腸型胃癌細(xì)胞中酪蛋白激酶2相互作用蛋白1與轉(zhuǎn)化生長因子β1表達(dá)的相關(guān)性

尹丹 曹穎 王禮鑫 馬亮，3 褚明亮 王劍 文建力 官志忠

1貴州醫(yī)科大學(xué)病理教研室（貴陽550004）；2貴州省人民醫(yī)院病理科（貴陽550002）；3貴州大學(xué)醫(yī)學(xué)院（貴陽550025）

胃癌是消化系統(tǒng)常見惡性腫瘤之一。Lauren分型是常用的胃癌組織病理學(xué)分型方法，將胃癌分為腸型、彌漫型、混合型和不確定型。我國胃癌高發(fā)并以腸型胃癌為主，因此研究腸型胃癌的發(fā)病機(jī)制對(duì)胃癌防治有著重要意義。

目前認(rèn)為胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程中，涉及多種促癌、抑癌基因的表達(dá)失調(diào)，最終導(dǎo)致各種蛋白產(chǎn)物的表達(dá)失衡［1］。酪蛋白激酶2 相互作用蛋白1（casein kinase 2 interaction protein 1，CKIP-1）是新近發(fā)現(xiàn)的一種調(diào)控蛋白。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，CKIP-1 可能作為一種抑癌基因參與了腸型胃癌的分化、浸潤及轉(zhuǎn)移［2］，但確切分子機(jī)制并不清楚。近年來，轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中的作用逐漸引起了學(xué)者的重視，胃癌細(xì)胞通過上調(diào)TGF-β1表達(dá)后促進(jìn)了胃癌細(xì)胞浸潤及轉(zhuǎn)移［3-4］。近期有研究報(bào)道，CKIP-1 可能在TGF-β1通路中發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用，是TGF-β1的負(fù)性調(diào)節(jié)因子［5］，但腸型胃癌中CKIP-1 是否通過負(fù)性調(diào)節(jié)TGF-β1表達(dá)參與了癌細(xì)胞的惡性分化及浸潤轉(zhuǎn)移，未見相關(guān)研究報(bào)道。本研究通過觀察不同分化腸型胃癌細(xì)胞中CKIP-1 與TGF-β1表達(dá)及相關(guān)性，構(gòu)建過表達(dá)及干擾表達(dá)CKIP-1的人腸型腺癌MKN28細(xì)胞后檢測TGF-β1表達(dá)改變，初步探討腸型胃癌細(xì)胞中CKIP-1與TGF-β1表達(dá)的相關(guān)性及其在腸型胃癌惡性轉(zhuǎn)化中的可能作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 人腸型胃癌MKN28 細(xì)胞、SGC7901細(xì)胞、BGC823 細(xì)胞、MKN45 細(xì)胞、AGS 細(xì)胞及人腎細(xì)胞293T 分別購于湖南贏潤生物技術(shù)有限公司及中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所細(xì)胞庫。

1.2 主要試劑 兔抗CKIP-1 多克隆抗體、兔抗TGF-β1多克隆抗體及兔抗GAPDH 抗體購于Abcam公司；pLenti CMV Puro Empty 質(zhì)粒、pLKO.1-Puro 質(zhì)粒、pLenti CMV-no-target 質(zhì)粒及pLko.1-non-target 質(zhì)粒購于Addgene 公司；CKIP-1 質(zhì)粒、PMD2G 質(zhì)粒及PAPSX2 質(zhì)粒購于上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司。

1.3 過表達(dá)及干擾表達(dá)CKIP-1 的人腸型腺癌MKN28 細(xì)胞模型構(gòu)建

1.3.1 過表達(dá)和干擾表達(dá)CKIP-1 的慢病毒載體構(gòu)建 構(gòu)建過表達(dá)CKIP-1 載體pLenti CMV-CKIP-1 和干擾表達(dá)CKIP-1 載體pLKO.1-CKIP-1，其中CKIP-1 過表達(dá)有效序列為5-ATGATGAAGAACAATTCCG-3（上游），5-TCACATCAGGCTCTTCCGGATC-3（下游）；CKIP-1 干擾表達(dá)有效序列為：5-CCGGCCTGAGTGACTATGAGAAGCTCGAGCTTCT -CATAGTCACTAAGGTTTTTG-3（上游），5-AATTCA AAAACCTGAGTGACTATGAGAAGCTCGAGCTTCTCATAGTCATCAGG-3（下游）。構(gòu)建成功后經(jīng)基因測序與比對(duì)分析基因序列與NCBI 公布的序列完全一致。

1.3.2 慢病毒包裝 將構(gòu)建好的質(zhì)粒、pLenti CMV-no-target 質(zhì)粒、pLko.1-non-target 質(zhì)粒、PMD2G 質(zhì)粒、PAPSX2 質(zhì)粒分別進(jìn)行高純度無內(nèi)毒素抽提，測序成功后將目的質(zhì)粒與輔助包裝質(zhì)粒（PMD2G、PAPSX2）共轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞，6 h 后更換完全培養(yǎng)基，48 和72 h 分別收集細(xì)胞上清液置于-80 ℃冰箱保存。分別以pLenti CMV-no-target 空載組、pLko.1-non-target 空載組作為陰性對(duì)照組。

1.3.3 病毒感染細(xì)胞及穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的篩選 取對(duì)數(shù)期人腸型胃癌MKN28 細(xì)胞接種于6 孔板中，鋪板過夜后更換培養(yǎng)基，分別加入適量病毒液及Polybrene（終濃度為6 μg/mL），72 h 后更換含有10 μg/mL 的嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基進(jìn)行嘌呤霉素抗性篩選，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%左右進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 Real-time PCR 檢測 提取總RNA，然后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；按照RT-PCR 試劑盒說明書進(jìn)行Real time PCR 擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)體系均為20 μL。用于擴(kuò)增CKIP-1 的引物序列5-AGGTTCAGGGACTGGGAGAT-3（上游），5-TCTGCAGGTCCATCTG TCTG-3（下游）。以β-actin 作為內(nèi)參基因，β-actin的引物序列5-TGGCACCCAGCACAATGAA-3（上游），5-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3（下游）。

1.5 Western blotting 檢測 收集細(xì)胞提取總蛋白并蛋白定量。經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜裝置將膠上的蛋白轉(zhuǎn)到PVDF 膜上。分別將PVDF 膜與一抗CKIP-1（1∶1 000）、TGF-β1（1∶500）及GAPDH（1∶20 000）4 ℃過夜，TBST 洗膜，二抗室溫孵育1 h，TBST 洗膜，ECL 化學(xué)發(fā)光法顯色、定影。用Labworks 軟件分析結(jié)果時(shí)以GAPDH蛋白條帶作為內(nèi)參照，計(jì)算CKIP-1、TGF-β1蛋白條帶與GAPDH 蛋白條帶像素灰度的百分比值作為CKIP-1、TGF-β1蛋白表達(dá)的相對(duì)水平。各組均設(shè)復(fù)孔3 個(gè)，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以表示。組間比較采用單因素方差分析，后續(xù)組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用秩和檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Spearman 相關(guān)性分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同分化腸型胃癌細(xì)胞CKIP-1 與TGF-β1表達(dá)及相關(guān)性 與高分化胃癌MKN28 細(xì)胞相比，中分化SGC7901 細(xì)胞與低分化BGC823、MKN45及AGS 細(xì)胞CKIP-1 表達(dá)降低、TGF-β1表達(dá)升高（P＜0.01）；與中分化SGC7901 細(xì)胞相比，低分化BGC823、MKN45 及AGS 細(xì) 胞CKIP-1 表 達(dá) 降 低、TGF-β1表達(dá)升高（P＜0.01）。Spearman 相關(guān)性分析顯示，CKIP-1 與TGF-β1在不同分化腸型胃癌細(xì)胞中表達(dá)負(fù)相關(guān)（r＝-0.689 2，P＜0.01）。不同分化腸型胃癌細(xì)胞中CKIP-1 與TGF-β1表達(dá)及相關(guān)性見圖1。

2.2 過表達(dá)及干擾表達(dá)CKIP-1 的胃癌MKN28細(xì)胞模型鑒定 與空白對(duì)照組相比，過表達(dá)CKIP-1組mRNA 及CKIP-1 蛋白表達(dá)水平分別增加了282.53% 及256.16%（P＜0.01），干擾表達(dá)CKIP-1組CKIP-1 蛋白及mRNA 表達(dá)水平分別降低了64% 及72%（P＜0.01），陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組CKIP-1 mRNA 及蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示過表達(dá)及干擾表達(dá)CKIP-1 的胃癌MKN28細(xì)胞模型構(gòu)建成功。過表達(dá)及干擾表達(dá)CKIP-1的胃癌MKN28 細(xì)胞CKIP-1 mRNA 及蛋白表達(dá)見圖2。

2.3 過表達(dá)及干擾表達(dá)CKIP-1 的胃癌MKN28細(xì)胞TGF-β1的表達(dá) 與空白對(duì)照組相比，過表達(dá)CKIP-1 組MKN28 細(xì)胞TGF-β1表達(dá)水平下降（P＜0.01），干擾表達(dá)CKIP-1 組MKN28 細(xì)胞TGF-β1表達(dá)水平升高（P＜0.01），陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組TGF-β1表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。過表達(dá)及干擾表達(dá)CKIP-1 的胃癌MKN28 細(xì)胞TGF-β1的表達(dá)見圖3。

3 討論

目前認(rèn)為，腸型胃癌的發(fā)生可能是通過一系列胃黏膜前期病變，如慢性萎縮性胃炎、腸上皮化生、胃黏膜上皮異型增生所構(gòu)成的Correa 氏級(jí)聯(lián)反應(yīng)發(fā)展而來［6］。CKIP-1 是酪蛋白激酶2（casein kinase 2，CK2）相互作用蛋白，其N-末端含有一個(gè)PH 結(jié)構(gòu)域，C-末端含有一個(gè)亮氨酸拉鏈基序的結(jié)構(gòu)域，這種特殊結(jié)構(gòu)使許多蛋白均可與CKIP-1發(fā)生相互作用，參與調(diào)控多條信號(hào)通路，在骨骼、腫瘤發(fā)生發(fā)展、肌肉細(xì)胞分化和免疫等方面發(fā)揮著重要的作用［7-11］。當(dāng)前對(duì)CKIP-1在骨骼中的研究最為深入，CKIP-1 在成年骨形成過程中至關(guān)重要，已成為骨質(zhì)疏松癥治療最有希望的藥物靶點(diǎn)之一［9-10］。近年來研究顯示，CKIP-1 作為一種潛在的腫瘤抑制基因可能在大腸癌發(fā)生發(fā)展中起到重要作用［12-13］。由于胃黏膜腸化生上皮在組織學(xué)上與腸上皮非常相似，腸型胃癌常常發(fā)生于腸化生的基礎(chǔ)上，胃黏膜腸化生上皮向腸型胃癌轉(zhuǎn)變過程可能是否也存在類似的機(jī)制呢？為探討該問題，本課題組前期檢測了胃癌患者癌組織中CKIP-1 的表達(dá)［2］，發(fā)現(xiàn)與正常胃黏膜相比，胃腸化細(xì)胞CKIP-1蛋白表達(dá)顯著增高；而腸型胃癌細(xì)胞CKIP-1 表達(dá)又較胃腸化細(xì)胞CKIP-1 表達(dá)降低，并隨癌細(xì)胞分化程度下降、臨床分期越晚CKIP-1 表達(dá)則越低；干擾CKIP-1 表達(dá)后胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力增加，反之過表達(dá)CKIP-1 蛋白后胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力降低。上述結(jié)果提示，CKIP-1 可能作為一種抑癌基因參與了腸型胃癌的發(fā)生發(fā)展，但CKIP-1 通過調(diào)控哪些下游蛋白或信號(hào)通路參與腸型胃癌的發(fā)生發(fā)展卻并不清楚。

圖2 過表達(dá)及干擾表達(dá)CKIP-1 的胃癌MKN28 細(xì)胞CKIP-1 mRNA 及蛋白表達(dá)Fig.2 The expression of CKIP-1 mRNA and protein in MKN28 cell of gastric cancer with overexpression CKIP-1 and CKIP-1 shRNA

圖3 過表達(dá)及干擾表達(dá)CKIP-1 的MKN28 細(xì)胞TGF-β1的表達(dá)Fig.3 The expression of TGF-β1 protein in MKN28 cell of gastric cancer with overexpression CKIP-1 and CKIP-1 shRNA

TGF-β1是一種具有多種生物學(xué)活性的多肽類細(xì)胞因子［14］。近年來，人們逐漸認(rèn)識(shí)到TGF-β1可能在胃癌的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中起到重要作用。隨胃癌組織分化程度變低、臨床分期的進(jìn)展以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的出現(xiàn)，TGF-β1表達(dá)逐漸增強(qiáng)［4，11，15］，通過刺激血管生成、細(xì)胞播散、免疫抑制及合成細(xì)胞外基質(zhì)等提供適宜腫瘤生長、浸潤及轉(zhuǎn)移的微環(huán)境促進(jìn)胃癌細(xì)胞的生長浸潤及轉(zhuǎn)移［3］。近期有研究提示CKIP-1 可能在TGF-β1通路中發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用。CKIP-1 可上調(diào)泛素連接酶（smad ubiquitination regulatory factor 1，Smurf1）活性［7，13］。Smurf1 是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的可以降解TGF-β1底物Smads 的細(xì)胞因子，推測CKIP-1 可能通過上調(diào)Smurf1 活性后降解Smads 蛋白，從而抑制TGF-β1的表達(dá)，在TGF-β1通路中發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用。另有研究對(duì)不同年齡SD 大鼠軟骨中CKIP-1 和TGF-β受體1 表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨年齡增加CKIP-1 表達(dá)水平升高，而TGF-β 受體1 表達(dá)下降，提示CKIP-1 在關(guān)節(jié)軟骨增齡性變化中可能通過Smad7 的作用而降解了TGF-β受體1［5］。本課題組也發(fā)現(xiàn)過表達(dá)CKIP-1 的前列腺上皮BPH-1 細(xì)胞中TGF-β1表達(dá)下降（數(shù)據(jù)另文發(fā)表），也提示CKIP-1 可能在TGF-β1通路中發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用表達(dá)。

前期研究中筆者發(fā)現(xiàn)臨床胃癌患者癌組織和腸型胃癌細(xì)胞中CKIP-1 表達(dá)與分化浸潤轉(zhuǎn)移負(fù)相關(guān)，推測腸型胃癌組織惡性分化過程中癌細(xì)胞可能通過抑癌基因CKIP-1 表達(dá)下調(diào)，引起Smurf1合成減少及活性抑制，Smads 蛋白降解減少導(dǎo)致TGF-β1表達(dá)增加，加速了癌細(xì)胞的分化、浸潤轉(zhuǎn)移。為探討上述問題，本研究對(duì)不同分化的腸型胃癌細(xì)胞株CKIP-1 和TGF-β1的表達(dá)進(jìn)行檢測并做了相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，隨著胃癌細(xì)胞分化的逐漸降低，CKIP-1 表達(dá)逐漸下降，與前期本課題組對(duì)人胃癌組織中CKIP-1 表達(dá)免疫組化染色結(jié)果一致［2］。與高分化胃癌細(xì)胞相比，低分化胃癌細(xì)胞TGF-β1表達(dá)增加，與文獻(xiàn)報(bào)道一致［15］。相關(guān)性分析顯示不同分化腸型胃癌細(xì)胞中CKIP-1 與TGF-β 1表達(dá)負(fù)相關(guān)，提示隨著癌細(xì)胞分化降低，CKIP-1表達(dá)降低而TGF-β1表達(dá)增高。為進(jìn)一步觀察腸型胃癌中CKIP-1、TGF-β1表達(dá)的關(guān)系，本研究分別構(gòu)建了過表達(dá)及干擾CKIP-1 表達(dá)的人腸型腺癌MKN28 細(xì)胞并檢測各組細(xì)胞TGF-β1表達(dá)變化。結(jié)果顯示，過表達(dá)CKIP-1 的MKN28 細(xì)胞TGF-β1表達(dá)降低，而干擾CKIP-1 表達(dá)的MKN28 細(xì)胞TGF-β1表達(dá)增加，上述結(jié)果提示CKIP-1 與TGF-β1蛋白表達(dá)負(fù)相關(guān)。

綜上，筆者認(rèn)為在腸型胃癌細(xì)胞惡性分化進(jìn)程中，可能通過抑癌基因CKIP-1 表達(dá)下降后上調(diào)TGF-β1的表達(dá)，促進(jìn)了胃癌的惡性轉(zhuǎn)化及浸潤轉(zhuǎn)移，但具體信號(hào)通路尚需進(jìn)一步深入研究，對(duì)CKIP-1 參與調(diào)控信號(hào)通路進(jìn)一步深入研究將有助于了解腸型胃癌發(fā)病機(jī)制，并為CKIP-1 是否能作為胃癌可能分子治療靶點(diǎn)提供有用的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。