nèi)有63例患者發(fā)生病毒學(xué)復(fù)發(fā)，其血清HBcrAg水平較未復(fù)發(fā)者高，故血清HBcrAg較血清HBV DNA能更好地評價、預(yù)測CHB患者停藥后復(fù)發(fā)[21]。NA(s)治療結(jié)束時HBcrAg>3.7 lgU/mL是預(yù)測病毒學(xué)復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險因素(OR=3.751；95%CI1.187～11.856，P=0.024)。Matsumoto等[22]對34例停用拉米夫定治療的CHB患者進(jìn)行隨訪發(fā)現(xiàn)，無論HBeAg陽性還是陰性患者，復(fù)發(fā)者HBcrAg的水平較未復(fù)發(fā)者高(HBeAg陰性：4.8 lgU/mL比3.0 lgU/mL，P<0.05；HBeAg陽性：5.9 lgU/mL比5.6 lgU/mL，P>0.05)，但是復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組血清HBV DNA水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，血清HBcrAg>3.0 lgU/mL的CHB患者在停用NA(s)治療后1年內(nèi)乙型肝炎的復(fù)發(fā)率為90%(47/53)，且復(fù)發(fā)率隨著HBcrAg水平的升高而升高[23]。因此，CHB患者治療結(jié)束后對血清HBcrAg的水平進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測可幫助識別復(fù)發(fā)的高風(fēng)險人群，從而可對高危人群進(jìn)行有針對性的密切隨訪。

對采用拉米夫定治療的CHB患者進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，治療2年時HBV DNA>2.6 log拷貝/mL的患者的耐藥率明顯高于HBV DNA≤2.6 log拷貝/mL者(P<0.001)，且血清HBcrAg的水平降低的慢于血清HBV DNA，治療后HBcrAg的水平較低者更不易發(fā)生耐藥，血清HBcrAg<4.7 lgU/mL的患者未出現(xiàn)耐藥情況。81例CHB患者接受拉米夫定治療半年后發(fā)現(xiàn)，血清HBV DNA陰性者56例，隨訪2年發(fā)現(xiàn)30%的患者出現(xiàn)耐藥[24]。以上研究表明，血清HBV DNA測量對于鑒定拉米夫定耐藥高風(fēng)險人群是有價值的；而血清HBcrAg測量對于鑒定拉米夫定耐藥低風(fēng)險人群同樣也具有價值。對50例采用聚乙二醇干擾素聯(lián)合NA(s)治療[聚乙二醇干擾素聯(lián)合NA(s)治療4周后聚乙二醇干擾素治療20周，共治療24個月]的CHB患者進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，治療開始時HBsAg高水平(>3.0 lgU/mL)和HBcrAg高水平(>4.5 lgU/mL)是完成治療時無應(yīng)答、無HBeAg血清轉(zhuǎn)換的重要預(yù)測因素[25]。綜上，血清HBcrAg的水平反映的是肝細(xì)胞內(nèi)cccDNA的水平，其對于篩選CHB抗病毒藥物的耐藥性方面有重要作用，可用于預(yù)測抗病毒的療效。

4.3對肝癌及肝移植患者的病情評估 HBcrAg檢測對HCC的發(fā)生具有重要預(yù)測價值[26-28]。對未接受治療的CHB患者進(jìn)行平均10.7年的隨訪發(fā)現(xiàn)，HBcrAg預(yù)測HCC的發(fā)病優(yōu)于血清HBV DNA和HBeAg，HBcrAg>2.9 lgU/mL是HCC發(fā)生的獨(dú)立預(yù)測因子(HR=5.05，95%CI2.40～10.63)[26]。對于接受治療的患者，NA(s)治療后HBcrAg陽性至少2年是HCC的獨(dú)立危險因素[27]。76例CHB患者采用NA(s)治療后均檢測不到血清HBV DNA，與未發(fā)生HCC患者相比，HCC組治療前HBcrAg水平顯著增高(5.45 lgU/mL比4.55 lgU/mL，P=0.005)。治療前HBcrAg>4.67 lgU/mL和治療后HBcrAg>3.89 lgU/mL均能獨(dú)立預(yù)測HCC[28]。HBcrAg也被用來預(yù)測HCC切除或射頻消融后的復(fù)發(fā)。對NA(s)治療期間發(fā)展為HCC并進(jìn)行根治性切除術(shù)或經(jīng)皮消融治療的患者研究發(fā)現(xiàn)，血清HBcrAg>4.8 lgU/mL時，2年內(nèi)HCC復(fù)發(fā)的危險比為8.96(95%CI1.94～41.4)[29]。

肝移植可用于治療HBV感染相關(guān)的肝硬化和肝癌，由于肝外器官并未完全清除HBV，因此肝移植后需要終身抗病毒治療。對于此類患者，因為已經(jīng)慢性感染，故治療的目標(biāo)是防止移植物復(fù)發(fā)肝炎。在肝移植患者中，雖然HBcrAg與肝內(nèi)cccDNA存在顯著相關(guān)性(r=0.616，P<0.001)[30]，但HBcrAg在預(yù)測HCC復(fù)發(fā)、HBV再感染方面的作用尚待確定。Urabe等[31]對21例肝移植前患有HCC的患者進(jìn)行隨訪發(fā)現(xiàn)，肝移植后有5例出現(xiàn)HCC復(fù)發(fā)(HBcrAg陽性的14例中有2例復(fù)發(fā)，HBcrAg陰性的7例中有3例復(fù)發(fā))，HBcrAg陽性與肝移植后HCC的復(fù)發(fā)風(fēng)險無顯著相關(guān)性。對32例肝移植患者進(jìn)行隨訪發(fā)現(xiàn)，有6例出現(xiàn)HBsAg和(或)HBV DNA，16例(50%)檢測到HBcrAg[31]。未來可進(jìn)一步探索HBcrAg是否可以作為肝移植后乙型肝炎免疫球蛋白和NA(s)治療停止的標(biāo)志。

4.4對使用免疫抑制劑人群HBV再激活的預(yù)測 對于隱匿性HBV感染者，如果使用免疫抑制治療或接受造血干細(xì)胞移植有HBV再激活的風(fēng)險[32-33]。隨訪63例接受利妥昔單抗化療的患者發(fā)現(xiàn)，治療2年時觀察到26例患者發(fā)生了HBV再激活，其再激活率高達(dá)41.5%[32]。另有研究隨訪了62例接受造血干細(xì)胞移植的患者，2年時HBV累積再激活率為40.8%[33]。對接受利妥昔單抗化療或造血干細(xì)胞移植的124例亞洲患者進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，基線HBcrAg陽性是HBV重激活的一個重要危險因素，與HBcrAg陰性患者相比，血清HBcrAg陽性超過2年時HBV再激活率顯著更高(P=0.002)[34]。2017年的歐洲肝病學(xué)會指南建議，對于HBV再激活風(fēng)險中等(<10%)或較低(<1%)的單項抗-HBc陽性患者，在接受免疫抑制治療時，推薦每1～3個月監(jiān)測HBsAg和(或)HBV DNA，一旦檢測到HBsAg或HBV DNA逆轉(zhuǎn)，立即開始抗病毒治療[13]。HBcrAg可能在加強(qiáng)HBsAg或HBV DNA監(jiān)測甚至預(yù)防性抗病毒治療中發(fā)揮作用，未來需要進(jìn)一步研究上述人群中HBV再激活的最佳監(jiān)測指標(biāo)，并確定開始治療的最佳時間點(diǎn)。

5 小 結(jié)

HBcrAg作為非侵襲性指標(biāo)，是肝內(nèi)cccDNA的良好替代物，通過檢測患者的血清標(biāo)本即可獲得，有助于確定CHB疾病的階段，可準(zhǔn)確反映CHB患者抗病毒治療效果，預(yù)測CHB患者復(fù)發(fā)、耐藥性以及HCC的發(fā)生。未來需進(jìn)一步探索HBcrAg在肝移植患者中預(yù)測HCC復(fù)發(fā)、HBV再感染以及使用免疫抑制劑治療的CHB患者中的作用。HBcrAg作為一項新的指標(biāo)，在臨床常規(guī)使用之前需要進(jìn)行更廣泛的臨床驗證。相信隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，未來會有更多關(guān)于HBcrAg的臨床應(yīng)用證據(jù)，并逐漸被人們所認(rèn)可。