BRAF V600E基因檢測聯(lián)合細(xì)針穿刺活檢對甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性診斷中的價值

盧振啟 龔文博 黑虎 秦建武

甲狀腺癌是最常見的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤。近年隨著高分辨率彩超的普及與人們在體檢中對甲狀腺檢查的重視，在全球范圍內(nèi)甲狀腺癌的檢出率呈明顯上升［1］。2018年全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，甲狀腺癌已成為全球癌癥發(fā)病率第9 大腫瘤［2］。及時發(fā)現(xiàn)和診斷對緩解患者心理壓力和提供有效的治療十分重要。細(xì)針穿刺活檢（fine needle aspiration biopsy，F(xiàn)NA）是目前評估甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性敏感度和特異度最高的方法［3-4］，但仍有10%～30%的結(jié)節(jié)無法明確診斷［5］。因此從基因水平尋找高相關(guān)性的腫瘤標(biāo)志物尤為重要。有研究表明BRAF 基因作為甲狀腺癌最常見的遺傳學(xué)突變［6］，在甲狀腺乳頭狀癌（papil?lary thyroid carcinoma，PTC）的發(fā)生發(fā)展中占據(jù)重要地位。FNA 聯(lián)合BRAF V600E 基因突變檢測進(jìn)一步提高診斷的敏感度和準(zhǔn)確度，對甲狀腺癌的診斷、分層、治療及預(yù)后的評估具有重要的指導(dǎo)意義［7］。本研究探討B(tài)RAF V600E 基因檢測聯(lián)合超聲引導(dǎo)下FNA對甲狀腺良惡性結(jié)節(jié)的臨床診斷價值。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

選取2018年1月至2018年6月鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院首次收治、診斷為甲狀腺腫物入院行FNA 及穿刺洗脫液BRAF 基因檢測并接受手術(shù)的患者為研究對象。經(jīng)過嚴(yán)格查閱與篩選的121 例共130 枚可疑結(jié)節(jié)納入本研究。納入標(biāo)準(zhǔn)：1）術(shù)前有完整高分辨率彩超記錄且評估結(jié)節(jié)為可疑惡性（TI-RAS 分類4 類及以上結(jié)節(jié)）；2）術(shù)前行FNA 及穿刺洗脫液BRAF 基因檢測；3）初次行甲狀腺手術(shù)治療；4）術(shù)后病理明確；5）具有完整病歷資料及病理報告。所有患者穿刺及術(shù)前均簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：1）多次手術(shù)患者；2）非本院行FNA及穿刺洗脫液BRAF基因檢測；3）病歷資料不完整。

1.2 方法

1.2.1 穿刺方法 核對患者信息后患者取仰臥位，頸部墊高過伸位，頸部常規(guī)消毒，鋪無菌洞巾，超聲探頭無菌處理，超聲定位結(jié)節(jié)，設(shè)計穿刺路徑，穿刺點進(jìn)針。超聲引導(dǎo)下用23G穿刺針進(jìn)入甲狀腺結(jié)節(jié)，在結(jié)節(jié)內(nèi)重復(fù)提插穿刺針數(shù)次完成取材，每枚結(jié)節(jié)穿刺2 針，個別結(jié)節(jié)穿刺3 針。標(biāo)本立即涂片固定，觀察標(biāo)本是否滿足細(xì)胞學(xué)診斷要求。穿刺針用1 mL生理鹽水沖洗，洗脫液用PE管儲存，送本院分子病理科行RT-RCR檢測［8］。根據(jù)需要重復(fù)穿刺步驟，通常每個結(jié)節(jié)穿刺2 次。穿刺完畢，貼敷料，在觀察區(qū)留置觀察20 min，穿刺點壓迫止血20 min，向患者交代注意事項。

FNA 結(jié)果根據(jù)Bethesda 診斷系統(tǒng)分為：Ⅰ類，標(biāo)本無法診斷；Ⅱ類，良性病變；Ⅲ類，意義不明確的非典型病變；Ⅳ類，濾泡性腫瘤；Ⅴ類，可疑惡性腫瘤；Ⅵ類，惡性腫瘤。

1.2.2 BRAF V600E檢測 取FNA洗脫液標(biāo)本，采用標(biāo)準(zhǔn)酚-氯仿抽提法提取DNA溶液。PCR擴(kuò)增BRAF第15號外顯子，引物序列設(shè)計為正向引物，5'-ACTCTTCA TAATGCTTGCTC-3'，反向引物，5'-TAGTTGAGACCTTC AATGAC-3'，擴(kuò)增片段長度275 bp。所有擴(kuò)增片段經(jīng)電泳證實后，進(jìn)行測序。BRAF V600E基因檢測結(jié)果分為野生型和突變型。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以術(shù)后病理學(xué)結(jié)果為“金標(biāo)準(zhǔn)”，計數(shù)資料的比較采用χ2檢驗。，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

130 枚穿刺標(biāo)本結(jié)果中，術(shù)后病理學(xué)檢查PTC 120枚，良性10枚。標(biāo)本不能診斷或不滿意3枚（1枚術(shù)后診斷為良性，2枚診斷為PTC）、良性病變9枚（術(shù)后診斷為良性8枚，惡性1枚）、意義不明確的非典型病變1枚（術(shù)后診斷為良性）、可疑惡性腫瘤19枚（術(shù)后診斷均為惡性）、惡性腫瘤98 枚（術(shù)后診斷均為PTC），見表1。

BRAF V600E基因突變檢查結(jié)果：野生型27枚（術(shù)后診斷良性10枚，PTC 17枚），突變型103枚（術(shù)后診斷均為PTC）。術(shù)后病理證實：惡性120 枚，良性10 枚。BRAF V600E突變率79.2%（103/130），見表2。

表1 甲狀腺結(jié)節(jié)細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)結(jié)果和術(shù)后病理學(xué)結(jié)果 枚

表2 BRAF基因檢測結(jié)果和術(shù)后病理學(xué)結(jié)果 枚

細(xì)胞學(xué)診斷的敏感度和準(zhǔn)確度分別為81.7%和83.1%。洗脫液BRAF V600E基因檢測的敏感度和準(zhǔn)確度分別為85.8%和86.9%。BRAF 基因檢測聯(lián)合FNA 將細(xì)胞學(xué)穿刺的敏感度由81.7%升至92.5%（P＜0.05），準(zhǔn)確度由83.1%升至92.3%（P＜0.05），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（表3）。

不同直徑結(jié)節(jié)細(xì)胞學(xué)診斷結(jié)果：結(jié)節(jié)直徑≤5 mm的細(xì)胞學(xué)診斷中，無法診斷及可疑惡性比例（10/21枚）遠(yuǎn)大于結(jié)節(jié)直徑6～10 mm（7/63 枚）和直徑>10 mm（5/46枚）結(jié)節(jié)（表4）。結(jié)節(jié)直徑≤5 mm細(xì)胞學(xué)診斷的敏感度和準(zhǔn)確度（47.6%和52.4%）遠(yuǎn)低于直徑6～10 mm（85.7%和88.9%）及直徑>10 mm（73.9%和87.0%），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見表5。

表3 FNA、BRAF及FNA聯(lián)合BRAF基因檢測結(jié)果 枚

表4 不同直徑甲狀腺結(jié)節(jié)FNA結(jié)果 枚

洗脫液BRAF V600E 基因突變檢測采用穿刺針中殘留的組織作為標(biāo)本，不同直徑的結(jié)節(jié)BRAF V600E基因突變檢測無顯著性差異（P>0.05，表6）。

表5 FNA檢測結(jié)果

表6 不同直徑甲狀腺結(jié)節(jié)BRAF V600E檢測結(jié)果

3 討論

FNA 作為目前評估甲狀腺結(jié)節(jié)最可靠、最有價值的診斷手段之一，也是安全、方便、經(jīng)濟(jì)、有效鑒別甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性的微創(chuàng)方法，常與高分辨率彩超結(jié)合進(jìn)行甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性診斷，但仍有10%～30%的結(jié)節(jié)無法明確診斷［5］。本研究中3.1%（4/130例）患者無法明確性質(zhì)，其中僅50.0%（2/4 例）需要手術(shù)。粗針穿刺活檢包括超聲引導(dǎo)下的粗針活檢和CT引導(dǎo)下經(jīng)皮甲狀腺結(jié)節(jié)粗針活檢，可以最大限度地明確診斷、減少假陰性。但粗針穿刺活檢對結(jié)節(jié)直徑要求較高，要求結(jié)節(jié)直徑在2 cm 以上，而且出血等并發(fā)癥較多。而目前臨床上微小PTC發(fā)病率逐年升高，粗針穿刺活檢已不符合臨床主要需求。

有研究認(rèn)為穿刺準(zhǔn)確度與可疑結(jié)節(jié)直徑相關(guān)，穿刺直徑越小，超聲引導(dǎo)下定位取材越困難，但甲狀腺癌灶直徑是否是FNA無法確切診斷的獨立因素，研究結(jié)果不一。孫永清等［9］研究認(rèn)為結(jié)節(jié)大小及位置均可影響FNA的準(zhǔn)確度。Moon等［10］認(rèn)為以直徑6 mm為界，直徑＜6 mm穿刺的不滿意發(fā)生率約20.8%。Mazzaferri等［11］認(rèn)為對于直徑≤5 mm結(jié)節(jié)，穿刺取材不滿意度較高，不建議對直徑≤5 mm結(jié)節(jié)進(jìn)行穿刺。但是Zhong等［12］研究認(rèn)為，F(xiàn)NA對不同結(jié)節(jié)大小穿刺的敏感度、特異度及準(zhǔn)確度差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)穿刺結(jié)節(jié)直徑≤5 mm時，單純細(xì)胞學(xué)診斷的不確定結(jié)節(jié)數(shù)量為47.6%（10/21枚），成為影響細(xì)胞學(xué)診斷質(zhì)量的一個重要因素。此外，直徑≤5 mm可疑結(jié)節(jié)細(xì)胞學(xué)診斷的敏感度及準(zhǔn)確度均遠(yuǎn)低于直徑>5 mm組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。因此本研究認(rèn)為，穿刺結(jié)節(jié)直徑在一定程度上影響細(xì)胞學(xué)的診斷結(jié)果。洗脫液BRAF V600E基因突變檢測采用穿刺針中殘留的組織作為標(biāo)本，不同直徑的結(jié)節(jié)BRAF V600E基因突變檢測差異無統(tǒng)計學(xué)意義，BRAF V600E基因突變檢測一定程度上降低了可疑結(jié)節(jié)直徑對于穿刺準(zhǔn)確度的影響。因此，本研究認(rèn)為對于直徑較小的可疑結(jié)節(jié)，有必要輔以基因檢測提高診斷準(zhǔn)確度。

BRAF V600E基因突變作為PTC中最常見的遺傳學(xué)突變［13-14］，通過突變導(dǎo)致BRAF蛋白激活，直接引起下游MEK蛋白磷酸化，最終導(dǎo)致MAPK信號途徑持續(xù)激活，從而引起細(xì)胞過度增殖、分化及腫瘤的發(fā)生，已經(jīng)被作為PTC診斷及預(yù)后的一個重要指標(biāo)應(yīng)用于臨床。BRAF V600E基因突變對PTC具有高度特異度，鮮見在濾泡癌、腺瘤或良性腫瘤中發(fā)現(xiàn)的報道［15-16］，其特點使其成為FNA輔助病理分子診斷的一個重要工具，被作為PTC診斷及預(yù)后的一個重要指標(biāo)應(yīng)用于臨床。本研究中，BRAF V600E基因突變103例，術(shù)后病理證實均為甲狀腺乳頭狀癌，特異度達(dá)100%，體現(xiàn)了BRAF V600E基因的高度特異度。但未檢測到BRAF V600E基因突變時，不能排除甲狀腺乳頭狀癌的診斷。本研究中，BRAF V600E基因突變野生型27例，術(shù)后病理證實PTC 17例，良性10例，因此對于基因突變野生型結(jié)果的判讀應(yīng)當(dāng)慎重。對于穿刺無法明確性質(zhì)且BRAF V600E基因為野生型的患者，本研究建議患者定期隨訪或者3個月后重復(fù)穿刺。

Zhao 等［17］和Brown 等［18］研究均認(rèn)為，BRAF 基因檢測聯(lián)合FNA 細(xì)胞學(xué)檢查大幅提高了穿刺的敏感度。Zatelli等［19］研究認(rèn)為BRAF V600E基因突變分析提高了細(xì)胞學(xué)診斷的敏感度（由77%升至87%）。本研究中，穿刺洗脫液BRAF基因輔助檢測將FNA的敏感度由81.7%提升至92.5%，診斷的準(zhǔn)確度由83.1%提升至92.3%，印證了BRAF 基因檢測聯(lián)合FNA 細(xì)胞學(xué)檢測能提高穿刺穿敏感度和準(zhǔn)確度的觀點。本研究敏感度的顯著提高主要來源于細(xì)胞學(xué)診斷中診斷不明確的結(jié)節(jié)（意義不明確的非典型病變及標(biāo)本無法診斷），BRAF V600E 基因突變檢測幫助制定明確的手術(shù)計劃，避免不必要的手術(shù)范圍，同時幫助減少其他不必要的檢驗，如重復(fù)穿刺。因此，對于診斷不明確的結(jié)節(jié)行BRAF V600E 基因檢測對于患者的診斷和治療十分有意義。

FNA聯(lián)合洗脫液BRAF V600E基因突變檢測，彌補(bǔ)了細(xì)胞學(xué)診斷受細(xì)胞量、細(xì)胞形態(tài)、閱片經(jīng)驗等因素的影響，借助洗脫液BRAF V600E 基因突變檢測，通過測定BRAF V600E 基因在可疑結(jié)節(jié)中的表達(dá)情況，有助于提高甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性鑒別的準(zhǔn)確度，指導(dǎo)甲狀腺癌的風(fēng)險分層及預(yù)后評估，提供治療的決策信息（是否手術(shù)及手術(shù)范圍的大?。?0］，且洗脫液BRAF基因檢測不需要額外的穿刺標(biāo)本，通過FNA標(biāo)本即可檢驗，同時又可降低標(biāo)本采集及制片等影響因素的干擾［21］。

綜上所述，洗脫液BRAF V600E基因突變檢測作為FNA 的有效診斷手段補(bǔ)充，提高了穿刺的敏感度和準(zhǔn)確度。尤其對于穿刺結(jié)果中意義不明確的結(jié)節(jié)，可以輔助聯(lián)合BRAF V600E 基因突變檢測，以提高診斷的準(zhǔn)確度。