光遺傳學(xué)在心臟電生理中的研究進(jìn)展

熊永紅，李 維，冷 燕，夏中元

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院麻醉科，武漢 430060)

光遺傳學(xué)是新近出現(xiàn)的一種生物學(xué)研究方法，其可以靶向在細(xì)胞或組織間表達(dá)光敏感蛋白。這些蛋白質(zhì)最初被發(fā)現(xiàn)于微生物內(nèi)，如藻類和古細(xì)菌等，但現(xiàn)已被分離、純化和精制，可以在哺乳動(dòng)物組織中表達(dá)[1]。特定的波長(zhǎng)和強(qiáng)度可以誘導(dǎo)從微生物中提取的光敏感蛋白對(duì)非光敏細(xì)胞的光敏感性。且其誘導(dǎo)產(chǎn)生的離子通量能觸發(fā)細(xì)胞活性，如動(dòng)作電位沿軸突傳播的電信號(hào)。光學(xué)控制動(dòng)作電位產(chǎn)生和傳播的能力在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域引起廣泛關(guān)注[2]。這種新技術(shù)的最大優(yōu)點(diǎn)在于通過利用基因工程方法以時(shí)空精確的方式調(diào)節(jié)神經(jīng)元功能。基因工程方法能在特定神經(jīng)元群體或所需亞細(xì)胞位置中表達(dá)視蛋白。此外，由于光遺傳學(xué)能在毫秒時(shí)間尺度上精確控制光脈沖的寬度、頻率和等待時(shí)間，所以可以用其來研究體內(nèi)神經(jīng)元編碼的潛在行為。研究人員可以選擇性地將光敏感蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞亞群，使其對(duì)光照敏感，并通過光誘導(dǎo)觸發(fā)細(xì)胞超極化或去極化來調(diào)節(jié)細(xì)胞、神經(jīng)或組織的活性[3]。目前，光遺傳學(xué)技術(shù)已被廣泛運(yùn)用于神經(jīng)、癲癇、代謝性疾病、視網(wǎng)膜病、心肌電生理、急性腎損傷及疼痛等領(lǐng)域的研究[4- 6]?，F(xiàn)就光遺傳學(xué)在心臟電生理中的研究進(jìn)展予以綜述。

1 光遺傳學(xué)概述

自1989年起，高分辨率相機(jī)技術(shù)以及幾種電位和細(xì)胞內(nèi)鈣傳感器的開發(fā)使得光學(xué)成像成為心臟研究的有價(jià)值工具。電傳導(dǎo)、動(dòng)作電位和鈣瞬態(tài)形態(tài)可以在高時(shí)空分辨率下直接測(cè)量、量化和跟蹤心肌細(xì)胞，這是傳統(tǒng)電極技術(shù)無法比擬的[7]。

這種新興技術(shù)最先在神經(jīng)科學(xué)中被廣泛應(yīng)用，且越來越多的科研人員在心臟中研究其價(jià)值。目前，學(xué)者已在幾個(gè)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭袌?bào)道了心臟制劑的光遺傳起搏[7]。除節(jié)律控制外，光遺傳學(xué)還被學(xué)者用于終止離體和體內(nèi)嚙齒動(dòng)物心臟的心律失常，抑制和操縱心肌細(xì)胞單層中的轉(zhuǎn)子并闡明心臟中心肌細(xì)胞和非心肌細(xì)胞亞群的功能[8- 9]。由于非接觸式操作和高時(shí)空分辨率，全光學(xué)系統(tǒng)具有獨(dú)特的高吞吐量控制能力，能夠研究可激發(fā)介質(zhì)中可能出現(xiàn)的復(fù)雜現(xiàn)象[10]。因此，光遺傳學(xué)在心臟研究中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，其為心臟的生理學(xué)和病理生理學(xué)研究提供了新方向，且一些獨(dú)有的特征使其成為起搏和心律失常終止的潛在臨床工具。

1.1基本原理 光遺傳學(xué)主要利用光照改變細(xì)胞膜兩側(cè)的離子通透性，當(dāng)神經(jīng)元處于靜息狀態(tài)時(shí)，細(xì)胞膜兩邊存在電位差，即靜息電位。靜息電位的產(chǎn)生是由于膜內(nèi)外各種離子的分布不均衡，以及細(xì)胞膜在不同情況下，對(duì)各種離子的通透性不同造成。當(dāng)神經(jīng)元受到刺激興奮時(shí)，在靜息電位的基礎(chǔ)上發(fā)生一次擴(kuò)布性電位變化，稱為動(dòng)作電位。如給神經(jīng)元轉(zhuǎn)入膜通道蛋白[視紫紅質(zhì)通道蛋白2(channelrhodopsin- 2,ChR2)或嗜鹽菌紫質(zhì)(natronomonas pharaonis halorhodopsin, NpHR)]。當(dāng)用473 nm的藍(lán)色激光照射時(shí)，ChR2通道蛋白的通道打開，允許陽離子(Na+)大量?jī)?nèi)流，產(chǎn)生動(dòng)作電位，即讓神經(jīng)元處于興奮狀態(tài)。當(dāng)用580 nm的黃色激光照射時(shí)，NpHR通道蛋白的通道打開，允許Cl-通過，使神經(jīng)元一直處于靜息電位，即讓神經(jīng)元保持靜息狀態(tài)[11]。

1.2激活神經(jīng)元的通道蛋白 目前，已發(fā)現(xiàn)的激活神經(jīng)元的通道蛋白包括ChR2及其突變體：ChR2最初在單細(xì)胞葉綠素萊茵衣藻中被發(fā)現(xiàn)，其在細(xì)胞膜上形成陽離子通道[12- 13]。當(dāng)表達(dá)ChR2的細(xì)胞受到藍(lán)光照射時(shí)，離子通道開放導(dǎo)致細(xì)胞去極化。ChR2的突變體ChR2(H134R)，將第134個(gè)氨基酸由組胺酸突變?yōu)榫匪幔摰鞍踪|(zhì)可以產(chǎn)生兩倍的光電流，但通道開關(guān)速度比ChR2慢一倍。同時(shí)，突變體ChR2(E123A)具有4 ms的快速通道開放速度；ChR2(E123T/T159C)具有更大的光電流和更快的動(dòng)力學(xué)變化。此外，ChR2的(E123T/H134R)突變體ChETA，使得神經(jīng)元在激光刺激下可以發(fā)放的頻率為200 Hz，而其他的ChR2通道蛋白只能達(dá)到40 Hz。C1V1是由ChR1及由團(tuán)藻發(fā)現(xiàn)的VChR1組合在一起的通道蛋白，在紅色激光刺激下打開通道[14]。

1.3抑制神經(jīng)元活動(dòng)的通道蛋白 抑制神經(jīng)元活動(dòng)的通道蛋白包括NpHR、古紫質(zhì)等。其中，NpHR是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的能有效抑制神經(jīng)元活動(dòng)的光遺傳學(xué)工具，在黃綠激光照射下Cl-進(jìn)入神經(jīng)元內(nèi)，從而抑制神經(jīng)元活動(dòng)[15]。NpHR在哺乳動(dòng)物腦內(nèi)表達(dá)時(shí)，其會(huì)聚集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上表達(dá)，但不能在神經(jīng)元細(xì)胞膜上高量聚集。古紫質(zhì)是一種黃色激光激活的外向整流質(zhì)子泵，其能將帶正電的質(zhì)子從神經(jīng)元內(nèi)移動(dòng)到細(xì)胞外環(huán)境中，使神經(jīng)元處于超極化狀態(tài)，從而保證神經(jīng)元處于靜息狀態(tài)。與NpHR相比，當(dāng)激光關(guān)閉時(shí)，古紫質(zhì)從通道打開狀態(tài)恢復(fù)為關(guān)閉狀態(tài)。褐斑鉤端螺旋體真菌視蛋白——藍(lán)色激光激活的質(zhì)子泵，其能使神經(jīng)元保持超極化狀態(tài)，從而保證神經(jīng)元處于靜息狀態(tài)[14]。

2 光遺傳學(xué)與心臟電生理

人的心臟含有數(shù)十億個(gè)心肌細(xì)胞，每個(gè)心肌細(xì)胞(100 μm×20 μm×20 μm)均包含收縮單位，稱為肌節(jié)；每個(gè)肌節(jié)之間以2 μm的距離排列，可通過光遺傳學(xué)技術(shù)打開或關(guān)閉這些肌節(jié)從而改變心肌細(xì)胞特性[16]。光遺傳學(xué)技術(shù)于2010年首次在斑馬魚和大鼠中用于心臟研究，在斑馬魚模型中ChR2和NpHR的轉(zhuǎn)基因表達(dá)被用于研究心律[17]。且在該研究中，學(xué)者將光遺傳學(xué)和光學(xué)顯微鏡結(jié)合起來，在斑馬魚發(fā)育過程中對(duì)心臟起搏器活動(dòng)的起源進(jìn)行空間映射，并發(fā)現(xiàn)光遺傳學(xué)方法精準(zhǔn)觸發(fā)了可逆性節(jié)律紊亂。Bruegmann等[18]開發(fā)了一種表達(dá)ChR2- (H134R)的轉(zhuǎn)基因小鼠胚胎干細(xì)胞系，并研究其在體外和體內(nèi)的功能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，表達(dá)ChR2小鼠的心肌細(xì)胞和心臟組織通過光刺激誘導(dǎo)，導(dǎo)致鈣離子釋放去極化，從而產(chǎn)生了竇性心律失常和心臟異位起搏。

光遺傳學(xué)提供了一種通過光與光門控離子通道的相互作用來控制可興奮細(xì)胞電活動(dòng)的方法。目前，光遺傳學(xué)已被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)科學(xué)，但它很少被用于研究心臟病理生理學(xué)。然而，干擾心臟電活動(dòng)的光學(xué)方法具有很多優(yōu)點(diǎn)，特別是當(dāng)完全利用光的時(shí)空特性時(shí)[19]。心肌細(xì)胞的功能障礙和心肌細(xì)胞間的相互作用與多種心血管疾病有關(guān)，包括心律失常和心力衰竭[20]。雖然大多數(shù)分子心臟病學(xué)研究已在體外研究了分離的心臟細(xì)胞，但由于技術(shù)困難仍未能闡明心臟的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)。此外，考慮到電刺激無論是治療還是研究均缺乏特異性，所以心臟光遺傳學(xué)有望成為心律失常及心臟起搏治療的替代方案，且由于其靈活性高侵襲性小，目前已成為研究心血管疾病的主要技術(shù)[21]。

2.1心臟起搏 自1950年起，心臟起搏治療發(fā)展非常迅速。20世紀(jì)50年代后期，伴隨右心室最先被起搏，起搏器引起的不同步風(fēng)險(xiǎn)已變得逐漸明顯。雙心室起搏雖然解決了不同步的問題，但僅對(duì)某些患者有益(主要由于左束支傳導(dǎo)阻滯和持續(xù)時(shí)間≥150 ms，左心室功能下降)[22]。因此，研發(fā)一種新的干預(yù)措施對(duì)心臟停搏患者的治療和預(yù)后非常重要。Bruegmann等[18]光誘導(dǎo)ChR2在小鼠體內(nèi)對(duì)心肌細(xì)胞進(jìn)行刺激，該方法能實(shí)現(xiàn)精確的心肌細(xì)胞局部刺激和心臟組織的持續(xù)去極化，從而恢復(fù)心臟節(jié)律。Ambrosi等[23]進(jìn)一步研究開發(fā)了一種新方法，即使用光遺傳學(xué)進(jìn)行選擇性細(xì)胞特異性興奮，其中光學(xué)激發(fā)閾值可用治療效率來表達(dá)。其主要用于測(cè)試心臟組織在治療后結(jié)構(gòu)功能關(guān)系，并恢復(fù)心肌細(xì)胞興奮性。Yamamoto等[24]將興奮性陽離子通道ChR2遞送至大鼠腦中孤束核，刺激轉(zhuǎn)導(dǎo)的神經(jīng)元，結(jié)果顯示膈神經(jīng)元和交感神經(jīng)元活動(dòng)增加，平均動(dòng)脈壓和心率升高。Wengrowski等[25]使用轉(zhuǎn)基因小鼠，使ChR2在小鼠兒茶酚胺能交感神經(jīng)元中表達(dá)，給予光刺激，測(cè)量心律失常的發(fā)生率，并對(duì)心臟進(jìn)行光學(xué)映射以檢測(cè)動(dòng)作電位持續(xù)時(shí)間和傳導(dǎo)速度的變化，結(jié)果表明交感神經(jīng)纖維的光刺激使得心臟更容易發(fā)生心律失常，且發(fā)病率和嚴(yán)重程度更高?？梢?，光學(xué)刺激增加了交感神經(jīng)末梢的活動(dòng)，增加了心肌收縮力和心率，縮短了動(dòng)作電位持續(xù)時(shí)間，并增加了心臟異位起搏和心律失常。

雖然光遺傳學(xué)運(yùn)用于心臟的可行性已被證明，但目前的光學(xué)刺激技術(shù)無法對(duì)持續(xù)的心臟損傷及時(shí)做出反應(yīng)。Scardigli等[26]開發(fā)了一個(gè)全光學(xué)平臺(tái)，以實(shí)時(shí)調(diào)控心電活動(dòng)。該方法可在房室傳導(dǎo)阻滯后恢復(fù)正常電活動(dòng)并恢復(fù)心室內(nèi)正常傳播，同時(shí)也可用于模擬穿過心室的重入電路。這種創(chuàng)新的光學(xué)方法的發(fā)展為實(shí)時(shí)光刺激在正常和異常條件下控制心律，提供了一個(gè)可行的方案。

2.2心臟除顫 心室顫動(dòng)是心源性猝死的最常見原因[27]，其唯一治療方法是通過提供強(qiáng)大的電擊來進(jìn)行除顫。除顫器的植入是一種使用廣泛且有效的治療方法；但由心臟周圍可興奮組織的側(cè)支電信號(hào)通路激活可引起心前區(qū)疼痛，故迫切需要研究不需要高能量沖擊以替代心室顫動(dòng)的治療方法。光遺傳學(xué)是一種選擇性刺激心臟的方法，是電除顫的理論替代方案，涉及在心臟中表達(dá)光敏離子通道(通過基因或細(xì)胞療法)和心臟表面的照射(通過植入的LED燈)以引發(fā)光誘導(dǎo)的激活。與目前臨床使用的電除顫儀相比，光遺傳學(xué)技術(shù)除顫使用的能量更少，避免了心肌細(xì)胞的直接損傷；且特異性靶向技術(shù)可以避免刺激周圍神經(jīng)肌肉引起的疼痛不適[28]。

Karathanos等[29]使用基于生物物理的人體心室模型來確定光刺激療法是否可以終止心室顫動(dòng)，并確定光敏離子通道特性和照明配置的哪些組合是匹配且有效的。結(jié)果表明，當(dāng)大部分(>16.6%)心室組織被足夠明亮的光直接刺激在未偶聯(lián)的細(xì)胞中誘導(dǎo)動(dòng)作電位時(shí)，除顫成功。Nyns等[8]的研究表明，對(duì)進(jìn)行光遺傳學(xué)轉(zhuǎn)染的成年大鼠心臟進(jìn)行簡(jiǎn)單的局部心外膜照射，可以利用光誘導(dǎo)終止室性心律失常。

2.3室性心律失常 目前，室性心律失常是一個(gè)日益嚴(yán)重的問題，其發(fā)病率和死亡率很高[30]。雖然室性心律失常的治療方法取得了重大進(jìn)展，但目前其治療方案仍不理想。即藥物治療沒有明顯效果，而導(dǎo)管消融可能導(dǎo)致不可逆的并發(fā)癥。電擊療法可有效終止室性心律失常，并已顯示可降低死亡率，如植入式心臟除顫器。然而，上述裝置所傳遞的高壓電擊會(huì)造成皮膚創(chuàng)傷，且還與嚴(yán)重的疼痛、焦慮和抑郁、心肌組織損傷有關(guān)[31]。光遺傳學(xué)是一種新興的生物技術(shù)，其使用光門控離子通道以特定、可逆和無損傷的方式電調(diào)節(jié)細(xì)胞、組織和器官。因此，光遺傳學(xué)可能為生物學(xué)和疼痛的發(fā)展提供新思路。研究表明，心臟光遺傳學(xué)允許整個(gè)心臟的光學(xué)起搏和細(xì)胞培養(yǎng)中光誘導(dǎo)的心律失常終止[32]?，F(xiàn)階段主要研究成年大鼠心臟的光遺傳學(xué)修飾是否能夠?qū)崿F(xiàn)光介導(dǎo)終止室性心律失常?？梢?，光遺傳學(xué)已成為治療心律失常的潛在替代方案。Boyle等[33]通過纖維化患者心房核磁掃描重建的計(jì)算模型來探索光遺傳終止房性心動(dòng)過速的可行性，并比較了分布式和靶向式兩種不同照射的區(qū)別。結(jié)果顯示，在成功將光敏感蛋白基因ChR2遞送到心肌細(xì)胞時(shí)，模擬顯示持續(xù)長(zhǎng)于房性心動(dòng)過速周期的目標(biāo)光脈沖可有效終止房性心動(dòng)過速。

Yu等[34]在研究中以腺相關(guān)病毒為載體將古紫質(zhì)T遞送至左星狀神經(jīng)節(jié)。結(jié)果顯示，運(yùn)用發(fā)光二極管照明顯著抑制了左側(cè)星狀神經(jīng)節(jié)功能、左側(cè)星狀神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)活動(dòng)及改變心率變異性的交感神經(jīng)指數(shù)和左心室有效不應(yīng)期；30 min的光照進(jìn)一步增強(qiáng)了光遺傳學(xué)組的這些變化，且所有這些變化在照明關(guān)閉后2 h內(nèi)恢復(fù)到基線。此外，在光遺傳學(xué)組中通過光照降低了缺血誘導(dǎo)的室性心律失常的發(fā)生頻率。以上研究表明，光遺傳調(diào)節(jié)可以可逆地抑制左側(cè)星狀神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)活動(dòng)，從而增加心肌電生理穩(wěn)定性并防止心肌缺血誘導(dǎo)的室性心律失常。Yu等[34]研究的另一個(gè)重要發(fā)現(xiàn)為光遺傳學(xué)可通過心外膜表面的一小塊區(qū)域成功終止室性心律失常。因此，可以預(yù)想通過將目的光源聚焦在相對(duì)較小的心臟表面來治療心律失常。

3 小 結(jié)

在心臟疾病的診療和預(yù)防中，與常規(guī)電除顫和藥物治療方法相比，光遺傳學(xué)技術(shù)有顯著優(yōu)勢(shì)。在心臟研究中，光遺傳學(xué)方法已用于解釋體外和體內(nèi)細(xì)胞的相互作用。除心臟起搏和心律失常外，光遺傳學(xué)方法還可用于細(xì)胞水平研究，使研究人員能夠獲得組織水平和細(xì)胞水平的基本特性[35]。鑒于該領(lǐng)域在臨床的應(yīng)用前景，光遺傳學(xué)可能會(huì)在心臟學(xué)科的預(yù)防和治療上有突破性進(jìn)展。雖然光遺傳學(xué)目前仍有很多技術(shù)問題待解決，但光遺傳學(xué)是一條創(chuàng)新性道路，其能為治療心血管疾病，特別是為替代電除顫研究提供新方法和思路。