黃芪建中湯加味對糖尿病胃輕癱大鼠的療效及其對胃竇SCF-Kit信號途徑的影響研究

孔夢夢，黃 平，賈彩華

孔夢夢，浙江中醫(yī)藥大學 浙江省杭州市 310053

孔夢夢，浙江省寧波市海曙區(qū)鼓樓街道社區(qū)衛(wèi)生服務中心 浙江省寧波市 315000

黃平，浙江中醫(yī)藥大學附屬二院 浙江省杭州市 310053

賈彩華，天津市寧河區(qū)醫(yī)院兒科 天津市 301500

核心提要： 糖尿病胃輕癱(diabetic gastroparesis，DGP)為臨床多見疾病，是糖尿病所造成慢性并發(fā)癥，黃芪建中湯加味經(jīng)過提升膜結合型干細胞因子(stem cell factor，SCF)蛋白表達，上調(diào)SCF-Kit信號途徑，使DGP大鼠胃竇組織內(nèi)Cajal間質(zhì)細胞含量增大，改善其胃起搏功能，胃動力增強.

0 引言

糖尿病胃輕癱(diabetic gastroparesis，DGP)為臨床多見疾病，是糖尿病(diabetes mellitus，DM)所造成慢性并發(fā)癥，臨床患者胃動力及胃張力下降、排空延遲、節(jié)律紊亂，臨床癥狀多表征為嘔吐、腹脹、惡心、噯氣及早飽等[1]. 當前關于DGP發(fā)病因素尚未完全明確，可能和感染幽門螺旋桿菌、神經(jīng)病變、胃腸平滑肌及微血管病變、胃腸道激素改變、高血糖等有聯(lián)系[2]. 相關研究顯示，在DGP發(fā)病中Cajal間質(zhì)細胞(interstitial cells of Cajal，ICC)病變有重要影響，它為機體內(nèi)胃腸道運動起搏細胞，對胃腸道的自主節(jié)律運動有調(diào)控影響，同時對傳遞神經(jīng)信號與傳播消化道電活動也很重要[3]. ICC的特異性標志物酪氨酸激酶受體(tyrosine kinase receptor，Kit)天然配體是干細胞因子(stem cell factor，SCF)，上述兩者可產(chǎn)生SCF-Kit信號路徑，該路徑對ICC發(fā)育及保持ICC功能與形態(tài)非常重要. 當前，西醫(yī)對DGP治療為胃電起搏、促進胃動力及控制血糖等，患者療效不太理想且副作用較大，而中醫(yī)在辯證治療基礎上，對DGP患者預防復發(fā)和緩解癥狀方面療效顯著[4]. 因此，本研究經(jīng)過分析黃芪建中湯加味對DGP大鼠的療效及其對胃竇SCFKit信號途徑的影響，為臨床患者治療提供一些思路.

1 材料和方法

1.1 材料 選取SPF級Wistar雄性大鼠75只，六周齡，購自北京維通利華實驗動物公司，許可證號： SCXK(京)：2018-28，體重在180-200 g間，平均體重191.24 g±5.27 g.常規(guī)飼養(yǎng)一周后開始實驗，大鼠分籠飼養(yǎng)，每個籠內(nèi)5只，室溫維持在22 ℃-26 ℃，相對濕度在55%-65%間，晝夜循環(huán)，保持12 h光照，大鼠灌胃、添加飼料及換水等都有專人進行.

藥物： 黃芪建中湯加味(炙甘草15 g，黃芪60 g，炒麥芽15 g，桂枝15 g，茯苓20 g，白芍15 g，黨參30 g，干姜15 g，白術15 g，枳殼20 g及大棗30 g)，加入清水煎熬取汁; 嗎丁啉(西安楊森制藥公司，規(guī)格： 10 mg/片，批號： H22133067). 試劑： 可溶型SCF(soluble SCF，sSCF)試劑盒(購自美國RD公司)，胃泌素(gastrin，GAS)、胃動素(motilin，MLT)購自昆明騰昆科技公司，鏈脲佐菌素(STZ)(購自美國Sigma公司)，兔抗大鼠SCF多克隆抗體(一抗)及兔抗c-kit多克隆抗體(一抗)(購自武漢博士德生物公司). 儀器： 病理組織漂烘儀(型號： PHY-Ⅲ，由常州中威電子儀器廠生產(chǎn))，轉輪式切片機(型號： 萊卡-2016，由德國萊卡公司生產(chǎn))，全波長掃描型酶標儀(型號： Mutiskan Go型，由美國賽默飛世爾公司生產(chǎn))，全自動封閉式組織脫水機(型號： TSJ-Ⅱ，由常州中威電子儀器廠生產(chǎn))，包埋機(型號： BMJ-Ⅲ，由常州中威電子儀器廠生產(chǎn))，電泳儀(型號： DYY-2C，由北京六一儀器廠生產(chǎn))，BH-2生物顯微鏡(由日本OLYMPLUS公司生產(chǎn))，天能GIS凝膠圖像處理系統(tǒng)(由上海天能科技公司生產(chǎn)).

1.2 方法 隨機數(shù)字表法降低大鼠分成5組，模型組、正常組、陽性對照組、黃芪建中湯加味低劑量組及黃芪建中湯加味高劑量組，各15只. STZ內(nèi)加入0.1 mmol/L的檸檬酸鈉緩沖液，制備為含量1.0%溶液，除正常組外，其他各組大鼠均在腹腔內(nèi)一次性注入劑量為45 mg/kg溶液，注射后72 h取大鼠尾靜脈血液行空腹血糖檢測，若其血糖含量≥16.8 mmol/L則說明成功造模，各組大鼠均造模成功.

造模后陽性對照組大鼠灌胃0.78 g/mL的嗎丁啉混懸液，黃芪建中湯加味低劑量組、黃芪建中湯加味高劑量組分別灌胃0.78 g/mL(相當臨床成人等效劑量)、3.12 g/mL(相關臨床成人量4倍)的黃芪建中湯加味藥液，正常組和模型組灌胃生理鹽水，各組大鼠給藥體積為10 mL/kg，持續(xù)灌胃6 wk.

1.2.1 大鼠一般活動狀況及體重改變情況： 觀察給藥期間大鼠飲食、活動及毛發(fā)情況，記錄各組大鼠在給藥1、3、6 wk時體重狀況.

1.2.2 各組大鼠血清指標及胃排空率狀況： 胃排空率：末次給藥后大鼠禁食12 h，灌胃2 mL的5%酚紅，30 min后大鼠麻醉剖腹，將幽門與賁門結扎，全胃取出放置在培養(yǎng)皿內(nèi)，沿著胃大彎將胃體剪開，胃內(nèi)容物充分清洗，定容10 mL，在加入5 mL劑量為1 mol/L的NaOH，混勻，室溫內(nèi)放置1 h后選取上清液5 mL，加入0.5 mL的20%三氯乙酸去蛋白，離心后取上清液，檢測吸光度A值，胃拍空率 = (1-實測酚紅殘留量/酚紅灌胃量)×100%.

末次給藥后，大鼠腹腔注射劑量為0.8 mL/100 g的2.4%水合氯醛麻醉，斷頸處死，取腹主動脈血液6 mL，血糖儀檢測其血糖狀況，ELISA法檢測血清sSCF、GAS、MLT含量，標準品稀釋后加入至酶標板標準品孔內(nèi)，樣品加入到樣品孔內(nèi)，每個孔內(nèi)10 mL，膠紙將反應孔封住，37 ℃下孵育2 h，洗板五次，在加入10 mL生物素化抗體工作液，37 ℃下孵育1 h，洗板五次，加入10 mL酶結合物工作液，37 ℃下避光孵育30 min，洗板五次，每孔加入10 mL顯色液，37 ℃下避光孵育20 min，最后加入終止液，混勻后檢測OD450數(shù)值.

1.2.3 胃竇ICC數(shù)量狀況： 各組大鼠胃排空率檢測完后，取距離幽門0.5 cm位置的胃竇組織，免疫檢測大鼠胃竇組織內(nèi)ICC數(shù)量狀況，石蠟切片脫蠟后將內(nèi)源性過氧化物酶滅活，熱修復暴露抗原位點，置入孵育盒內(nèi)，使用PBS溶液沖洗三次，每次3 min，加入山羊血清，孵育10 min，在加入一抗兔多克隆抗體，在4 ℃下過夜.PBS溶液沖洗三次，每次5 min，滴入二抗在室溫下孵育10 min，使用PBS溶液沖洗三次，每次3 min，在滴入辣根酶標記鏈酶卵白素，采用DAB顯色，中性樹膠封片. 棕黃色為染色陽性，使用Image-Pro Plus6.0圖片分析檢測檢測圖像光密度.

1.2.4 Western-blot檢測大鼠胃竇組織內(nèi)c-kit、膜結合型SCF蛋白表達量： 選取大鼠胃竇組織研磨，經(jīng)過組織裂解后上樣電泳，起始電壓80 V，溴酚藍染料前緣進入到分離膠上緣后電壓提升到100 V，溴酚藍泳出分離膠下緣后電泳結束. 半干電轉移儀于PVDF膜內(nèi)行蛋白質(zhì)電轉移，恒流為30 mA，連續(xù)90 min. PVDF膜取出后采用5%TBST脫脂奶粉封閉，震蕩60 min. 結束封閉后采用TNS-T漂洗液洗膜10 min，3次，把膜轉移到雜交袋內(nèi)，加入適量漂洗液稀釋抗體，封口后在4 ℃下孵育過夜;TBST漂洗液洗膜10 min，3次，在加入漂洗液稀釋的辣根過氧化物酶標記二抗，震蕩60 min. PVDF膜放置在ECL顯色液內(nèi)震蕩溫育5 min，暗室下曝光、顯影及定影. 清水沖洗以后，晾干掃描，IPP軟件對掃描圖像目的條帶行灰度分析.

統(tǒng)計學處理采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料mean±SD表示，t檢驗，計數(shù)資料χ2檢驗，P＜0.05差異有統(tǒng)計學意義.

2 結果

2.1 各組大鼠一般活動及體重改變狀況 正常組大鼠飲水、進食正常，活動敏捷，毛色光滑，糞便為棕褐色，尿量正常; 模型組大鼠表征為多尿、多食及多飲，活動遲緩，毛色干枯無光澤，大便不成形，精神倦怠; 陽性對照組、黃芪建中湯加味低劑量組及黃芪建中湯加味高劑量組大鼠飲食量較模型組減少，趨于正常，毛發(fā)有光澤，活躍喜動，大便成形.

和正常組相比，給藥后1、3、6 wk模型組大鼠體重降低; 和模型組相比，給藥后1、3、6 wk陽性對照組、黃芪建中湯加味低劑量組及黃芪建中湯加味高劑量組大鼠體重上升，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05); 和陽性對照組相比，給藥后1、3、6 wk黃芪建中湯加味低劑量組及黃芪建中湯加味高劑量組大鼠體重上升，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，詳見表1.

2.2 各組大鼠血糖、sSCF、GAS、MLT含量及胃排空率狀況 和正常組相比，模型組大鼠血糖、GAS及MLT含量上升，sSCF含量、胃排空率下降; 和模型組相比，陽性對照組、黃芪建中湯加味低劑量組及黃芪建中湯加味高劑量組大鼠血糖、GAS及MLT含量下降，sSCF含量、胃排空率上升，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，詳見表2.

2.3 各組大鼠胃竇組織內(nèi)ICC特征及含量狀況 在光鏡下免疫組化染色的c-kit陽性的ICC細胞核與細胞質(zhì)為棕黃色顆粒(圖中箭頭所示)，在胃竇黏膜肌層肌間的神經(jīng)叢內(nèi)分布，其中正常組著色較深，顏色明顯，c-kit高表達，模型組陽性細胞分布少，c-kit表達變?nèi)?，陽性對照組、黃芪建中湯加味低劑量組及黃芪建中湯加味高劑量組內(nèi)可看到c-kit陽性細胞著色較深，詳見圖1.

和正常組相比，模型組大鼠c-kit陽性ICC含量下降;和模型組相比，陽性對照組、黃芪建中湯加味低劑量組及黃芪建中湯加味高劑量組大鼠c-kit陽性ICC含量上升，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05); 和陽性對照組相比，黃芪建中湯加味低劑量組及黃芪建中湯加味高劑量組大鼠c-kit陽性ICC含量上升，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，詳見表3.

2.4 各組大鼠胃竇組織內(nèi)c-kit、膜結合型SCF蛋白表達狀況 正常組相比，模型組大鼠胃竇組織內(nèi)c-kit、膜結合型SCF(membrane-bound SCF，mSCF)蛋白表達下降;和模型組相比，陽性對照組、黃芪建中湯加味低劑量組及黃芪建中湯加味高劑量組大鼠c-kit、mSCF蛋白表達上升，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05); 和陽性對照組相比，黃芪建中湯加味低劑量組及黃芪建中湯加味高劑量組大鼠c-kit、mSCF蛋白表達上升，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，詳見表4和圖2.

3 討論

中醫(yī)學古籍中雖然沒有關于DGP專名，但依據(jù)其臨床表征可歸于“嘔吐”、“胃痛”等范疇內(nèi)，以消渴病為基礎疾病脾胃病證，由于消渴病耗氣傷陰，燥熱灼津，再加上降糖類西藥對脾胃功能的損傷，造成患者胃陰虧乏，機體脾胃失去濡養(yǎng)，則運化失司，胃需則無法受盛水谷，脾虛則無法化生精微，在胃內(nèi)停積，機體氣機升降失常，中焦內(nèi)氣滯，進而發(fā)生濕阻、食滯、痰濁等病理影響.針對其病機本研究對DGP大鼠采用黃芪建中湯加減，黃芪建中湯源自《金匱要略》，方中黃芪拖毒生肌、利尿消腫、益衛(wèi)固表，為方中君藥; 黨參生津、補血、補脾肺氣，桂枝溫助陽氣、溫通經(jīng)脈、發(fā)汗解表，為方中臣藥; 白芍平抑肝陽、柔肝止痛、養(yǎng)血斂陰，大棗養(yǎng)血安神、補氣健脾，干姜溫肺化飲、回陽通脈，枳殼寬中除脹、行氣寬胸，白術止汗、利尿、補氣健脾，茯苓寧心安神、滲濕利水，炒麥芽健脾開胃，行氣消食，為方中佐藥; 炙甘草為使，益脾氣、補心氣，調(diào)和上述諸藥，全方配伍共起健脾溫中益氣功效.

ICC為在腸胃道內(nèi)分布間質(zhì)細胞，為胃腸道慢波起搏細胞，參加到胃腸神經(jīng)遞質(zhì)的信號傳遞與基本電節(jié)律調(diào)控[5，6]，相關研究顯示，在機體胃腸道電與動力出現(xiàn)、運動障礙的機制內(nèi)ICC有重要影響[7]. 當前多數(shù)學者認為臨床多種胃腸動力障礙性疾病其關鍵病理學因素和ICC網(wǎng)絡缺失、發(fā)育分化障礙及分布或者結構異常有緊密聯(lián)系，這也是目前臨床對DGP治療的研究方向之一[8-10]. SCF為具有多種功能的細胞因子，由于其mRNA酶切和拼接方式不同而形成了mSCF與sSCF兩種形式，它們都有生物活性. c-kit為有酪氨酸激酶活性跨膜蛋白，SCF可經(jīng)過結合特定受體c-kit而產(chǎn)生配基受體二聚體復合物，使對應信號轉導路徑開啟，對細胞不同生物學行為進行調(diào)控，發(fā)揮影響[11-13]. c-kit受體和SCF所產(chǎn)生SCF-Kit信號路徑，對于胃腸道內(nèi)ICC生長、發(fā)育、分化及表型的保持有重要作用，對其結構與數(shù)量完整有影響[14]. 龍慶林等[15]人研究顯示，DM大鼠的胃排空會顯著延遲，胃竇組織內(nèi)ICC數(shù)量降低，超微機構受損，其他細胞和ICC之間縫隙連接松散、結構損壞，而進一步探究顯示DM大鼠胃竇平滑肌組織內(nèi)c-kit蛋白和SCF mRNA表達量較正常大鼠下降，說明SCF-Kit信號路徑和DM大鼠的ICC變性、網(wǎng)絡結構被損和數(shù)量下降有聯(lián)系，造成其胃運動障礙. 本文研究顯示，和正常組相比，模型組大鼠c-kit陽性ICC含量下降; 和模型組相比，黃芪建中湯加味低劑量組及黃芪建中湯加味高劑量組大鼠c-kit陽性ICC含量上升; 和正常組相比，模型組大鼠胃竇組織內(nèi)c-kit、mSCF蛋白表達下降; 和模型組相比，黃芪建中湯加味低劑量組及黃芪建中湯加味高劑量組大鼠c-kit、mSCF蛋白表達上升，差異有統(tǒng)計學意義，說明黃芪建中湯可使SCF-Kit信號路徑上調(diào)，保持ICC功能，從而對DGP起到治療作用.

表1 各組大鼠體重改變狀況對比(n = 15)

表2 各組大鼠血糖、sSCF、GAS、MLT含量及胃排空率狀況對比(n = 15)

表3 各組大鼠胃竇組織內(nèi)c-kit陽性ICC含量狀況對比(n = 15)

表4 各組大鼠胃竇組織內(nèi)c-kit、mSCF蛋白表達狀況對比(n = 15)

總之，黃芪建中湯加味經(jīng)過提升mSCF蛋白表達，上調(diào)SCF-Kit信號途徑，使DGP大鼠胃竇組織內(nèi)ICC含量增大，改善其胃起搏功能，胃動力增強.

圖1 各組大鼠胃竇組織內(nèi)Cajal間質(zhì)細胞分布著色狀況(免疫組化×200). A: 正常組; B: 模型組; C: 陽性對照組; D: 黃芪建中湯加味低劑量組;E: 黃芪建中湯加味高劑量組.

圖2 各組大鼠胃竇組織內(nèi)c-kit、膜結合型干細胞因子蛋白表達狀況. 1為正常組; 2為模型組; 3為黃芪建中湯加味低劑量組; 4為黃芪建中湯加味高劑量組; 5為陽性對照組.

文章亮點

實驗背景

近些年來，糖尿病胃輕癱患者發(fā)病率逐年升高，近半糖尿病患者有胃動力障礙紊亂表征. 胃動力障礙不但會導致患者出現(xiàn)一系列胃腸不適癥狀，還會影響到血糖控制，改變口服藥物吸收.

實驗動機

西醫(yī)對于糖尿病胃輕癱(diabetic gastroparesis，DGP)治療主要為胃電起博治療、促進胃動力和控制血糖等，存在療效不持久、有一定副作用等問題. 中醫(yī)采用辨證治療，在預防復發(fā)、改善癥狀等方面療效確切，有一定優(yōu)勢.

實驗目標

分析黃芪建中湯加味對DGP胃動力指標、胃排空率等療效影響和對胃竇干細胞因子(stem cell factor，SCF)-Kit信號途徑的影響.

實驗方法

制備DGP大鼠模型，灌胃黃芪建中湯加味，觀察大鼠血糖、可溶型SCF(soluble SCF，sSCF)、胃泌素(gastrin，GAS)、胃動素(motilin，MLT)含量及胃排空率，胃竇組織內(nèi)c-kit陽性Cajal間質(zhì)細胞(interstitial cells of Cajal，ICC)含量和胃竇組織內(nèi)c-kit、mSCF蛋白表達狀況.

實驗結果

模型組相比，黃芪建中湯加味低劑量組及黃芪建中湯加味高劑量組大鼠血糖、GAS及MLT含量下降，sSCF含量、胃排空率上升，差異有統(tǒng)計學意義; 和模型組相比，黃芪建中湯加味低劑量組及黃芪建中湯加味高劑量組大鼠c-kit、mSCF蛋白表達上升，差異有統(tǒng)計學意義.

實驗結論

黃芪建中湯加味可使DGP大鼠胃竇組織內(nèi)mSCF蛋白表達量提升，上調(diào)SCF-Kit信號途徑，提高胃竇組織內(nèi)ICC含量，增強其胃動力.

展望前景

由于時間和人力等條件限制，本研究部分數(shù)據(jù)難免存在紕漏，今后還需進一步學習相關的理論知識，進行臨床研究.