臍帶間充質(zhì)干細胞注射液治療戰(zhàn)創(chuàng)傷的療效與機制研究

潘興華，龐榮清，阮光萍，朱向情，蔡學敏，何 潔，趙 晶，劉高米洋，王金祥，呂燕波，李自安，王 強

作者單位：650032昆明，解放軍920醫(yī)院細胞生物治療中心,干細胞與免疫細胞生物醫(yī)藥技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室，云南省細胞治療技術(shù)轉(zhuǎn)化醫(yī)學重點實驗室，云南省干細胞工程實驗室

臍帶間充質(zhì)干細胞（UCMSC）具有強大的抗炎能力，同時可通過定向遷移、定植分化和分泌細胞因子、外分泌體等多成份、多途徑發(fā)揮協(xié)同作用和整體效應(yīng)，能有效促進各種局部和全身性的組織損傷修復(fù)，提高組織細胞的自噬和自我修復(fù)能力，促進血管再生、組織細胞生長，減少細胞死亡，提升機體抗氧化應(yīng)激能力等，這些作用和機制符合戰(zhàn)創(chuàng)傷救治原則和要求，特別是對放射傷的基因和蛋白分子修復(fù)，對挽救高新技術(shù)武器傷傷員的生命和提高救治成功率有一定幫助[1]。

1 HUCMSC制劑規(guī)模化生產(chǎn)技術(shù)、質(zhì)量和安全性研究

建立HUCMSC臨床制劑生產(chǎn)所涉及的原材料篩選、采集、分離純化、擴增、鑒定、儲存、復(fù)蘇和制劑生產(chǎn)、質(zhì)量檢驗及標準、儲存、運輸、使用等基本技術(shù)，通過驗證、優(yōu)化建立完整的HUCMSC注射液的規(guī)模化、工廠化、標準化生產(chǎn)與儲存技術(shù)體系。建立HUCMSC高效制備技術(shù)，每50 cm的臍帶可制備出5代HUCNSC 6×1010個，達到臨床1000例次以上治療量，建成HUCMSC注射液中間產(chǎn)品（UCMSC）及終產(chǎn)品的中試規(guī)模生產(chǎn)、質(zhì)量控制技術(shù)體系，達到產(chǎn)業(yè)化條件[2]。HUCMSC產(chǎn)品質(zhì)量符合臨床標準：（1）生長特性、細胞周期、形態(tài)、結(jié)構(gòu)、功能和活性等指標符合UCMSC 鑒定標準；（2）CD29、CD44、CD90、CD105 陽性率大于90%，CD34、CD45為陰性；（3）可定向誘導(dǎo)分化為骨、軟骨、脂肪、神經(jīng)、胰島及肝細胞樣細胞，分化效率大于90%；（4）培養(yǎng)物、致熱原、重金屬等有害物質(zhì)殘留低于國家藥典標準；（5）HBV、HCV、HIV、MCV 等病毒檢測陰性，無細菌、支原體和衣原體污染；（6）T細胞增殖及干擾素分泌抑制率＞50%；（7）分泌多種生長因子和免疫調(diào)控因子；（8）抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的大鼠炎癥反應(yīng)，降低死亡率、抑制炎癥水平和炎性細胞因子釋放、減輕細胞死亡。建成規(guī)范化細胞儲備庫，制備儲存HUCMSC 1.5萬人份，達到年產(chǎn)HUCMSC注射液10萬人份的能力。HUCMSC注射液的安全性符合臨床制劑的安全標準[3]，在 1×106～1×107細胞/kg的劑量范圍內(nèi)，無急性過敏、溶血、免疫排斥反應(yīng)和慢性毒性，無致瘤與促瘤性。分別按1×106～1×107細胞/kg的劑量，1次/2 w，連續(xù)8次，靜脈注入UCMSC，持續(xù)觀察半年，證實UCMSC在健康成年食蟹猴體內(nèi)無長期殘留、分布、定植及分化，不引起組織器官的結(jié)構(gòu)與功能改變，免疫抑制效應(yīng)在停用2 w后恢復(fù)正常，表明臨床治療量在1×107細胞/kg以下劑量范圍具有安全性保障。

2 動物模型創(chuàng)建及療效評價

采用機械損傷、化學誘導(dǎo)、血管栓塞、放射線照射等方法，創(chuàng)建了12類38種組織損傷模型，其中獼猴和樹鼩模型有腦中動脈栓塞、后肢血管阻塞、顱腦損傷、外周神經(jīng)擠壓傷、全身性放射傷、系統(tǒng)性炎癥、炎癥性多器官功能不全、代謝綜合征、老年退變、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、肝損傷、胰腺損傷等。嚙齒類、兔、犬等動物模型有心、肺、腦、肝、腎、胰腺、骨、皮膚損傷和糖尿病、代謝綜合癥、放射傷、創(chuàng)傷性系統(tǒng)性炎癥、多器官功能不全、衰老等，這些動物模型反映了戰(zhàn)傷中的組織損傷、炎癥、血液循環(huán)障礙、器官功能不全等病理過程[4-5]。

根據(jù)UCMSC的安全劑量范圍、疾病模型的種類和研究目的， 分別按 1×106細胞/kg、5×106細胞/kg 等劑量，1 次/w，連續(xù)1～3次；和隔日1次，連續(xù)1～3次的方式，靜脈注入UCMSC。大腦中動脈栓塞、后肢血管栓塞和胰、肝、腎損傷等模型，按1×107細胞/次的細胞量，通過動脈血管介入，將UCMSC注射到損傷組織的血管內(nèi)。UCMSC治療后，進行動態(tài)檢測或在特定時間點檢測分析UCMSC的療效，示蹤UCMSC的定植、分化情況，觀察組織器官的結(jié)構(gòu)與功能變化，分析UCMSC的作用機制。根據(jù)UCMSC治療后的行為、影像、組織、細胞、生化、免疫功能及疾病特異性指標等變化情況綜合判定療效[6-7]。主要療效為：（1）對全身性放射傷、系統(tǒng)性炎癥和炎癥性多器官功能不全的療效顯著，表現(xiàn)為死亡率下降、存活時間延長、臨床癥狀改善、組織內(nèi)炎性細胞和致炎因子減少，炎癥表現(xiàn)較輕，組織壞死減少，器官功能改善。（2）對缺血性疾病治療，在早期階段療效明顯，表現(xiàn)為缺血區(qū)組織壞死面積或體積減小，可促進血管再生和改善血液循環(huán)，神經(jīng)功能恢復(fù)加快。對慢性缺血性組織損傷有一定療效，主要表現(xiàn)為血管再生和一定程度的功能改善，但組織結(jié)構(gòu)變化差異較大。（3）對于退變性疾病，可增強組織器官功能，提高心輸出量、心腦血流灌注量、腎小球濾過率、纖維化程度降低和膠原含量下降等。（4）對代謝綜合征可促進糖、脂代謝，表現(xiàn)為血糖、血脂含量降低，抑制動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。（5）對其他損傷性疾病可一定程度的改善組織器官結(jié)構(gòu)和功能。

3 UCMSC治療機制研究

3.1 UCMSC的標記及體內(nèi)示蹤 建立了超順磁氧化鐵粒子（SPIO）、強熒光蛋基因（eGFP）、4',6 二脒基 -2-苯基吲哚（DAPI）、5-溴脫氧尿嘧啶核苷 （BRDU）、 熒光素酶（Luc）基因等標記UCMSC技術(shù)，標記率達90%以上。SPIO標記的UCMSC可采用MRI在單細胞水平在體內(nèi)示蹤，無毒性作用，適用于人體內(nèi)追蹤UCMSC。eGFP、Luc基因標記可采用小動物活體成像體內(nèi)示蹤；采用組織熒光觀察顯示UCMSC在組織中的定位，并可采用免疫組織染色法分析UCMSC的分化情況。DAPI、BRDU標記法可通過化學顯色法，顯示UCMSC在體內(nèi)的分布及增殖情況。建立了eGFP+SPIO、eGFP+BRDU等多重標記方法，可采用多種手段同時體內(nèi)示蹤UCMSC。

UCMSC在體內(nèi)的分布有顯著的組織差異性，成年獼猴靜脈輸入 5×106細胞/kg的 UCMSC后 2～4 h內(nèi)，50%～60%的UCMSC滯留于血液和肺組織，如果有急性肺組織損傷時，肺組織滯留量增多，可達80%以上；隨后4～24 h，主要分布于肝、脾、胰、腎髓質(zhì)等血流較豐富的組織中，在骨髓組織中也有分布；在3～28 d內(nèi)，上述組織中仍有UCMSC的分布，但呈逐漸減少趨勢，到60 d時數(shù)量更為稀少。UCMSC具有損傷和炎癥組織趨向性，且沿血管走向分布，損傷和炎癥組織中的UCMSC分布在輸入后4～24 h內(nèi)呈增加趨勢。UCMSC在免疫缺陷鼠體內(nèi)存活時間大于120 d，供受者為同一品系大、小鼠的UCMSC治療，在炎癥和損傷組織中存活時間大約60 d；獼猴、食蟹猴同種異體UCMSC移植的存活時間為40 d，在骨髓組織中存活時間為76 d。而在健康動物體內(nèi)的存活時間則大大縮短，在治療28 d后，只有極少量細胞分布于肺、肝、腎、骨髓等組織。通過靜脈內(nèi)注射的UCMSC也能穿透血腦屏障進入缺血或機械損傷的腦組織，但數(shù)量相對較少，存活時間也不如局部注射長。在卵巢、睪丸組織中的分布于治療2～8 d內(nèi)有增加趨勢，但增加數(shù)量不明顯。UCMSC體內(nèi)示蹤顯示[8-9]：（1）體內(nèi)分布特點與其質(zhì)量、數(shù)量、組織類型、損傷程度、血管分布、健康狀態(tài)、移植途徑等有關(guān)系，對損傷和炎癥組織具有趨向性。（2）存活時間主要與種屬、供受者間的遺傳差異性、免疫功能狀態(tài)、疾病類型有關(guān)，在免疫缺陷動物體內(nèi)存活時間最長，遺傳背景相同或相近的同種異體移植次之，異種間移植存活時間較短。（3）同種異體，甚至是異種間移植未見明顯的急性免疫排斥反應(yīng)，同時均有一定治療作用。（4）組織分布數(shù)量及存活時限有一定量效關(guān)系，但與其療效不成正比，在一些UCMSC分布較少，甚至無分布的組織損傷治療中有明顯療效，說明UCMSC產(chǎn)生的細胞因子、外分泌體發(fā)揮了作用。

3.2 UCMSC的體內(nèi)分化 在誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下UCMSC可被誘導(dǎo)分化為神經(jīng)、胰、骨、脂肪等18種組織類型的成熟細胞。將UCMSC移植于組織損傷動物體內(nèi)，可遷移并定植于損傷組織中，被組織微環(huán)境誘導(dǎo)分化為相應(yīng)組織的成熟細胞并整合于組織之中。UCMSC進入急性肝損傷動物模型的肝組織后，轉(zhuǎn)化為表達CD19和分泌白蛋白的肝細胞樣細胞。將SPIO和eGFP基因標記的UCMSC輸入胰腺損傷獼猴體內(nèi)，部分UCMSC定植于胰腺組織中并表達相應(yīng)的表型標志和分泌胰島素。eGFP標記的UCMSC進入心肌纖維化大鼠心肌組織中可轉(zhuǎn)化為心肌細胞，使左心室的收縮力和心輸出量顯著增加。在腎缺血性損傷、慢阻肺、腦缺血、后肢缺血等模型治療實驗中，UCMSC可向相應(yīng)組織細胞分化，表明UCMSC向損傷組織遷移、定植和分化是其治療組織損傷的重要機制之一。

3.3 UCMSC的分泌作用 質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，UCMSC培養(yǎng)液上清中含有468種蛋白成份，包括調(diào)節(jié)細胞生長、細胞功能、細胞過程及炎癥調(diào)節(jié)等方面的因子，其中促進細胞生長的有 SCF、HGF、TGF、FGF、CSF 等 29 種，參與炎癥與免疫調(diào)節(jié)的因子有42種，提示UCMSC在體內(nèi)分泌的生長因子和炎癥與免疫調(diào)節(jié)因子在組織損傷修復(fù)中發(fā)揮了重要作用。UCMSC的培養(yǎng)液上清中含有大量外泌體(UCMSC-exo),將其與氧化應(yīng)激內(nèi)皮細胞模型共培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)UCMSC-exo可提高模型細胞的自噬能力和抑制凋亡,說明UCMSC-exo有提高氧化應(yīng)激內(nèi)皮細胞的自我修復(fù)能力。UCMSC-exo攜帶有蛋白質(zhì)和核酸等多種生物功能分子，特別是含有大量調(diào)節(jié)細胞修復(fù)、免疫與炎癥及細胞抗衰老的miRNA，且有類似HUCMSC的功能

3.4 調(diào)控基因表達 采用高通量基因測序技術(shù)對幼年、中年、老年獼猴及UCMSC治療的老年獼猴的外周血單個核細胞的全基因轉(zhuǎn)錄組miRNA進行深度測序并通過生物信息學聚類及進行比對分析，發(fā)現(xiàn)UCMSC主要調(diào)控細胞生長、衰老、炎癥和分化相關(guān)基因的表達而發(fā)揮作用。隨著年齡的增長，細胞生長相關(guān)基因表達減少，而炎癥、衰老相關(guān)基因表達升高，UCMSC治療后可有效促進生長相關(guān)基因表達并抑制炎癥、衰老相關(guān)基因表達。通過對UCMSC治療放射傷、慢性阻塞性支氣管炎、系統(tǒng)性性炎癥及代謝綜合征的外周血和組織提取液進行蛋白組學分析，結(jié)果顯示，UCMSC治療可提高血液和組織中多種生長因子的含量，而使炎癥因子、抗氧化應(yīng)激因子的含量降低，結(jié)果與基因轉(zhuǎn)錄分析結(jié)果一致，對UCMSC治療代謝綜合征模型的血液和肝臟進行代謝組學分析，發(fā)現(xiàn)UCMSC可顯著促進脂代謝功能，使血液和肝組織提取液中的脂類含量降低，該療效可能源于UCMSC促進組織損傷的修復(fù)和再生[10]。

4 臨床治療研究啟示

UCMSC的臨床療效與動物模型治療實驗結(jié)果基本一致：（1）對自身免疫和炎癥性疾病的療效顯著，可明顯緩解癥狀，改善器官結(jié)構(gòu)與功能，部分病例可達到治愈效果。（2）對缺血性疾病療效明顯，在缺血性疾病的早期效果最好，可改善臨床癥狀，影像學觀察顯示缺血面積減少，其療效明可能與抑制炎癥和促進缺血組織再生有關(guān)。（3）對于慢性支氣管炎、器官纖維化、退行性變等慢性疾病，UCMSC治療可改善臨床癥狀和器官功能，這主要是UCMSC分泌的細胞因子和外泌體發(fā)揮作用的結(jié)果。（4）對急、慢性疾病及亞健康狀態(tài)的UCMSC治療發(fā)現(xiàn)一些驚奇的伴隨現(xiàn)象，其中包括睡眠、飲食、精神狀態(tài)、現(xiàn)容顏改善，圍絕經(jīng)期月經(jīng)恢復(fù)等，說明UCMSC治療具有促進整體功能的作用。UCMSC適用于戰(zhàn)傷引起的缺血、炎癥及組織變性、壞死等治療。對于戰(zhàn)傷后遺癥治療則需要利用計算機輔助設(shè)計、3D打印、體外培育等技術(shù)研發(fā)出具生物活性組織或器官進行移植治療。