紫花苜蓿根瘤菌分子分型和生物型劃分研究

，,,,*，

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070；3.甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070；4.中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)研究中心，甘肅 蘭州 730070)

紫花苜蓿(Medicagosativa)是重要的豆科牧草，具有很強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力和豐富的粗蛋白含量[1]。根瘤菌是有益的土壤細(xì)菌，能夠與苜蓿共生結(jié)瘤固氮，促進(jìn)苜蓿生長(zhǎng)[2-4]和增強(qiáng)土壤肥力[5]。根瘤菌亦能夠在植物組織內(nèi)定殖，增強(qiáng)植株的生物[6]和非生物[7]抗性。目前根瘤菌的分類(lèi)傾向于在種水平上進(jìn)行[8]，常用的微生物分型技術(shù)又在相對(duì)分辨率、時(shí)間和成本上存在差異[9]，重復(fù)性、再現(xiàn)性低。研究發(fā)現(xiàn)持家基因(housekeeping gene)在各個(gè)發(fā)育階段所有組織中均恒定表達(dá)，是維持細(xì)胞基本生命活動(dòng)所必需的一類(lèi)基因。持家基因多位點(diǎn)序列分型(multilocus sequence typing，MLST)通過(guò)直接比較核苷酸序列鑒定了至少7個(gè)位點(diǎn)的等位基因[10]，相比微生物常用分型技術(shù)有重大改善。Berkum等[11]應(yīng)用MLST技術(shù)對(duì)土壤根瘤菌種群基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，鑒定出與紫花苜蓿結(jié)瘤共生的根瘤菌屬于Sinorhizobiummeliloti和Sinorhizobiummedicae兩個(gè)種。張延明[12]采用此方法將309株大豆根瘤菌株分為10個(gè)基因種。MLST技術(shù)能夠很好地鑒定根瘤菌屬內(nèi)不同種，然而對(duì)同種內(nèi)根瘤菌株進(jìn)行劃分的方法存在差異。Martinez[13]將一組可以根據(jù)生理或生化特性區(qū)別于同一物種其他菌株的細(xì)菌菌株劃分為生物變體(biovars)，又根據(jù)植物宿主的共生能力和宿主范圍的差異將細(xì)菌劃分為共生變體(symbiovars)。關(guān)于生物變體和共生變體的劃分在Rhizobium[14]、Bradyrhizobium[15]、Sinorhizobium[16-18]和Mesorhizobium[19]根瘤菌中均有報(bào)道。根瘤菌生物型是指同一種內(nèi)的一組根瘤菌，它們可以根據(jù)表型和在苜蓿品種上的特定共生模式而區(qū)別于其他菌株。生物型是在種內(nèi)苜蓿品種水平上而不是種間寄主植物范圍水平上，根據(jù)表型生理生化特征和共生基因序列信息對(duì)根瘤菌進(jìn)行的更為深入的鑒定，是表型變體和共生變體的結(jié)合。屬于同一物種的菌株表型是有差異的，它們可能具有與共生相關(guān)的相同等位基因，但會(huì)表現(xiàn)出不同的共生效應(yīng)[20-21]，這為同一種內(nèi)基因差異的比較以及根瘤菌的分型奠定了基礎(chǔ)。因此在分子生物學(xué)分型的基礎(chǔ)上，可以根據(jù)表型差異和在苜蓿品種上的共生模型將同種的根瘤菌株劃分為生物型。近年來(lái)根瘤菌分型主要以表型生理生化特征或共生能力為依據(jù)，將這兩個(gè)因素結(jié)合對(duì)根瘤菌種內(nèi)生物型的劃分鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究采用MLST技術(shù)對(duì)根瘤菌分型定種，從表型和與苜蓿品種的共生效應(yīng)兩個(gè)角度對(duì)種內(nèi)根瘤菌進(jìn)行生物型劃分，為準(zhǔn)確判斷與苜蓿品種匹配的根瘤菌資源多樣性以及為苜蓿與根瘤菌高效共生奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

采樣時(shí)間為2014年5月和8月，地點(diǎn)為甘肅省白銀市會(huì)寧縣會(huì)師鎮(zhèn)牧草試驗(yàn)基地、武威市涼州區(qū)黃羊鎮(zhèn)牧草試驗(yàn)站和甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)蘭州牧草試驗(yàn)站，樣地基本概況如表1所示。

1.2 苜蓿品種

5個(gè)供試苜蓿品種均為紫花苜蓿，已生長(zhǎng)2年，分別為國(guó)內(nèi)選育品種甘農(nóng)3號(hào)(M.sativacv. Gannong No.3)和甘農(nóng)9號(hào)(M.sativacv. Gannong No.9)、地方品種隴中(M.sativacv. Longzhong)和清水(M.sativacv. Qingshui)、引進(jìn)美國(guó)品種WL168HQ(M.sativacv. WL168HQ)，見(jiàn)表1。

表1 樣地概況Table 1 Geographical origin, ecological characteristics, and properties of sampled soils

1.3 培養(yǎng)基和營(yíng)養(yǎng)液

根瘤菌株培養(yǎng)采用YMA(yeast mannitol agar)培養(yǎng)基[22]，活化采用TY(tryptone yeast)培養(yǎng)基，營(yíng)養(yǎng)液采用Hoagland有氮和無(wú)氮營(yíng)養(yǎng)液[23]。

1.4 菌株分離及純化

于2014年5月(初花期)在每個(gè)苜蓿品種樣地內(nèi)隨機(jī)取5株植株，攜帶10 cm內(nèi)根際土壤連根挖起，抖落根際土壤并取樣；田間土壤取植株周?chē)?0 cm、深度20 cm內(nèi)的土壤；8月(成熟期)田間收集種子，并清選。分別裝于自封袋，標(biāo)記，冰桶冷藏條件下帶回實(shí)驗(yàn)室。清洗植株，晾干表面明水后用無(wú)菌剪刀將植株分為花、莖、葉、根瘤、根表皮和根中柱；將種子及以上組織各稱(chēng)取1 g置于無(wú)菌三角瓶?jī)?nèi)，加碘伏(0.45%～0.55%)溶液震蕩滅菌3 min[24]，無(wú)菌水沖洗5次，加2 mL無(wú)菌水在研缽中研磨均勻[24]。分別稱(chēng)取10 g根際土壤和田間土壤置于無(wú)菌三角瓶?jī)?nèi)，加入90 mL滅菌生理鹽水，充分震蕩。將組織研磨勻漿和土壤懸浮液轉(zhuǎn)入2 mL離心管離心(4000 r·min-1，10 min)，用無(wú)菌水依次配置成10-3、10-4、10-5稀釋液，取0.2 mL稀釋平板法涂抹至含剛果紅的YMA培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)48 h，進(jìn)行內(nèi)生菌株分離和純化，每個(gè)處理4個(gè)重復(fù)。純化后的菌株經(jīng)過(guò)形態(tài)特征和革蘭氏染色檢驗(yàn)，于4 ℃保存于YMA培養(yǎng)基。

1.5 DNA提取和PCR擴(kuò)增

用上海生工細(xì)菌DNA提取試劑盒(SK8256)提取細(xì)菌基因組DNA，方法參見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。對(duì)細(xì)菌的16S rRNA以及atpD、glnII和recA持家基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增引物參考Weisburg等[25]和Vinuesa等[26]的文獻(xiàn)。所有引物均由上海生工生物公司合成，擴(kuò)增引物和PCR條件見(jiàn)表2。

表 2 16S rRNA, atpD, glnII和recA基因PCR擴(kuò)增及測(cè)序引物Table 2 Primers used for amplification and sequencing of 16S rRNA, atpD, glnII and recA genes

1.6 序列測(cè)定分析

供試菌株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物委托上海生工生物公司進(jìn)行測(cè)序。通過(guò)EzBioCloud鑒定服務(wù)網(wǎng)站 (https://www.ezbiocloud.net/)[27]獲得與目的序列同源性最高的模式菌株16S rRNA序列；通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù) (www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly)選擇與目的序列同源性最高的模式菌株atpD、glnII和recA序列。用MEGA 6.0軟件中的ClustalW進(jìn)行序列相似性比對(duì)[28]，選用Neighbor-joining法(鄰接法)進(jìn)行UPGMA(非加權(quán)組平均法 unweighted pair-group method with arithmetic means)分析生成系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，發(fā)育樹(shù)用Bootstrap法(自展法，1000次重復(fù))檢驗(yàn)。

1.7 表型特征測(cè)定及數(shù)值分類(lèi)分析

以YMA固體平板培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，對(duì)根瘤菌進(jìn)行唯一碳氮源、抗逆性以及生理生化特性測(cè)定。唯一碳源測(cè)定項(xiàng)目包括蘋(píng)果酸、肌醇、肌酸、甘露醇、蔗糖、葡萄糖、延胡索酸、琥珀酸、D-果糖和乳糖；唯一氮源包括L-色氨酸、甘氨酸、精氨酸、L-組氨酸和苯丙氨酸；染料抗性測(cè)定包括溴百里酚藍(lán)、甲基紅、甲基綠、溴酚藍(lán)、亞甲基紅、中性紅、亞硝酸鈉、孔雀石綠、溴甲基綠和剛果紅；唯一碳氮源利用和染料抗性測(cè)定設(shè)定濃度為1%；抗生素敏感性測(cè)定包括紅霉素、氯霉素、卡納霉素、氨芐霉素、新霉素、鏈霉素和慶大霉素，設(shè)置濃度梯度為5、50、100和300 μg·mL-1；NaCl的濃度梯度為2%、4%和6%，耐酸堿性測(cè)定pH為5、9和11，生長(zhǎng)溫度包括8 ℃、37 ℃和40 ℃。生理生化試驗(yàn)包括淀粉水解實(shí)驗(yàn)、明膠水解實(shí)驗(yàn)、產(chǎn)硫化氫實(shí)驗(yàn)、VP實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)、接觸酶反應(yīng)、檸檬酸鹽實(shí)驗(yàn)、3-酮基乳糖反應(yīng)和BTB產(chǎn)酸產(chǎn)堿反應(yīng)。菌株接種均設(shè)有3個(gè)陽(yáng)性重復(fù)和1個(gè)陰性對(duì)照，除生長(zhǎng)溫度測(cè)定實(shí)驗(yàn)在5～7 d后記錄菌體生長(zhǎng)狀況外，其余所有菌株接種后均于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24～48 h后記錄菌體生長(zhǎng)狀況[29]。所有滅菌均采用121 ℃、26 min條件。

對(duì)根瘤菌的表型特征進(jìn)行數(shù)值分類(lèi)分析。將測(cè)定的表型性狀結(jié)果按陽(yáng)性記為“1”，陰性記為“0”進(jìn)行編碼后，輸入計(jì)算機(jī)。剔除全同性狀，利用NTSYS-PC 2.0 軟件，采用平均連鎖法(UPGMA)生成聚類(lèi)樹(shù)狀圖。

1.8 共生固氮能力測(cè)定

種子處理、培苗以及根瘤菌菌液的制備方法參考李劍鋒等[30]的文獻(xiàn)。在幼苗生長(zhǎng)第15天時(shí)，在無(wú)菌條件下用移液槍將制備好的菌液加入幼苗根部，每管4 mL，加棉塞無(wú)菌培養(yǎng)。以不含根瘤菌的菌液為對(duì)照，每個(gè)菌株4個(gè)試管作為重復(fù)。培養(yǎng)第22和30天，在無(wú)菌條件下澆灌Hoagland無(wú)氮營(yíng)養(yǎng)液，30 d后去掉棉塞，然后每隔5 d澆灌1次Hoagland無(wú)氮營(yíng)養(yǎng)液[27]，每管4 mL。

接種效果測(cè)定：接種45 d后，收獲苜蓿植株并清洗干凈，用濾紙吸干水分。每管隨機(jī)選取3株，測(cè)算單株根瘤數(shù)、根瘤直徑[28]、固氮酶活性[31]、根瘤等級(jí)[32]、單株有效根瘤重、株高、單株葉片數(shù)、地上鮮重、地上干重、葉綠素含量[33]、粗蛋白含量[32]、根長(zhǎng)、地下鮮重和地下干重[34]。

1.9 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤表示測(cè)定結(jié)果，分別對(duì)不同菌株接種處理進(jìn)行單因素方差分析，并用Duncan法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較[35]；采用Excel 2007制表；用SPSS 19.0進(jìn)行主成分分析[36]；Shannon多樣性指數(shù)計(jì)算方法參考柯春亮等[37]的文獻(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 16S rRNA測(cè)序分析

對(duì)所有細(xì)菌的16S rRNA基因進(jìn)行部分序列測(cè)定，結(jié)果表明，78個(gè)純化的菌株中，僅20株菌屬于根瘤菌屬(圖1)。其中內(nèi)生菌株分別分離自根表皮(2)、根瘤(5)、根中柱(3)、莖(1)和種子(1)。8株非內(nèi)生根瘤菌株來(lái)自根際土壤(3)和田間土壤(5)。如圖1所示，所有菌株均與模式菌株RhizobiumradiobacterATCC 19358T聚在一起，序列相似性為97.15%～98.72%。

2.2 根瘤菌atpD、glnII和recA基因以及合并序列MLST分析

對(duì)20個(gè)菌株的持家基因atpD、glnII和recA進(jìn)行測(cè)序分析，結(jié)果如圖2所示。基于atpD(圖2a)、glnII(圖2b)和recA(圖2c)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)表明菌株的系統(tǒng)發(fā)育地位不穩(wěn)定，雖然所有菌株在3個(gè)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中均形成8個(gè)分支， 但是菌株的進(jìn)化地位存在差異。單個(gè)的持家基因系統(tǒng)發(fā)育分析不足以準(zhǔn)確地對(duì)供試菌株進(jìn)行分類(lèi)。因此， 對(duì)于持家基因合并序列進(jìn)行了MLST分析，建立了20個(gè)菌株和參比菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。 如圖3和表3所示，菌株G3T1、G3P2、WLG2、WLL3、WLJ3、WLL2、WLL4、LT2、WLL5、WTT4、WLN3和LP4與模式菌株R.radiobacterCCBAU 75229T聚在一起；菌株G9TT1、G9TT5、G9TT2和LT3與模式菌株R.radiobacterCCBAU 75204T聚在一起；菌株G9TT4、G3L1、G3G1和G3G2分別與模式菌株R.radiobacterCCBAU 75221T、R.radiobacterHAMBI 1814T、R.radiobacterCCBAU 73262T和R.radiobacterLMG 140T聚在一起。所有菌株序列相似性≥97%。經(jīng)過(guò)持家基因合并序列MLST分析，20個(gè)菌株被定種為R.radiobacter(表3)。

圖1 16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences

圖2 持家基因atpD、glnII和recA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree based on atpD, glnII, and recA gene sequences

續(xù)圖2 持家基因atpD、glnII和recA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Continued Fig.2 Phylogenetic tree based on atpD, glnII, and recA gene sequences

圖3 持家基因atpD、glnII和recA合并序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree established by MLST from concatenated sequences of atpD, glnII, and recA

菌株Strain name組織和部位Plant part involved系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最近種Phylogenetically closest species相似性值Similarity (%)基因種名稱(chēng)Bacterial speciesG3G1中柱 SteleR. radiobacter CCBAU 73262T98放射根瘤菌R. radiobacterG3G2中柱 SteleR. radiobacter LMG 140T98G3L1根瘤 NoduleR. radiobacter HAMBI 1814T97G3P2, LP4表皮 EpidermisR. radiobacter CCBAU 75229T99G3T1, LT2根際土壤 Rhizosphere soilR. radiobacter CCBAU 75229T98G9TT1, G9TT2, G9TT5田間土壤 Field soilR. radiobacter CCBAU 75204T97G9TT4田間土壤 Field soilR. radiobacter CCBAU 75221T97LT3根際土壤 Rhizosphere soilR. radiobacter CCBAU 75204T99WLG2中柱 SteleR. radiobacter CCBAU 75229T99WLJ3莖 StemR. radiobacter CCBAU 75229T99WLL2, WLL3, WLL4, WLL5根瘤 NoduleR. radiobacter CCBAU 75229T99WLN3種子 SeedR. radiobacter CCBAU 75229T99WTT4田間土壤 Field soilR. radiobacter CCBAU 75229T99

注：相似性值和菌株種名由合并序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)決定(參考圖3)。

Note: Similarity and bacterial species was determined based on the position of a given strain in the phylogenetic tree (reference Fig.3).

2.3 表型特征數(shù)值分類(lèi)分析

所有根瘤菌在YMA培養(yǎng)基上呈圓形、光滑、乳白色透明狀，有黏質(zhì)胞外多糖。菌體短桿狀，革蘭氏染色反應(yīng)陰性。對(duì)紫花苜蓿R.radiobacter菌株進(jìn)行72項(xiàng)生理生化性狀測(cè)定，其中29項(xiàng)為全同性狀，對(duì)存在差異的43項(xiàng)性狀以UPGMA聚類(lèi)得到樹(shù)狀圖譜，如圖4所示。在78%的相似性水平上，所有菌株聚為7個(gè)群。群ⅰ包括7個(gè)菌株(G3G1、WLJ3、WLL2、G3L1、G9TT4、G9TT5、G3T1)，群ⅳ包括6個(gè)菌株(G9TT1、G9TT2、WLG2、WTT4、LT2、LT3)，群ⅱ(G3G2、LP4)和群ⅶ(G3P2、WLL5)各包含2個(gè)菌株。群ⅲ、ⅴ和ⅵ分別包含菌株WLL4、WLN3和WLL3。43項(xiàng)差異性狀的鑒別特征如表4所示。群ⅰ、ⅱ、ⅳ和ⅶ的菌株在唯一碳氮源利用、染料抗性、耐溫性、耐鹽性、抗生素耐性和生理生化反應(yīng)方面表現(xiàn)均有不同，Shannon多樣性指數(shù)(H)分別為5.41、2.43、4.08和2.77，菌株表型多樣性豐富。

圖4 20個(gè)R. radiobacter菌株表型數(shù)值分類(lèi)聚類(lèi)圖Fig.4 Numerical taxonomy dendrogram based on the phenotypic features of 20 R. radiobacter isolates

2.4 主成分分析

基于14個(gè)變量的主成分分析表明，在標(biāo)準(zhǔn)化變量中第一主成分解釋了總變異的54.97%，第二主成分解釋了16.65%的標(biāo)準(zhǔn)方差。如圖5所示，在第一主成分上，地上干重(shoot dry weight, SDW)對(duì)苜蓿和根瘤菌共生效率的貢獻(xiàn)率最大。因此選擇地上干重進(jìn)行多重比較，分析菌株的共生效率差異。

2.5 共生效應(yīng)分析

不同根瘤菌株與苜蓿品種互作，共生效果存在差異(表5)。菌株LP4接種甘農(nóng)3號(hào)、菌株G9TT1、G9TT2、G9TT4和G9TT5接種甘農(nóng)9號(hào)、菌株LT2接種隴中、菌株G3P2和G3T1接種清水苜蓿，植株地上干重分別顯著高于未接種處理CK(P<0.05)。所有菌株接種WL168HQ苜蓿，地上干重與CK差異不顯著(P>0.05)。為了比較根瘤菌株在各苜蓿品種上的共生效果，當(dāng)接種根瘤菌的苜蓿品種地上干重顯著高于未接種處理CK時(shí)，標(biāo)記根瘤菌與苜蓿品種共生效應(yīng)為A(P<0.05)，與CK差異不顯著時(shí)標(biāo)記為B(P>0.05)，顯著低于CK時(shí)標(biāo)記為C(P<0.05)。以苜蓿品種為甘農(nóng)3號(hào)、甘農(nóng)9號(hào)、隴中、清水和WL168HQ的順序，將各根瘤菌株的共生效應(yīng)結(jié)合，得到根瘤菌株共生模式，如表5所示。所有R.radiobacter菌株在5個(gè)苜蓿品種上存在6種共生模式，分別為BBBBB(9)、BBBAB(4)、BABBB(4)、ABBBB(1)、BBABB(1)和BBAAB(1)。每個(gè)共生模式代表根瘤菌株與苜蓿品種之間的一種親屬關(guān)系。

2.6 根瘤菌生物分型

具有相同表型，并在苜蓿品種上表現(xiàn)相同共生效應(yīng)的根瘤菌株代表一種生物型。本研究選擇了5個(gè)苜蓿品種在同一物種內(nèi)根據(jù)表型和共生模式進(jìn)行根瘤菌生物型劃分。結(jié)果表明20個(gè)R.radiobacter菌株被劃分為14種生物型，分離自各苜蓿品種的菌株具有豐富的多樣性(表6)。來(lái)自甘農(nóng)3號(hào)苜蓿的菌株被劃分為生物型Ⅰ(G3G1和G3L1)、Ⅱ(G3G2)、Ⅲ(G3P2)和Ⅳ(G3T1)。來(lái)自甘農(nóng)9號(hào)苜蓿的菌株被劃分為生物型Ⅴ(G9TT1和G9TT2)和Ⅵ(G9TT4和G9TT5)。來(lái)自隴中苜蓿的菌株被劃分為生物型Ⅶ(LP4)、Ⅷ(LT2)和Ⅸ(LT3)。來(lái)自WL168HQ苜蓿的菌株被劃分為生物型Ⅰ(WLJ3和WLL2)、Ⅸ(WLG2)、Ⅹ(WLL3)、Ⅺ(WLL4)、Ⅻ(WLL5)、ⅩⅢ(WLN3)和ⅩⅣ(WTT4)。WL168HQ、甘農(nóng)3號(hào)和隴中苜蓿內(nèi)生物型多樣性豐富，Shannon多樣性指數(shù)H分別為2.03、1.39和1.10，甘農(nóng)9號(hào)和清水苜蓿多樣性單一，H為0。

表4 數(shù)值分類(lèi)特征表Table 4 Characteristics distinguishing tested isolates

續(xù)表4 Continued Table 4

注：a由表型聚類(lèi)分析得到的群(參考圖4)；b每個(gè)表型聚類(lèi)群眾所包含的菌株數(shù)量；c供試所有碳源、氮源和染料的濃度均為1%；d+ 菌株反應(yīng)陽(yáng)性, - 菌株反應(yīng)陰性；e反應(yīng)陽(yáng)性的菌株數(shù)量；fA、B、C、D分別表示抗生素濃度為5、50、100和300 μg·mL-1。

Note:aThe clusters obtained from the numerical analysis based on phenotypic properties (reference Fig.4);bNumbers of strains in each cluster;cThe concentrations of tested carbon sources, nitrogen sources and dyes are 1%;d+ Strains were positive, - strains were negative;eNumber of reactions in which strains were positive;fA, B, C and D mean the concentration of antibiotics is 5, 50, 100 and 300 μg·mL-1, respectively.

3 討論

圖5 基于14個(gè)變量的主成分分析Fig.5 Principal component analysis of 14 variables NN(單株結(jié)瘤數(shù))，ENW(有效根瘤重)，ND(根瘤直徑)，NG(根瘤等級(jí))，NNC(根瘤固氮酶活性)，LN(單株葉片數(shù))，SH(株高)，RL(根長(zhǎng))，SFW(地上鮮重)，RFW(地下鮮重)，SDW(地上干重)，RDW(地下干重)，CC(葉綠素含量)和CPC(粗蛋白含量)。NN (nodule number), ENW (effective nodule weight), ND (nodule diameter), NG (nodule grade), NNC (nodule nitrogenase activity), LN (leaf number), SH (shoot height), RL (root length), SFW (shoot fresh weight), RFW (root fresh weight), SDW (shoot dry weight), RDW (root dry weight), CC (chlorophyll content) and CPC (crude protein content).

本研究從甘肅省3個(gè)栽培區(qū)域5個(gè)紫花苜蓿品種的不同部位分離得到78株細(xì)菌，經(jīng)16S rRNA基因部分序列測(cè)定有20株菌屬于Rhizobium。持家基因MLST分析為種內(nèi)根瘤菌株系統(tǒng)發(fā)育地位差異研究提供了依據(jù)，在分子分型以及新種的鑒定方面應(yīng)用廣泛[38-39]。已有研究應(yīng)用此方法將紫花苜蓿根瘤菌鑒定為Sinorhizobiumfredii、S.xinjiangense和S.medicae[29]以及R.leguminosarum[40]，而本研究持家基因合并序列MLST分析表明20株根瘤菌屬于R.radiobacter。這進(jìn)一步證實(shí)了16S rRNA序列分析結(jié)果，也更詳細(xì)地闡明了供試菌株的系統(tǒng)發(fā)育地位。與合并序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)狀結(jié)構(gòu)相比(6個(gè)分支)，在由atpD、glnII和recA基因建立的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上，菌株分散在8個(gè)不同的進(jìn)化分支中。與recA和合并序列MLST系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)不同，在atpD系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中，菌株WTT4和WLL5與其余菌株系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系較遠(yuǎn)，與模式菌株R.radiobacterCCBAU 73262T形成獨(dú)立的分支。同樣的，在glnII系統(tǒng)發(fā)育拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)中，菌株WLL3、WTT4、G3L1和WLL5與模式菌株R.radiobacterCCBAU 75204T聚在一起，遠(yuǎn)離其余菌株形成獨(dú)立分支。這種不確定的系統(tǒng)發(fā)育地位也許是受到水平基因轉(zhuǎn)移現(xiàn)象的影響[16]。

研究表明基因型的改變會(huì)導(dǎo)致可遺傳的變異，然而由它所引起的表型改變是自然選擇的底物[41]。相同基因型的菌株表現(xiàn)出不同的表型特征，這可能是菌株在多個(gè)不同的環(huán)境中生存的結(jié)果[41]。本研究20個(gè)R.radiobacter菌株中有7種表型，說(shuō)明同一個(gè)種的根瘤菌表型多樣性豐富[20]。表型的形成過(guò)程很復(fù)雜，這個(gè)過(guò)程會(huì)影響新的和有益的表型的首次產(chǎn)生，以及進(jìn)化適應(yīng)和創(chuàng)新的可能性[42]。表型的多樣性因此也會(huì)導(dǎo)致根瘤菌株對(duì)苜蓿品種共生適應(yīng)性的差異。

注：同列不同小寫(xiě)字母表示菌株處理間差異顯著(P< 0.05)。下同。

Note: Different lowercase letters within the same column indicate significant differences among strain treatments atP< 0.05 level. The same below.

表6 20株R. radiobacter菌株基于表型和共生模式的生物分型Table 6 Biotyping of 20 R. radiobacter isolates based on phenotype and symbiotic pattern

注：g表型聚類(lèi)結(jié)果如圖4所示；h共生組合中的A、B、C分別表示接種苜蓿品種(甘農(nóng)3號(hào)、甘農(nóng)9號(hào)、隴中、清水、WL168HQ)的地上干重顯著高于CK、與CK差異不顯著、顯著低于CK；i羅馬數(shù)字代表由表型和共生模式?jīng)Q定的生物型。

Note:gPhenotype cluster was shown in Fig.4;hA, B, C in each symbiotic pattern indicates that the shoot dry weight of inoculated plants (in the order ofM.sativacv. Gannong No.3, Gannong No.9, Longzhong, Qingshui, and WL168HQ) was significantly higher than (P<0.05), not significantly different from (P>0.05), or significantly lower than (P<0.05) that of non-inoculated control plants, respectively;iRoman numerals refer to rhizobial biotype for strains determined based on the combined results of phenotype cluster and symbiotic pattern.

同一物種的根瘤菌株在5個(gè)苜蓿品種上共生效應(yīng)表現(xiàn)存在差異。就地上干重而言，所有菌株接種WL168HQ苜蓿均與未接種處理CK差異不顯著(B)。菌株接種甘農(nóng)3號(hào)、甘農(nóng)9號(hào)、隴中和清水苜蓿地上干重顯著高于CK(A)、與CK差異不顯著(B)或顯著低于CK(C)，共生效應(yīng)表現(xiàn)多樣。共生效應(yīng)表現(xiàn)A的菌株在這4個(gè)苜蓿品種上表現(xiàn)出強(qiáng)的共生能力和適應(yīng)性，為根瘤菌與苜蓿品種間的親屬關(guān)系提供了證據(jù)。共生適應(yīng)性越強(qiáng)，親屬關(guān)系越近。6種共生模式代表菌株與苜蓿品種之間的6種親屬關(guān)系。共生模式BBBBB(9)表示菌株與5個(gè)苜蓿品種均無(wú)親屬關(guān)系；BBBAB(4)、BABBB(4)、ABBBB(1)和BBABB(1)表示菌株分別僅與清水、甘農(nóng)9號(hào)、甘農(nóng)3號(hào)和隴中苜蓿有親屬關(guān)系；模式BBAAB(1)代表菌株與隴中和清水苜蓿均有親屬關(guān)系。根瘤菌與苜蓿品種之間的親屬關(guān)系與菌株的寄主來(lái)源沒(méi)有關(guān)系。

同一種基因型根瘤菌中不同生物型的存在是菌株對(duì)不同豆科植物微環(huán)境適應(yīng)性的體現(xiàn)[13]。同時(shí)，由于共生模式可能與共生的質(zhì)粒、島嶼或其他攜帶共生決定因素的染色體有關(guān)，所以側(cè)基因轉(zhuǎn)移和共生信息基因丟失的假設(shè)也可以被用來(lái)解釋同一根瘤菌基因型中生物型的出現(xiàn)[13,16]。根瘤菌生物型由苜蓿品種和根瘤菌共同決定，這也使得對(duì)種內(nèi)根瘤菌劃分成為可能。R.radiobacter基因型根瘤菌株在5個(gè)苜蓿品種上被劃分為14個(gè)生物型，每個(gè)生物型具有特定的表型特征和共生模式。不同苜蓿品種間根瘤菌生物型的種類(lèi)有差異，WL168HQ、甘農(nóng)3號(hào)和隴中苜蓿內(nèi)根瘤菌生物型多樣性很豐富。甘農(nóng)9號(hào)和清水苜蓿多樣性指數(shù)為0，多樣性單一，這可能與數(shù)量太少有關(guān)。就生物型內(nèi)苜蓿品種的多樣性而言，生物型Ⅰ(H=0.69)包含來(lái)自甘農(nóng)3號(hào)和WL168HQ苜蓿的菌株，生物型Ⅸ(H=0.35)包含來(lái)自隴中和WL168HQ苜蓿的菌株，這兩個(gè)生物型內(nèi)苜蓿品種多樣性豐富。其余12個(gè)生物型(H=0)多樣性單一。根瘤菌生物型的劃分對(duì)與苜蓿品種匹配的根瘤菌資源的準(zhǔn)確判斷具有指導(dǎo)意義。除了通過(guò)根瘤菌表型和與苜蓿品種的共生模式劃分根瘤菌生物型之外，應(yīng)進(jìn)一步利用根瘤菌和苜蓿品種基因組的研究結(jié)果加深對(duì)生物型的理解。

4 結(jié)論

同物種根瘤菌株根據(jù)表型和共生效應(yīng)可以劃分為不同的生物型。WL168HQ、甘農(nóng)3號(hào)和隴中苜蓿品種內(nèi)生物型多樣性豐富，甘農(nóng)9號(hào)和清水苜蓿生物型多樣性單一。