線粒體丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體（MPC）研究進(jìn)展

解文雅 鄒世穎 高如心 賀曉云

（1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院 北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京 100083；2. 農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)（食用）重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083）

線粒體是真核生物進(jìn)行有氧呼吸的主要場(chǎng)所，其主要通過三羧酸循環(huán)（Tricarboxylic acid cycle，TCA）偶聯(lián)氧化磷酸化途徑將糖類、脂肪及蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換為三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate，ATP）為機(jī)體提供能量。丙酮酸是多種物質(zhì)合成代謝和分解代謝的重要中間物質(zhì)，包括氧化代謝、糖異生途徑、TCA循環(huán)、脂質(zhì)從頭合成及膽固醇合成等途徑，丙酮酸的生成場(chǎng)所主要是細(xì)胞質(zhì)，但其發(fā)揮作用的場(chǎng)所是線粒體基質(zhì)，而丙酮酸只能通過位于線粒體內(nèi)膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白—線粒體丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體（Mitochondrial pyruvate carrier，MPC）進(jìn)入線粒體基質(zhì)參與三羧酸循環(huán)、糖異生以及脂質(zhì)、氨基酸等代謝過程，為機(jī)體提供能量。因此，MPC可通過調(diào)節(jié)丙酮酸進(jìn)入線粒體基質(zhì)的通量從而調(diào)控機(jī)體的能量代謝。MPC與機(jī)體能量代謝密切相關(guān)，進(jìn)而影響代謝類疾病的發(fā)生和發(fā)展，本文總結(jié)了MPC生物學(xué)功能及其生理功能的研究進(jìn)展，為后續(xù)研究MPC調(diào)控能量代謝的機(jī)制提供思路。

1 MPC的生物學(xué)特性

1.1 線粒體丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體

線粒體丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體是位于線粒體內(nèi)膜（Inner mitochondrial membrane，IMM）上的丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，1970年，Papa和Halestrap［1-2］鑒定出MPC的存在，并將其命名為Brp44L（brain protein 44-like）和 Brp44（brain protein 44），而負(fù)責(zé)線粒體丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白于2003年在酵母中鑒定出來，2012年在哺乳動(dòng)物中得到進(jìn)一步鑒定［3-5］。2012年，Bricker和Herzig等［5-6］分別利用遺傳學(xué)和生物學(xué)的方法鑒定得到MPC的分子結(jié)構(gòu)，在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，MPC由MPC1和MPC2兩個(gè)亞基組成（即Brp44L和Brp44），任何一個(gè)亞基失去活性都會(huì)導(dǎo)致MPC復(fù)合體的活性喪失，線粒體丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)和利用率降低。Mpc1基因組全長(zhǎng)約18 095 bp，含有5個(gè)外顯子；Mpc2基因組全長(zhǎng)約為20 312 bp，含有5個(gè)外顯子。MPC1和MPC2在線粒體內(nèi)膜上含有2個(gè)跨膜的α螺旋結(jié)構(gòu)，兩者共同形成的蛋白復(fù)合體分子量約為150 kD，有研究表明，MPC突變后會(huì)導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)各種疾病，如乳酸性酸中毒、高丙酮酸血癥以及其他嚴(yán)重性疾?。?，6］。

1.2 MPC調(diào)控機(jī)體能量代謝平衡

Vacanti等［7］利 用 shRNA（Short hairpin RNA）技術(shù)和化學(xué)抑制劑（UK5099）的方法抑制C2C12成肌細(xì)胞中MPC的表達(dá)，再利用13C追蹤技術(shù)檢測(cè)代謝產(chǎn)物的變化，MPC1活性受到抑制后，葡萄糖/丙酮酸的氧化速率下降，脂質(zhì)氧化速率增加，能量代謝也發(fā)生了轉(zhuǎn)變，細(xì)胞生長(zhǎng)由依賴于糖代謝轉(zhuǎn)變?yōu)橐蕾囉谥|(zhì)代謝和氨基酸代謝。

全敲Mpc1/2導(dǎo)致胚胎死亡，表明Mpc1/2在胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用。2016年，Vanderperre等［8］研究了高酮體飼料對(duì)全敲性小鼠的影響，在MPC1-/-小鼠懷孕期間給予高酮體飼料可使小鼠順利分娩，原因是酮體可直接為機(jī)體提供乙酰輔酶A，參與TCA循環(huán)，維持機(jī)體的能量代謝。2016年，Li等［9］利用CRISPR基因組編輯技術(shù)獲得MPC1雜合敲除小鼠，并研究了突變小鼠的繁殖能力以及代謝指標(biāo)等的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變型小鼠的繁殖能力下降，糖異生相關(guān)基因的表達(dá)水平下降，即MPC1影響小鼠的生育能力，以及葡萄糖、脂質(zhì)等物質(zhì)的代謝利用。2017年，Zou等［10］利用CRISPR技術(shù)獲得MPC1雜合敲除小鼠，并對(duì)小鼠的能量代謝表型進(jìn)行了一系列的研究。結(jié)果表明食用普通飼料的MPC1+/-小鼠體重降低，運(yùn)動(dòng)能力減弱，體表溫度降低，體內(nèi)脂肪積累減少。此外，血糖水平，胰島素水平以及脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白水平均出現(xiàn)顯著變化。但是，當(dāng)飼喂高脂飼料時(shí)，以上變化均得到恢復(fù)。說明，MPC1+/-小鼠體內(nèi)的能量代謝由糖代謝轉(zhuǎn)變?yōu)橹x。由此可見，MPC是體內(nèi)糖代謝過程中的重要調(diào)控蛋白，對(duì)機(jī)體能量代謝平衡至關(guān)重要，MPC復(fù)合物也可作為肥胖等代謝類疾病的研究靶點(diǎn)，但MPC活性受到抑制后，機(jī)體的非期望效應(yīng)仍有待研究。

1.3 MPC調(diào)控機(jī)體能量代謝的機(jī)理研究

丙酮酸是碳水化合物、脂質(zhì)以及氨基酸的代謝中間物，丙酮酸的生成場(chǎng)所位于細(xì)胞質(zhì)，但只有進(jìn)入線粒體基質(zhì)才可進(jìn)行有氧代謝。丙酮酸無(wú)法自由穿過線粒體膜，必須依靠MPC才能從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體基質(zhì)。一方面丙酮酸可以在丙酮酸脫氫酶（Pyruvate dehydrogenase，PDH）的作用下氧化形成乙酰輔酶A，乙酰輔酶A既可進(jìn)入TCA循環(huán)，進(jìn)行氧化磷酸化，產(chǎn)生ATP，為機(jī)體供能，也可用于脂肪酸、膽固醇及乙酰膽堿等物質(zhì)的合成。另一方面，進(jìn)入線粒體基質(zhì)的丙酮酸也可在丙酮酸羧化酶（Pyruvate carboxylase，PC）的作用下生成草酰乙酸［11］，該過程是糖異生過程的重要步驟，而草酰乙酸也用于補(bǔ)充TCA循環(huán)中間體［12］，作為乙酰輔酶A的受體啟動(dòng)TCA循環(huán)，此過程主要發(fā)生在肝臟、腎臟、棕色脂肪（Brown adipose tissue，BAT）、胰腺β細(xì)胞中，因此MPC對(duì)于機(jī)體葡萄糖穩(wěn)態(tài)的維持十分重要。

Gray等［13］通過檢測(cè)肝臟特異性敲除Mpc1后代謝產(chǎn)物的變化，研究得到Mpc1敲除后的回補(bǔ)途徑主要有以下4種方式：（1）乳酸-丙酮酸循環(huán)：丙酮酸在LDH酶的作用下轉(zhuǎn)換為乳酸供能；（2）谷氨酰胺利用率增加，可轉(zhuǎn)換為α-酮戊二酸，維持TCA循環(huán)氧化供能；（3）丙酮酸在蘋果酸酶的作用下生成蘋果酸進(jìn)入線粒體參與氧化代謝；（4）丙酮酸-丙氨酸循環(huán)：丙酮酸通過丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）的作用轉(zhuǎn)換為丙氨酸，丙氨酸可自由通過線粒體膜到達(dá)線粒體基質(zhì)，而后在ALT作用下轉(zhuǎn)換為丙酮酸，丙酮酸在線粒體內(nèi)進(jìn)行氧化代謝進(jìn)而為機(jī)體提供能量。

2 MPC與代謝類疾病關(guān)系的研究進(jìn)展

2.1 MPC與糖尿病

2015年，Gray等［13］利用胚胎干細(xì)胞技術(shù)獲得肝臟特異性敲除Mpc1的C57Bl/6J小鼠，并通過檢測(cè)代謝產(chǎn)物的變化，得出Mpc1敲除對(duì)機(jī)體代謝的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Mpc1肝臟特異性敲除后，丙酮酸進(jìn)入TCA循環(huán)的通量降低，糖異生速率也隨之下降，空腹血糖水平的維持主要通過谷氨酰胺分解維持，但脂肪氧化速率升高，酮體生成速率增加。同時(shí)，肝臟特異性敲除Mpc1可減輕高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠體內(nèi)高血糖的發(fā)展和葡萄糖耐受不良等病癥。因此，是否可以通過靶向MPC復(fù)合物達(dá)到治療肥胖、高血糖等代謝類疾??？

Mccommis等［14］利用胚胎干細(xì)胞技術(shù)獲得Mpc2肝臟特異性敲除的小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Mpc2肝臟特異性敲除后，MPC蛋白失去活性，丙酮酸無(wú)法進(jìn)入線粒體，糖異生功能受損，血液中葡萄糖濃度降低，乳酸濃度升高，丙酮酸在丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶的作用下轉(zhuǎn)換為丙氨酸，維持部分糖異生功能。過度的糖異生作用是Ⅱ型糖尿病的主要特征之一，MPC復(fù)合體將丙酮酸從胞質(zhì)運(yùn)輸至線粒體內(nèi)是糖異生的關(guān)鍵步驟。因此研究推斷可以通過靶向抑制MPC活性達(dá)到治療Ⅱ型糖尿病的目的。Rauckhorst等［15］利用代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)肝臟中MPC活性喪失后，高脂飲食誘發(fā)的高血糖癥得到明顯改善。此外，MPC活性喪失后可減少纖維化和炎癥的發(fā)展，但是當(dāng)MPC活性受到抑制后，可能會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生不可預(yù)知的影響，因此研究MPC抑制型動(dòng)物的非期望效應(yīng)十分重要。

噻唑烷二酮類化合物（Thiazolidinedione，TZD）屬于胰島素敏化劑，而且還具有保護(hù)胰腺β細(xì)胞、減輕非酒精性脂肪肝的功能［16-18］，可用于治療糖尿病，已有研究表明TZD是通過抑制MPC活性發(fā)揮胰島素敏化的作用。其作用的機(jī)制是通過激活過氧化物酶體增殖物激活受體γ（Peroxisome proliferatorsactivated receptors，PPARγ）發(fā)揮胰島素敏化的作用，但是現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)TZD類藥物激活PPARγ后會(huì)導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)肥胖、骨質(zhì)流失等副作用［19-21］。2012年，Chen等［20］發(fā)現(xiàn)在肝臟特異性敲除PPARγ小鼠模型中，TZD類藥物可不依賴于PPARγ發(fā)揮胰島素敏化的作用，藥物已進(jìn)入Ⅱ期臨床試驗(yàn)階段，其發(fā)揮胰島素敏化作用的藥效與吡格列酮相同，而且與PPARγ相關(guān)的副作用減少。目前，出現(xiàn)了一種新型的TZD藥物——MSDC-0602，可以顯著降低藥物對(duì)于PPARγ的親和力，進(jìn)而降低藥物的副作用，同時(shí)通過介導(dǎo)MPC蛋白功能發(fā)揮胰島素敏化的作用，進(jìn)而達(dá)到治療糖尿病的目的［22］。這些發(fā)現(xiàn)表明胰島素敏化劑發(fā)揮作用的機(jī)制與其抗糖尿病的藥理學(xué)作用機(jī)制相關(guān)，因此鑒定TZD類藥物的生物學(xué)特性及其與MPC的相互作用可促進(jìn)新型胰島素敏化劑的發(fā)現(xiàn)與發(fā)展。

2013年，Colca等［23］利用光催化藥物模擬探針和基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定TZD類藥物與MPC復(fù)合物之間的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲除Mpc1或Mpc2或與MPC抑制劑UK5099（2-氰基-3-（1-苯基-1H-吲哚-3-基）-2-丙烯酸）孵育的線粒體內(nèi)，TZD探針無(wú)法與線粒體內(nèi)膜交聯(lián)；同時(shí)MSDC-0602處理棕色脂肪細(xì)胞后葡萄糖轉(zhuǎn)換為乙酰輔酶A的通路受到抑制，即TZD類藥物發(fā)揮胰島素敏化作用的機(jī)制是通過與MPC復(fù)合體結(jié)合，抑制其活性，進(jìn)而調(diào)節(jié)丙酮酸進(jìn)入線粒體的通量，發(fā)揮胰島素敏化的作用。

葡萄糖刺激的胰島素分泌（Glucose-stimulate insulin secretion，GSIS）是指胰腺β細(xì)胞通過ATP敏感性鉀通道（KATP）控制胰島素的分泌，當(dāng)人體內(nèi)血糖升高時(shí)，葡萄糖通過胰島細(xì)胞膜上的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)入胞內(nèi)并進(jìn)入線粒體進(jìn)行氧化代謝，使細(xì)胞中ATP/ADP比值升高，KATP通道閉合，改變膜電位，進(jìn)而導(dǎo)致鈣離子內(nèi)流刺激胰島素分泌。2014年，Vigueira等［12］利用鋅指蛋白核酸酶技術(shù)（Zinc finger nucleases，ZFN）得到表達(dá)N末端截短的MPC2蛋白的小鼠模型（MPC2Δ16），MPC2Δ16小鼠線粒體內(nèi)丙酮酸氧化代謝能力下降，給予外界葡萄糖后，與對(duì)照組相比血液中胰島素濃度降低，即MPC2的敲除影響機(jī)體GSIS受損，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體對(duì)于外界葡萄糖的攝取不敏感。以上研究表明，MPC活性對(duì)于機(jī)體胰島素穩(wěn)態(tài)的維持發(fā)揮著重要的作用，同時(shí)也為糖尿病的治療提供了新的靶位點(diǎn)。

2.2 MPC與癌癥

MPC缺陷可引發(fā)代謝障礙，也可導(dǎo)致腫瘤代謝發(fā)生改變［24-26］。2014年，Schell等［25］研究了MPC與癌癥之間的關(guān)系，正常細(xì)胞主要依賴于線粒體氧化糖分子供能，而癌細(xì)胞則通過糖酵解作用為自身提供能量，不依賴O2和線粒體，該效應(yīng)也稱為Warburg效應(yīng)（Warburg effect）。在多數(shù)癌細(xì)胞中，Mpc1、Mpc2低表達(dá)或不表達(dá)（尤其Mpc1）［26］，Mpc1低表達(dá)與幾乎所有癌癥（結(jié)腸癌、腎癌、肺癌和膀胱癌等）存活率低相關(guān)［27］，存活率與Mpc2的表達(dá)水平的相關(guān)性變化較大，且與腎癌、結(jié)腸癌的預(yù)后不良相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)Mpc1的表達(dá)水平與癌基因Myc負(fù)相關(guān)，與結(jié)腸癌抑制因子APC正相關(guān)［28-30］，在結(jié)腸癌細(xì)胞中過表達(dá)Mpc1/2，可導(dǎo)致癌細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制。

癌細(xì)胞主要依靠乳酸供能，大多數(shù)癌細(xì)胞中MPC表達(dá)水平比較低，同時(shí)已有研究表明［31-32］，PGC1α可調(diào)控線粒體內(nèi)的氧化代謝及生物合成，進(jìn)而維持細(xì)胞的能量穩(wěn)態(tài)。2018年，Koh等［33］研究在人腎癌細(xì)胞中，利用慢病毒載體介導(dǎo)PGC1α/ERRα敲除/過表達(dá)，通過檢測(cè)MPC1啟動(dòng)子活性和細(xì)胞的代謝能力，研究PGC1α與MPC1之間的調(diào)控機(jī)制，結(jié)果表明PGC1α通過與MPC1啟動(dòng)子區(qū)域的ERRα相互作用，進(jìn)而調(diào)控MPC1基因轉(zhuǎn)錄，同時(shí)該研究表明MPC1在PGC1α介導(dǎo)的氧化磷酸化和生物合成過程中發(fā)揮著重要的作用，研究癌細(xì)胞中PGC1α與MPC之間的調(diào)控機(jī)制可為癌癥的治療提供新的思路。

2017年，馬向明［34］研究MPC與肝細(xì)胞肝癌患者預(yù)后的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，在手術(shù)切除的肝細(xì)胞癌石蠟標(biāo)本/新鮮標(biāo)本中，與癌旁組織相比，癌組織中MPC1/2蛋白表達(dá)水平明顯降低，而且在MPC1表達(dá)水平低的肝細(xì)胞癌患者的術(shù)后復(fù)發(fā)率升高且總體生存時(shí)間縮短；但MPC2蛋白的表達(dá)水平與復(fù)發(fā)率和生存時(shí)間的長(zhǎng)短無(wú)關(guān)。研究表明，大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中與糖酵解相關(guān)酶（如己糖激酶、磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶和丙酮酸脫氫酶）的表達(dá)水平異常［35-39］，而這種異常與腫瘤細(xì)胞中糖酵解速率增加相關(guān)，Corbe等［39］利用化學(xué)抑制劑7ACC2處理癌細(xì)胞后丙酮酸的代謝途徑發(fā)生了改變，其機(jī)制是通過抑制MPC活性抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)和呼吸，因此MPC蛋白活性可影響腫瘤細(xì)胞中的能量代謝，進(jìn)而影響癌細(xì)胞的生長(zhǎng)?，F(xiàn)有研究結(jié)果顯示通過靶向調(diào)控MPC蛋白活性可以為癌癥的治療提供新的方向。

2.3 MPC與非酒精性脂肪肝

與代謝綜合征相關(guān)的肝臟疾病已成為最常見的肝臟代謝類疾病，非酒精性脂肪性肝炎（Nonalcoholic steatohepatitis，NASH）的主要病因是肝臟中脂質(zhì)異常累積，由此導(dǎo)致肝細(xì)胞功能障礙、纖維化，甚至死亡，但其具體的作用機(jī)制尚不明確。2017年，Mccommis等［18］發(fā)現(xiàn)噻唑烷二酮類化合物（Thiazolidinedione，TZD） —MSDC0602可 降低肝星狀細(xì)胞的活化及肝細(xì)胞纖維化，同時(shí)使用MSDC0602處理肝細(xì)胞或敲除肝細(xì)胞中MPC2也可影響肝細(xì)胞外泌體分泌進(jìn)而抑制肝星狀細(xì)胞的活化，以上結(jié)果表明，MSDC0602通過與MPC2結(jié)合并抑制其活性可以達(dá)到預(yù)防和治療NASH的目的。

3 結(jié)語(yǔ)

MPC活性的喪失對(duì)于葡萄糖穩(wěn)態(tài)的維持有著不同的作用，一方面可降低肝臟糖異生的速率，進(jìn)而降低Ⅱ型糖尿病的發(fā)生；另一方面可通過擾亂GSIS，阻止胰島素信號(hào)的傳導(dǎo)。因此通過抑制MPC活性調(diào)控丙酮酸代謝是未來研究MPC生理功能的主要研究領(lǐng)域之一，以探索其在糖尿病、肥胖等代謝紊亂性疾病中發(fā)揮作用的機(jī)理。但是，在癌組織中MPC表達(dá)受到抑制，應(yīng)通過特異性激活癌細(xì)胞中MPC功能，增強(qiáng)其有氧代謝途徑，進(jìn)而抑制癌細(xì)胞通過糖酵解方式獲得能量。

由于MPC與癌癥、糖尿病以及肥胖等代謝類疾病密切相關(guān)，因此通過研究MPC的生理功能及其與代謝類疾病發(fā)生機(jī)制之間的關(guān)系，可為這些代謝類疾病的治療提供新的思路和治療靶位點(diǎn)。