基于主成分和聚類分析的不同乳酸桿菌制備酸漿水品質(zhì)評價

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(1.湖北文理學(xué)院食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所,湖北襄陽 441053; 2.棗陽市食品藥品監(jiān)督管理局,湖北棗陽 441021)

酸漿水作為我國傳統(tǒng)的發(fā)酵食品之一,因其口感酸甜、生津解乏,并且富含乳酸菌而受到廣大消費者的喜愛[1]。酸漿水是使用面粉與燙芹菜為發(fā)酵原料,每天用新鮮的面湯勾兌老漿水制作而成[2]。在適宜的條件下,發(fā)酵原料經(jīng)微生物發(fā)酵生成以乳酸為主的各種有機酸,從而形成了酸漿水特有的風(fēng)味[3]。李欣等[4]和Li等[5]研究發(fā)現(xiàn),乳酸桿菌的發(fā)酵特性和能力對酸漿水品質(zhì)有著直接的影響,且乳酸桿菌能發(fā)酵碳水化合物,改善蔬菜制品的風(fēng)味,使?fàn)I養(yǎng)成分更易吸收[6]。周書楠等[7]和張曉輝等[8]研究發(fā)現(xiàn),酸漿水中的優(yōu)勢細菌是乳桿菌(Lactobacillus),且其相對含量可能高達99.72%。目前,對于酸漿水的研究主要集中在優(yōu)勢菌株的分離[9]、亞硝酸鹽[10]、風(fēng)味成分[11]和發(fā)酵工藝[12]等方面,而乳酸桿菌對酸漿水發(fā)酵品質(zhì)的影響研究卻相對較少。

電子舌、電子鼻和色度儀常用于發(fā)酵蔬菜的滋味[13]、氣味[14]和色澤[15]品質(zhì)評價中,能夠排除人為因素的影響,實現(xiàn)各指標(biāo)的數(shù)字化評價。由于其產(chǎn)出數(shù)據(jù)指標(biāo)較多,因而將多元統(tǒng)計學(xué)方法積極引入到產(chǎn)品品質(zhì)的區(qū)分中顯得尤為重要。曾亮等[16]采用主成分和聚類分析對混合采集的不同品種和花期的茶樹花的品質(zhì)進行了分類研究,王玉榮等[17]采用主成分分析對米酒的品質(zhì)進行了分類研究,有效證明了兩類方法在產(chǎn)品品質(zhì)的區(qū)分中應(yīng)用的可行性。

研究表明,純種發(fā)酵和自然發(fā)酵制作的發(fā)酵制品的品質(zhì)存在較大的差異,且純種發(fā)酵更適合于發(fā)酵蔬菜類制品的制作[18]。因此本研究采用L.fermentum(發(fā)酵乳桿菌)、L.delbrueckii(德式乳桿菌)和L.casei(干酪乳桿菌)進行了酸漿水的制備,使用電子舌、電子鼻和色度儀對酸漿水的感官指標(biāo)進行了測定,并結(jié)合主成分和聚類分析對酸漿水的品質(zhì)進行了評價和分類研究,以期為酸漿水發(fā)酵菌株的篩選和工業(yè)化提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

15株L.fermentum:HBUAS53211、HBUAS53212、HBUAS53213、HBUAS53214、HBUAS53218、HBUAS53224、HBUAS53226、HBUAS53227、HBUAS53228、HBUAS53234、HBUAS53235、BUAS53241、HBUAS53244、HBUAS53254和HBUAS53271 均分離自湖北省棗陽市琚灣酸漿面漿水中;15株L.delbrueckii:HBUAS53122、HBUAS53123、HBUAS53125、HBUAS53129、HBUAS53131、HBUAS53133、HBUAS53136、HBUAS53147、HBUAS53156、HBUAS53160、HBUAS53207、HBUAS53154、HBUAS53195、HBUAS53134和HBUAS53146 均分離自湖北省棗陽市琚灣酸漿面漿水中;15株L.casei:HBUAS53301、HBUAS53307、HBUAS53308、HBUAS53309、HBUAS53310、HBUAS53312、HBUAS53315、HBUAS53316、HBUAS53317、HBUAS53319、HBUAS53320、HBUAS53323、HBUAS53329、HBUAS53337和HBUAS53350 均分離自湖北省襄陽市濃香型白酒窖泥中;所有菌株均由湖北文理學(xué)院鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品菌種資源庫提供;面粉 邢臺金沙河面業(yè)有限責(zé)任公司;芹菜(西芹) 襄陽市609菜市場;食鹽 廣東省鹽業(yè)有限公司;內(nèi)部溶液、陽離子溶液、陰離子溶液、預(yù)處理溶液和參比溶液 日本Insent公司。

SA 402B電子舌 日本Insent公司;PEN3電子鼻 德國Airsense公司;Ultra Scan PRO色度儀 美國Hunter Lab公司;SHP-080生化培養(yǎng)箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司;CR21N高速離心機 日本日立公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 不同乳桿菌酸漿水樣品制作 挑選分離自酸堿水中L.fermentum、L.delbrueckii和L.casei各15 株于5 mL液體MRS試管中活化,再轉(zhuǎn)至150 mL液體MRS三角瓶中擴大培養(yǎng),待培養(yǎng)結(jié)束后,5000 r/min離心5 min,取菌泥溶于30 mL生理鹽水制成菌液備用。取純凈水煮沸后冷卻至室溫,按純凈水質(zhì)量比例添加0.5%的面粉和1%的芹菜后煮沸1 min,冷卻后分裝。A1～A15號樣品中分別添加100 mLL.fermentum菌液,B1～B15分別添加100 mLL.delbrueckii菌液,C1～C15分別添加100 mLL.casei,并置于37 ℃發(fā)酵24 h,8000 r/min離心5 min后備用。

1.2.2 基于電子舌酸漿水滋味品質(zhì)評價 準(zhǔn)確量取40 mL酸漿水和80 mL超純水混合均勻后8000 r/min離心5 min后上機待測。本研究參考王丹丹等[19]對于腌制大頭菜滋味測定的方法,并對樣品處理進行適當(dāng)優(yōu)化后,對酸漿水的酸、苦、澀、咸和鮮味等基本味,以及澀、苦和鮮味的回味進行數(shù)字化測定。

1.2.3 基于電子鼻酸漿水風(fēng)味品質(zhì)評價 準(zhǔn)確吸取15 mL酸漿水樣品與50 mL電子鼻樣品瓶中,于50 ℃加熱30 min,冷卻至室溫后平衡15 min后即插入探頭進行進樣。本研究參考朱娜等[20]對于果實品風(fēng)味測定的方法并進行適當(dāng)優(yōu)化,其進樣流量為180 mL/min,清潔時間為90 s,測試時間為60 s。本研究選擇49、50和51 s時的響應(yīng)值為測試數(shù)據(jù)。

表1 電子鼻標(biāo)準(zhǔn)傳感器陣列與性能描述Table 1 Standard sensor arrays and performance specification in electronic nose

1.2.4 基于色度儀酸漿水色澤品質(zhì)評價 準(zhǔn)確量取250 mL備用酸漿水樣品進行抽濾,濾液8000 r/min離心5 min后,取上清液150 mL于50 mm×50 mm色度儀專用比色皿中待測。使用白板與黑板對色度儀進行校準(zhǔn)后進行酸漿水樣品色澤的數(shù)字化測定。參考鄒金等[21]對于生抽色澤測定的方法,本研究選擇的模式為反射模式,每個樣品重復(fù)測定3次,讀數(shù)以CIE1976色度空間值L*(暗→亮:0→100),a*(綠→紅+),b*(藍→黃+)表示。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

使用Mann-Whiney test和Kruskal-Wallis test對不同種類乳酸桿菌制備酸漿水品質(zhì)評價指標(biāo)之間的差異進行分析;采用主成分分析(principal component analysis,PCA)、典范對應(yīng)分析(Canonical correspondence analysis,CCA)、聚類分析(Cluster analysis,CA)和多元方差分析(Multivariate analysis of variance,MANOVA)對不同乳酸桿菌發(fā)酵制備酸漿水品質(zhì)差異進行分析。

除主成分分析使用PAST3軟件,其他分析均使用MATLAB 2016b軟件;所有圖均使用Origin 2017軟件繪制。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同乳酸桿菌發(fā)酵對酸漿水品質(zhì)的影響

2.1.1 不同乳酸桿菌發(fā)酵對酸漿水滋味品質(zhì)的影響 本研究首先使用電子舌技術(shù)對45個酸漿水樣品的酸、苦、澀、咸和鮮味,以及澀、苦和鮮味的回味進行數(shù)字化分析,以不同種乳酸桿菌為分組依據(jù),3組酸漿水的箱型圖如圖1所示。

由圖1可知,同一種乳酸桿菌制備酸漿水的滋味品質(zhì)差異相對較小,而不同乳酸桿菌制備酸漿水的滋味品質(zhì)之間差異則較大。經(jīng)Kruskal-Wallis test發(fā)現(xiàn),3組酸漿水樣品的苦、咸、鮮和后味A(澀的回味)的差異極顯著(P<0.001),酸和豐度(鮮的回味)的差異非常顯著(P<0.01)。經(jīng)Mann-Whiney test發(fā)現(xiàn),L.delbrueckii制備酸漿水在酸味的強度上顯著高于其他兩組(P<0.05),在豐度的強度上顯著高于L.fermentum制備的酸漿水(P<0.05),而在苦味和咸味的相對強度上顯著低于其余兩組(P<0.05)。值得注意的是,酸味作為酸漿水重要的特征滋味,在一定強度內(nèi),其相對強度越大越能促進人的食欲和解乏,其口感也更佳。因此,L.delbrueckii制備酸漿水的滋味品質(zhì)整體要優(yōu)于其他兩組。

圖1 不同乳酸桿菌制備酸漿水滋味指標(biāo)的箱型圖Fig.1 Box diagram of the taste index of suanjiangshui samples fermented by different kinds of Lactobacillus注:兩組之間均采用Mann-Whiney test,含有不同字母的同一指標(biāo)間差異顯著(P<0.05)。

表2 不同乳酸桿菌制備酸漿水色澤指標(biāo)的差異性分析Table 2 Difference analysis of water color indicators of suanjiangshui samples fermented by different kinds of Lactobacillus

2.1.2 不同乳酸桿菌發(fā)酵對酸漿水風(fēng)味品質(zhì)的影響 本研究使用電子鼻對酸漿水中的10 組典型物質(zhì)類型進行測定,以不同乳酸桿菌為分組依據(jù),3 組酸漿水的雷達圖如圖2所示。由圖2可知,不同乳酸桿菌制備酸漿水在W1C(對芳香類物質(zhì)靈敏)、W5S(對氮氧化物靈敏)、W6S(對氫氣有選擇性)、W5C(對烷烴、芳香類物質(zhì)靈敏)、W1S(對甲烷靈敏)和W3S(對烷烴靈敏)風(fēng)味指標(biāo)上差異較大,而在W3C(對芳香類物質(zhì)靈敏)、W1W(對有機硫化物、萜類物質(zhì)靈敏)、W2S(對乙醇靈敏)和W2W(對有機硫化物靈敏)風(fēng)味指標(biāo)上差異較小。由此可見,不同乳酸桿菌制備酸漿水風(fēng)味品質(zhì)的差異主要體現(xiàn)在芳香類物質(zhì)、氮氧化物和烷烴類物質(zhì)上。經(jīng)Kruskal-Wallis test發(fā)現(xiàn),W1C、W5S、W5C、W1S和W3S 5個指標(biāo)在不同乳酸桿菌制備酸漿水之間的差異極顯著(P<0.001);經(jīng)Mann-Whiney test發(fā)現(xiàn),L.fermentum在芳香類物質(zhì)和烷烴類物質(zhì)的含量顯著高于其他兩組(P<0.05),而在氮氧化物和甲烷的含量上顯著低于其他兩組(P<0.05)。值得注意的是,L.fermentum制備酸漿水的風(fēng)味和其他兩組差異較大,而其他兩組的差異相對較小。綜上所述,L.fermentum制備酸漿水的風(fēng)味品質(zhì)整體上略優(yōu)于其他兩組。

圖2 不同乳酸桿菌制備酸漿水風(fēng)味指標(biāo)的雷達圖Fig.2 Radar diagram of the flavor index of suanjiangshui samples fermented by different kinds of Lactobacillus

2.1.3 不同乳酸桿菌發(fā)酵對酸漿水色澤品質(zhì)的影響 本研究使用色度儀對不同乳桿菌酸漿水的色澤品質(zhì)進行了評價,其具體強度值如表2所示,3 組酸漿水在L*(明亮度)和a*(紅綠度)上差異極顯著(P<0.001),在b*(黃藍度)上差異非常顯著(P<0.01)。經(jīng)Mann-Whiney test發(fā)現(xiàn),L.delbrueckii制備酸漿水在明亮度顯著高于L.fermentum(P<0.05),其在黃藍度上顯著高于L.casei(P<0.05)。值得注意的是,酸漿水的明亮度越高,紅綠度和黃藍度的絕對值越接近零,其色澤品質(zhì)則越優(yōu)。綜上所述,L.delbrueckii制備酸漿水的色澤品質(zhì)相較于其他兩組更優(yōu)。

2.2 基于主成分和聚類分析不同乳酸桿菌制備酸漿水的差異性分析

2.2.1 基于主成分和UPGMA聚類分析酸漿水的差異性 由電子舌、電子鼻和色度儀測定的多維數(shù)據(jù)直接用于酸漿水品質(zhì)的分析較為困難,無法對酸漿水整體的差異性進行分析。本研究首先使用PCA對8個滋味指標(biāo)、10個風(fēng)味指標(biāo)和3個色澤指標(biāo)進行降維分析。同時,為排除因分組帶來的誤差,本研究進一步使用有監(jiān)督的CCA對3組酸漿水樣品的空間排序進行進一步分析,并結(jié)合CA對PCA和CCA的結(jié)果進行進一步的驗證?；赑CA分析3組酸漿水樣品的3D因子載荷圖如圖3所示。

由圖3可知,總方差貢獻率的89.27%來自前3個主成分,其貢獻率分別為73.17%、11.43%和4.67%,因此,3個綜合變量可以代表絕大部分原始變量的信息,本研究成功地將21個品質(zhì)評價指標(biāo)降維到3個不相關(guān)的綜合變量。由圖3亦可知,PC1主要由后味A、W1C、W5S、W6S、W5C、W1S、W3S、L*、a*和b*等10 個指標(biāo)構(gòu)成,其中PC1的正影響指標(biāo)有L*、W6S、W5S、W1S、a*和后味A,明亮度的載荷量最高為0.37,而負影響指標(biāo)有W1C、W5C、b*和W3S,W3S的載荷量最高為0.37,因此PC1的主要差異集中在烷烴、芳香類物質(zhì)和明亮度上;PC2的正影響指標(biāo)為鮮味和咸味,咸味的載荷量最高為0.60,而負影響指標(biāo)由酸味、澀味和后味B構(gòu)成,其中酸味的載荷量最高為0.39,即PC2的主要差異集中在酸味和咸味;PC3由苦味、豐度、W1W、W2W、W3C和W2S,且6個指標(biāo)均為正影響指標(biāo),且苦味的載荷量最高為0.44,即PC3的主要差異集中在苦味上。從不同乳酸桿菌發(fā)酵分組來看,PC1得分最高的為L.casei,PC2得分最高的為L.delbrueckii,而PC3得分最高的為L.fermentum。

圖3 不同種乳酸桿菌制備酸漿水的3D因子載荷圖Fig.3 3D factor load diagram of suanjiangshui samples fermented by different kinds of Lactobacillus

由圖4a可知,3 組酸漿水樣品在空間排布上具有一定的分離趨勢,其中L.fermentum發(fā)酵的酸漿水樣品與其他兩組具有明顯的分離趨勢,而L.delbrueckii發(fā)酵的酸漿水盡管有部分與L.casei存在重合,但整體上還是存在一定的分離趨勢。本研究進一步使用非加權(quán)聚類分析對3 組酸漿水樣品進行分析,由圖4b可知,當(dāng)距離大于3.0時,45 個酸漿水樣品可分為2 個大的聚類,其中聚類Ⅰ全部由L.fermentum發(fā)酵的酸漿水構(gòu)成,而聚類Ⅱ則由其余兩組酸漿水構(gòu)成;距離為2.5時,45個酸漿水樣品可分為2個大的聚類,其中聚類Ⅰ全部由L.fermentum發(fā)酵的酸漿水構(gòu)成,而聚類Ⅱ則包含L.delbrueckii發(fā)酵的酸漿水和L.casei發(fā)酵的酸漿水。由此可知,聚類分析的結(jié)果與PCA的結(jié)果一致,進一步說明了PCA結(jié)果的正確性。

圖4 不同乳酸桿菌制備酸漿水樣品因子得分圖(a)和聚類分析圖(b)Fig.4 Factor score diagram(a)and cluster analysis of suanjiangshui samples fermented by different kinds of Lactobacillus注:A代表L. fermentum制作酸漿水;B代表L. delbrueckii制作酸漿水;C代表L. casei制作酸漿水。

2.2.2 基于典范對應(yīng)和聚類分析酸漿水整體結(jié)構(gòu)的差異性 本研究為排除分組給分析結(jié)果帶來的影響,進一步使用有監(jiān)督的多元統(tǒng)計學(xué)方法對3 組酸漿水的空間排布進行分析。以不同乳酸桿菌為分組依據(jù)的結(jié)果如圖5所示。

由圖5a可知,3 組酸漿水樣品在空間排布上具有明顯的分離趨勢,L.fermentum發(fā)酵的酸漿水樣品全部位于X軸原點左側(cè),L.delbrueckii發(fā)酵的酸漿水樣品全部位于第四象限,而L.casei發(fā)酵的酸漿水則全部位于第一象限。由圖5b可知,L.delbrueckii與L.casei發(fā)酵的酸漿水之間具有極顯著差異(P<0.001),且兩者均與L.fermentum發(fā)酵的酸漿水具有極顯著差異(P<0.001),由此也印證了CCA結(jié)果的正確性。聚類分析可根據(jù)聚類距離的不同獲得不同的聚類結(jié)果,而主成分分析結(jié)果與聚類距離在2.5時的結(jié)果基本相同,說明通過兩種方法均能對酸漿水樣品進行分類分析。通過這些分析手段可為后續(xù)酸漿水發(fā)酵菌株的篩選提供一定的參考依據(jù),從而指導(dǎo)酸漿水的工業(yè)化生產(chǎn)。

圖5 不同乳酸桿菌準(zhǔn)備酸漿水樣品的典范對應(yīng)分析圖(a)和聚類分析圖(b)Fig.5 Canonical correspondence analysis(a)and cluster analysis(b)of suanjiangshui samples fermented by different kinds of Lactobacillus注:***表示差異極顯著(P<0.001)。

3 結(jié)論

使用電子舌、電子鼻和色度儀對L.fermentum、L.delbrueckii和L.casei制備酸漿水的品質(zhì)進行了評價,并結(jié)合主成分和聚類分析對其差異進行了分析。不同乳桿菌發(fā)酵酸漿水樣品在空間排布和聚類上具有明顯的分離趨勢,而同組樣品之間則表現(xiàn)出明顯的聚類趨勢。電子舌結(jié)果顯示,L.delbrueckii制備的酸漿水在酸味的強度上顯著高于其他兩組(P<0.05),在豐度的強度上顯著高于L.fermentum制備的酸漿水(P<0.05),而在苦味和咸味的相對強度上顯著低于其余兩組(P<0.05);電子鼻結(jié)果表明,L.fermentum在部分芳香類物質(zhì)的含量上顯著高于其他兩組;在色澤品質(zhì)上L.delbrueckii發(fā)酵的酸漿水其明亮度較優(yōu)。綜上所述,L.delbrueckii更適合酸漿水的發(fā)酵。