高通量測(cè)序技術(shù)在洋河大曲質(zhì)量等級(jí)判定中的應(yīng)用

蘇 葛，王曉慧，董大偉，馬 偉，楊建梅，葉 紅

（江蘇洋河酒廠股份有限公司，江蘇宿遷223800）

俗話說：“曲定酒型”，在曲與酒的關(guān)系上，曲占先導(dǎo)地位。曲即為曲類微生物的載體，曲類微生物作用于糖類或淀粉類物質(zhì)而生成酒[1]。獨(dú)具綿柔特色的洋河酒自明代中后期開始出現(xiàn)大曲制作技藝，并逐漸形成“先制曲、后釀酒”的具有地方特色、較先進(jìn)的生產(chǎn)模式。從此釀酒離不開制曲，曲為酒骨，大曲質(zhì)量直接或間接影響著最終酒的產(chǎn)質(zhì)量。

大曲是重要的菌源，大曲微生物作為釀造環(huán)境中的分解者、消費(fèi)者、初級(jí)生產(chǎn)者和次級(jí)生產(chǎn)者，在整個(gè)釀造鏈中起重要作用。洋河酒廠對(duì)傳統(tǒng)制曲的質(zhì)量判定最早依賴于熟練的制曲工人對(duì)于大曲外觀、香味、斷面、色澤等感官層面的生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)。20世紀(jì)80年代以后，增加了糖化力、酯化力、發(fā)酵力等理化指標(biāo)共同判定。而現(xiàn)階段，隨著高通量測(cè)序技術(shù)在各個(gè)領(lǐng)域中對(duì)微生物群落研究的突破和發(fā)展，利用先進(jìn)技術(shù)破解和揭示傳統(tǒng)釀酒行業(yè)的微觀密碼已是趨勢(shì)所向。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

大曲樣品：洋河自制中高溫大曲。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

Miseq PE300平臺(tái)、美國ABI GeneAmp?9700型PCR儀。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 基因組DNA抽提

待基因組DNA抽提完成后，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)抽提和收集的基因組DNA。

1.3.2 PCR擴(kuò)增

按指定測(cè)序區(qū)域，合成帶有barcode的特異引物。隨機(jī)抽取樣本進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，以確保在較低循環(huán)數(shù)中能夠?qū)⒔^大多數(shù)樣本擴(kuò)增出適宜濃度的產(chǎn)物。PCR 采用 TransGen AP221-02：TransStart Fastpfu DNA Polymerase；每個(gè)樣本3個(gè)平行樣，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)混合后的PCR產(chǎn)物，使用AxyPrep-DNA凝膠回收試劑盒（AXYGEN公司）切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris_HCl洗脫；2%瓊脂糖電泳檢測(cè)。

1.3.3 熒光定量

根據(jù)電泳的定量結(jié)果，使用QuantiFluor?-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)定量，根據(jù)樣本的測(cè)序量要求進(jìn)行相應(yīng)比例的混合。

1.3.4 Miseq文庫構(gòu)建

連接“Y”字形接頭，使用磁珠篩選去除接頭自連片段，利用PCR擴(kuò)增進(jìn)行文庫模板的富集，氫氧化鈉變性，產(chǎn)生單鏈DNA片段。

1.3.5 Miseq測(cè)序

(1)DNA片段的一端與引物堿基互補(bǔ)，固定在芯片上。

(2)另一端隨機(jī)與附近的另外一個(gè)引物互補(bǔ)，也被固定住，形成“橋 (bridge)”。

(3)PCR擴(kuò)增，產(chǎn)生DNA簇。

(4)DNA擴(kuò)增子線性化成為單鏈。

(5)加入經(jīng)改造的DNA聚合酶和帶有4種熒光標(biāo)記的dNTP，每次循環(huán)只合成一個(gè)堿基。

(6)用激光掃描反應(yīng)板表面，讀取每條模板序列第一輪反應(yīng)所聚合上去的核苷酸種類。

(7)將“熒光基團(tuán)”和“終止基團(tuán)”化學(xué)切割，恢復(fù)3'端黏性，繼續(xù)聚合第二個(gè)核苷酸。

(8)統(tǒng)計(jì)每輪收集到的熒光信號(hào)結(jié)果，獲知模板DNA片段的序列。

2 結(jié)果與分析

2.1 春季不同感官等級(jí)大曲群落結(jié)構(gòu)分析

我們選取春季制作后儲(chǔ)存6個(gè)月的貯存曲，邀請(qǐng)大曲感官評(píng)價(jià)經(jīng)驗(yàn)豐富的工作人員在庫房中用傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)判定法挑選感官等級(jí)為優(yōu)等、一等和二等的貯存曲，編號(hào)后分別粉碎過40目篩，-80℃冰箱保存。按照1.3的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行高通量測(cè)序分析，其群落結(jié)構(gòu)分析結(jié)果詳見圖1、圖2，各群落結(jié)構(gòu)豐度占比詳見表1、表2，其中1號(hào)為優(yōu)等曲、2號(hào)為一等曲、3號(hào)為二等曲。

2.2 夏季不同感官等級(jí)大曲群落結(jié)構(gòu)分析

圖1 春季曲群落結(jié)構(gòu)組成圖（細(xì)菌）

圖2 春季曲群落結(jié)構(gòu)組成圖（真菌）

為了進(jìn)一步探究春季和冬季優(yōu)級(jí)大曲中的優(yōu)勢(shì)菌群是否相同，我們又選取夏季制作后儲(chǔ)存6個(gè)月的貯存曲，邀請(qǐng)大曲感官評(píng)價(jià)經(jīng)驗(yàn)豐富的工作人員在庫房中用傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)判定法挑選感官等級(jí)為優(yōu)等、一等和二等的貯存曲，編號(hào)后分別粉碎過40目篩，-80℃冰箱保存。按照1.3的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行高通量測(cè)序分析，其群落結(jié)構(gòu)分析結(jié)果詳見圖3、圖4，各群落結(jié)構(gòu)豐度占比詳見表3、表4，其中1號(hào)為優(yōu)等曲、2號(hào)為一等曲、3號(hào)為二等曲。

圖3 夏季曲群落結(jié)構(gòu)組成圖（細(xì)菌）

表1 春季曲群落相對(duì)豐度占比圖（細(xì)菌）

表2 春季曲群落相對(duì)豐度占比圖（真菌）

圖4 夏季曲群落結(jié)構(gòu)組成圖-真菌

2.3 功能性分析

2.3.1 主體優(yōu)勢(shì)菌發(fā)酵功能分析

2.3.1.1Kroppenstedtia菌屬

Kroppenstedtia屬于高溫放線菌科[2]，釀造中具體作用未知，且目前行業(yè)研究較少。在釀酒過程中，我們推測(cè)Kroppenstedtia菌屬發(fā)酵功能類似高溫放線菌科多數(shù)菌屬，可參與土壤中有機(jī)物的轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生多種酶類物質(zhì)。

2.3.1.2 魏斯氏菌

魏斯氏菌屬于乳酸菌，是一種選擇性厭氧菌，在微氧條件下生長迅速。在釀造過程中，可以發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生乳酸，或者發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生二氧化碳、乙醇或乙酸。其次魏斯氏菌能表達(dá)β-葡萄糖苷酶，并推測(cè)其在發(fā)酵中可降解纖維素[3]。

2.3.1.3 乳酸桿菌/乳酸片球菌

乳酸桿菌/乳酸片球菌屬于乳酸菌，是固態(tài)白酒生產(chǎn)的重要微生物，在發(fā)酵過程中，具有促進(jìn)美拉德反應(yīng)、促進(jìn)酒醅的發(fā)酵、維持釀酒微生態(tài)環(huán)境等作用[4]。

2.3.1.4 芽孢桿菌

芽孢桿菌能產(chǎn)生纖維素酶、半纖維素酶、蛋白酶及葡萄糖異構(gòu)酶等，在芽孢桿菌屬中也有不少能產(chǎn)乳酸的細(xì)菌。其中枯草芽孢桿菌是生成酒體的芳香類物質(zhì)如雙乙酰的菌源，是不可缺少的細(xì)菌。

表3 夏季曲群落相對(duì)豐度占比圖（細(xì)菌）

表4 夏季曲群落相對(duì)豐度占比圖（真菌）

2.3.1.5 高溫放線菌

高溫放線菌被微生物學(xué)界認(rèn)為是一類能夠在極端環(huán)境下生長代謝的革蘭氏陽性、化能異氧菌，該菌屬下的大多細(xì)菌能在較高的溫度（50℃以上）環(huán)境下生長[5]。放線菌不僅參與土壤中有機(jī)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化活動(dòng)，而且產(chǎn)生許多酶類物質(zhì)，例如纖維素酶、蛋白酶、纖維蛋白溶酶、淀粉酶等，定向功能包括：降解淀粉、纖維素、將蛋白質(zhì)水解為多肽、為己酸菌生產(chǎn)繁殖和底物代謝提供前體物質(zhì)等[6]。

2.3.2 等級(jí)曲微生物功能對(duì)比分析

2.3.2.1 春季曲等級(jí)對(duì)比分析

春季曲1#、2#、3#對(duì)比發(fā)現(xiàn)，3類曲的優(yōu)勢(shì)菌種以及相對(duì)豐度占比全然不同，其中優(yōu)等曲的優(yōu)勢(shì)菌種相對(duì)豐富，Kroppenstedtia克羅彭斯特菌屬（屬于一種高溫放線菌）占比55%；魏斯氏菌屬和乳酸桿菌屬同屬于乳桿菌科，共占比22%；這3類細(xì)菌在釀酒中都屬于有益菌，一等曲芽孢桿菌屬占比最高為74%，克羅彭斯特菌屬占比19%，芽孢桿菌也在釀酒中起著重要的作用。二等曲葡萄球菌占比77%（多數(shù)葡萄球菌能分解葡萄糖、麥芽糖和蔗糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣），二等曲發(fā)酵作用較一類、二類曲弱。

2.3.2.2 夏季曲等級(jí)對(duì)比分析

夏季曲1#、2#、3#對(duì)比發(fā)現(xiàn)，3類曲的優(yōu)勢(shì)菌種以及相對(duì)豐度占比全然不同，優(yōu)等曲有益菌占比最高達(dá)93%，其中高溫放線菌占比達(dá)78%，優(yōu)勢(shì)菌種明顯，也反映出一類曲不僅糖化發(fā)酵作用強(qiáng)，同時(shí)也具備較優(yōu)的生香功能；一等曲高溫放線菌占比33%，相對(duì)發(fā)酵功能弱于優(yōu)等曲。二等曲優(yōu)勢(shì)菌種不明顯，其中乳酸菌類偏多，且雜菌種類較多。從此可以看出，斷面表象較差的大曲，功能性不穩(wěn)定，雜菌偏多。

綜上所述，通過高通量測(cè)序技術(shù)能夠更為清晰、直觀地剖析不同質(zhì)量等級(jí)中高溫大曲，并通過不同季節(jié)大曲群落結(jié)構(gòu)比對(duì)可得出以下結(jié)論：（1）優(yōu)等曲有益細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)優(yōu)于一等曲和二等曲；二等曲雖然有一定比例的有益菌，但其優(yōu)勢(shì)菌種不明顯，雜菌較多，所以從微觀細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析，就細(xì)菌發(fā)酵功能而言，優(yōu)等曲＞一等曲＞二等曲，證明了傳統(tǒng)感官判定經(jīng)驗(yàn)的科學(xué)性與一致性；（2）通過春、夏兩季曲的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，以優(yōu)等曲為例，春季優(yōu)等曲優(yōu)勢(shì)菌種為克羅彭斯特菌屬，而夏季為高溫放線菌，因此，我們認(rèn)為，大曲主要菌種構(gòu)成與季節(jié)息息相關(guān)；（3）利用二代測(cè)序研究真菌群落結(jié)構(gòu)暫未發(fā)現(xiàn)重大突破，待進(jìn)一步分析與研究。

3 結(jié)論

傳統(tǒng)中高溫大曲質(zhì)量等級(jí)判定使用感官經(jīng)驗(yàn)判定法，該方法雖簡單、高效，但簡單的感官和理化指標(biāo)并不能從微觀層面鑒定大曲質(zhì)量差異。本研究針對(duì)不同季節(jié)（春季、夏季）產(chǎn)出的不同等級(jí)（優(yōu)等曲、一等曲、二等曲）中高溫大曲進(jìn)行取樣測(cè)定，剖析不同質(zhì)量等級(jí)大曲的微生物群落多樣性。該研究顯示，中高溫大曲感官等級(jí)與微生物優(yōu)勢(shì)細(xì)菌群落組成之間具有一致性，且大曲主要菌種構(gòu)成與季節(jié)息息相關(guān)，利用高通量測(cè)序技術(shù)能夠科學(xué)鑒定中高溫大曲質(zhì)量等級(jí)。本研究對(duì)指導(dǎo)大曲生產(chǎn)及大曲科學(xué)評(píng)價(jià)體系的構(gòu)建具有重要意義。