人參總蛋白對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究

鄭麗娜，趙大慶，趙文學(xué)，喬巨慧，劉穎，劉美辰

（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)吉林省人參科學(xué)研究院，吉林長(zhǎng)春130117）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）是發(fā)病率最高的神經(jīng)退行性疾病，以其在老年人群中的高發(fā)性和對(duì)社會(huì)的危害性而備受關(guān)注[1]。隨著社會(huì)人口老齡化的進(jìn)程，AD有效預(yù)防和治療手段的研發(fā)迫在眉睫。AD 的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，β-淀粉樣蛋白（amyloid β，Aβ）沉積形成的老年斑及神經(jīng)原纖維纏結(jié)形成是AD典型病理特征[2]。研究表明Aβ可直接或間接對(duì)線粒體結(jié)構(gòu)及功能造成損傷，進(jìn)而誘發(fā)氧化應(yīng)激、激活凋亡信號(hào)通路等級(jí)聯(lián)反應(yīng)[3]；另一方面可促進(jìn)Aβ生成，進(jìn)一步加重線粒體損傷，從而形成惡性循環(huán)，導(dǎo)致神經(jīng)元變性凋亡。因此，抑制Aβ誘導(dǎo)的線粒體損傷對(duì)減輕AD病理損害具有重要意義[4-5]。

天然藥物對(duì)疾病的干預(yù)具有多靶點(diǎn)、低毒性和整體調(diào)節(jié)的作用優(yōu)勢(shì)，已被越來越多的研究人員所關(guān)注。其中，人參（Panax ginseng C.A.Mey）為“百草之王”，具有“調(diào)神益智”的傳統(tǒng)功效，同時(shí)現(xiàn)代藥理研究也證明了人參中多種活性成分在AD的預(yù)防和治療中具有良好的作用效應(yīng)[6-10]，但其保護(hù)作用機(jī)制尚不明確。因此，本研究選擇人參中主要活性成分——人參水溶性總蛋白，以Aβ25-35誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡作為神經(jīng)元損傷的體外模型，從細(xì)胞水平考察人參水溶性總蛋白對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用；進(jìn)而利用分子生物學(xué)相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)從線粒體功能維系的角度闡明人參總蛋白參與的細(xì)胞內(nèi)調(diào)控途徑，為研制更為有效的抗AD藥物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

人參水溶性總蛋白（ginseng water soluble total protein，GTP）：長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥大健康創(chuàng)新中心提供，批號(hào)2018030701，總蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為83.25%；Aβ25-35：Sigma公司；CCK-8 試劑盒：博士德生物有限公司；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒：BD PharmingenTM；ROS檢測(cè)試劑盒：Thermo Fisher Scientific；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD） 活力、丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量檢測(cè)試劑盒：南京建成生物工程研究所；ATP檢測(cè)試劑盒、羅丹明123、BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒、Beta-Tubulin內(nèi)參抗體（β-tubulin rabbit monoclonal antibody，β-tubulin）和細(xì)胞色素C抗體（cytochrome C rabbit monoclonal antibody，Cyto C）：碧云天生物有限公司；COX IV線粒體內(nèi)參抗體（Anti-COX IV antibody，COX IV）：愛必信生物科技有限公司，B淋巴細(xì)胞瘤-2基因抗體（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2相關(guān) X蛋白抗體（Bcl-2 associated X protein，Bax）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶抗體（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogensae，GAPDH）：abcam 公司（美國(guó)）司；磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）：Hyclone 生物有限公司；DMEM/F12 培養(yǎng)基：BI公司；胎牛血清：Gibco公司。

1.2 主要儀器

Infinite M200PR0全自動(dòng)酶標(biāo)儀：Tecan公司；Flow Sight多維全景流式細(xì)胞儀：Amnis公司；Mini Protean蛋白電泳儀（PowerPacTMHC）：Bio-rad公司；371細(xì)胞培養(yǎng)箱：Thermo公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞（SH-SY5Y）：中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫。SH-SY5Y細(xì)胞于含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 AD細(xì)胞模型的建立

配制Aβ25-35母液，濃度為500μmol/L，于37℃孵育7d以形成聚集形式，即為老化的Aβ25-35。用DMEM/F12全培養(yǎng)基將老化的Aβ25-35稀釋至25μmol/L，加入至細(xì)胞中培養(yǎng)24h，即獲得AD細(xì)胞模型。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組

對(duì)照組：DMEM/F12完全培養(yǎng)基正常培養(yǎng)；模型組：加入終濃度為25μmol/L老化的Aβ25-35培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞24 h；藥物干預(yù)組：利用不同濃度的人參水溶性總蛋白（6.25、12.5、25μg/mL）預(yù)保護(hù) SH-SY5Y 細(xì)胞 12 h，隨后加入25μmol/L的Aβ25-35共同孵育24 h。

1.6 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力

SH-SY5Y細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，按照實(shí)驗(yàn)分組干預(yù)處理后每孔加入CCK-8溶液20μL，37℃繼續(xù)孵育1 h，終止培養(yǎng)，設(shè)置空白孔調(diào)零，酶標(biāo)儀上震蕩3 min后在450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔OD值，記錄并計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.7 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

SH-SY5Y細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，按照實(shí)驗(yàn)2分組干預(yù)處理后收集細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞3次，1 200 r/min離心5 min，加入 200μL 1×Binding buffer懸浮細(xì)胞，之后加入5μL Annexin V-EGFP混勻后，加入5μL Propidium Iodied混勻，室溫避光反應(yīng)15 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)Ex=488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)Em=530 nm。Annexin V-EGFP的綠色熒光通過FITC通道檢測(cè)，PI紅色熒光通過PI通道檢測(cè)。熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)使用未經(jīng)凋亡誘導(dǎo)處理的正常細(xì)胞作為對(duì)照進(jìn)行熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)去除光譜重疊和設(shè)定十字門的位置。

1.8 胞內(nèi)ROS水平檢測(cè)

用無血清DMEM/F12培養(yǎng)基稀釋DCFH-DA，終濃度為10μmol/L。細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，棄掉培養(yǎng)液，每孔加入100μL稀釋好的DCFH-DA，在37℃的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。用無血清DMEM/F12培養(yǎng)液輕輕洗滌細(xì)胞3次，去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA，注意不要將細(xì)胞吸出。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。使用激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)525 nm，檢測(cè)藥物作用前后熒光的強(qiáng)弱。

1.9 SOD活力和MDA含量檢測(cè)

將各組細(xì)胞勻漿后置于冰上裂解，離心收集上清，使用SOD活力檢測(cè)試劑盒進(jìn)行SOD活力檢測(cè)，MDA含量檢測(cè)試劑盒測(cè)定MDA含量。

1.10 ATP含量檢測(cè)

SH-SY5Y細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，按照實(shí)驗(yàn)分組干預(yù)處理后嚴(yán)格按ATP含量測(cè)試盒說明書進(jìn)行操作，利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)各孔吸光度值，記錄并計(jì)算ATP含量。

1.11 線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）分析

SH-SY5Y細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，按照實(shí)驗(yàn)分組干預(yù)處理后收集細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞3次，加入羅丹明123使其終濃度為2μmol/L，37℃避光孵育30 min，1 200 r/min離心5 min，棄上清，加入PBS洗滌細(xì)胞3次，最后加入200μL PBS重懸細(xì)胞，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)507nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)529nm，檢測(cè)藥物作用前后熒光強(qiáng)弱。

1.12 蛋白提取和Western blot

SH-SY5Y細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，按照實(shí)驗(yàn)分組處理后收集細(xì)胞，PBS洗滌3次，加入細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，使用BCA試劑盒測(cè)定蛋白含量，制樣。SDSPAGE 凝膠配制，上樣，70 V 30 min，140 V 50 min電泳后使用NC膜18 V 350 mA半濕法轉(zhuǎn)膜20 min，5%PBS奶粉封閉30 min，PBST洗滌膜片3次，每次5 min，切膜，4℃一抗孵育過夜（β-Tubulin按1∶1 000稀釋，COX IV及cyt-c按1∶500稀釋），收集一抗，用1%PBS奶粉稀釋二抗，二抗孵育1 h，顯色處理，避光。

1.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

除特殊說明外，所有研究均進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，數(shù)據(jù)以means±SD形式展示。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用Graph－Pad Prism6軟件完成，組間差異分析應(yīng)用One-way ANOVA分析方法完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 人參水溶性總蛋白對(duì)Aβ25-35損傷SH-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)作用

GTP對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞活力和凋亡的影響見圖1。

為了明確GTP對(duì)Aβ25-35損傷SH-SY5Y細(xì)胞的影響，首先采用CCK-8法檢測(cè)GTP作用前后細(xì)胞活力的改變，如圖1A所示，不同濃度的GTP可以減緩Aβ誘導(dǎo)所致細(xì)胞活力降低，并呈現(xiàn)濃度依賴性。由圖1B和圖1C可知，流式細(xì)胞術(shù)Annexin V/PI雙染色定量檢測(cè)細(xì)胞凋亡程度，結(jié)果顯示GTP預(yù)處理可顯著降低Aβ25-35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡數(shù)量，且呈劑量依賴性。

2.2 GTP對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞氧化應(yīng)激壓力的影響

GTP降低Aβ25-35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞氧化應(yīng)激壓力見圖2。

應(yīng)用DCFH-DA熒光探針檢測(cè)Aβ25-35損傷后細(xì)胞內(nèi)ROS生成量。結(jié)果可見，Aβ25-35處理可顯著增加SH-SY5Y胞內(nèi)ROS生成量，給予不同濃度GTP預(yù)處理，可降低胞內(nèi)ROS水平（圖2A）。同時(shí)GTP預(yù)處理可降低胞內(nèi)MDA含量，增加SOD活力（圖2B和圖2C）。

2.3 GTP對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞線粒體功能紊亂的挽救

GTP對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞線粒體功能紊亂的挽救見圖3。

圖1 GTP對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞活力和凋亡的影響Fig.1 Effect of GTP on Aβ25-35induced SH-SY5Y cell viability and apoptosis

圖2 GTP降低Aβ25-35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞氧化應(yīng)激壓力Fig.2 GTP reduces the oxidative stress induced by Aβ25-35in SH-SY5Y cells

圖3 GTP對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞線粒體功能紊亂的挽救Fig.3 GTP rescue of mitochondrial dysfunction induced by Aβ25-35in SH-SY5Y cells

線粒體在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用，線粒體膜電位和ATP產(chǎn)生量是衡量線粒體功能的關(guān)鍵指標(biāo)。結(jié)果可見Aβ25-35處理可導(dǎo)致細(xì)胞MMP顯著降低，而不同濃度GTP預(yù)處理可阻止Aβ25-35導(dǎo)致的MMP降低（圖3A）。與此同時(shí)，GTP預(yù)處理可在一定程度上挽救Aβ25-35導(dǎo)致的胞內(nèi)ATP含量降低（圖3B）。以上結(jié)果共同證明了GTP對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞線粒體功能紊亂的挽救作用。

2.4 GTP對(duì) Aβ25-35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞Bcl-2和Bax表達(dá)及細(xì)胞色素C釋放的影響

GTP對(duì)線粒體相關(guān)凋亡信號(hào)途徑關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響見圖4。

圖4 GTP對(duì)線粒體相關(guān)凋亡信號(hào)途徑關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effect of GTP on the expression of key proteins in mitochondria-associated apoptotic signaling pathway

與對(duì)照組相比，Aβ25-35建模細(xì)胞Bcl-2表達(dá)水平顯著降低，同時(shí)Bax表達(dá)上調(diào)，與流式細(xì)胞技術(shù)定量檢測(cè)結(jié)果相一致。給予不同濃度的GTP處理后，Bcl-2表達(dá)水平隨著GTP濃度的增加逐漸升高，同時(shí)Bax表達(dá)水平逐漸降低，證明了GTP可通過上調(diào)Bcl-2表達(dá)、抑制Bax表達(dá)，從而對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡起到保護(hù)作用（圖4A）。細(xì)胞色素C從線粒體釋放入細(xì)胞質(zhì)中，從而誘發(fā)細(xì)胞凋亡。結(jié)果可見，給予Aβ25-35刺激后，SH-SY5Y細(xì)胞質(zhì)中cyto C含量增加；不同濃度GTP預(yù)處理可降低胞質(zhì)中cyto C含量，證明GTP可抑制cyto C從線粒體向胞質(zhì)中的釋放（圖4B）。

3 結(jié)論與討論

Aβ是AD發(fā)病機(jī)制的核心參與者，其中Aβ25-35是由11個(gè)氨基酸組成的較短毒性片段，包含完整蛋白質(zhì)的β片層[11]。使用Aβ25-35處理SH-SY5Y細(xì)胞，細(xì)胞活力顯著降低，凋亡程度嚴(yán)重增加，首先證明了Aβ25-35對(duì)細(xì)胞的毒性作用。用GTP預(yù)處理則可逆轉(zhuǎn)這些毒性效應(yīng)，證明GTP對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性具有神經(jīng)保護(hù)作用，對(duì)AD可能具有潛在治療價(jià)值。

進(jìn)一步對(duì)GTP的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制進(jìn)行探討。Aβ積聚導(dǎo)致神經(jīng)元過度凋亡，與AD腦內(nèi)神經(jīng)元丟失密切相關(guān)[12]。研究表明，Aβ25-35可通過誘發(fā)細(xì)胞產(chǎn)生過量的ROS，增加氧化應(yīng)激，進(jìn)而導(dǎo)致線粒體功能障礙[13-14]；同時(shí)可促進(jìn)線粒體釋放凋亡相關(guān)因子，誘發(fā)線粒體相關(guān)凋亡途徑，引起細(xì)胞凋亡[15]。研究結(jié)果表明，GTP可通過抑制ROS的產(chǎn)生發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，且GTP預(yù)處理可以降低Aβ25-35誘導(dǎo)的線粒體超氧化物升高，減少Aβ25-35暴露后的氧化應(yīng)激壓力。為了進(jìn)一步明確GTP對(duì)線粒體功能的維系作用，研究考察GTP對(duì)MMP和ATP水平的影響作用，可見GTP能夠顯著抑制Aβ25-35損傷導(dǎo)致的MMP降低，同時(shí)抑制ATP水平的下降。這些研究結(jié)果證明GTP可有效改善Aβ25-35損傷引起的線粒體功能紊亂。Cyto C是線粒體電子傳遞鏈的重要組成[16]。正常情況下，其位于線粒體的膜間隙，在凋亡過程中則從線粒體外模釋放入細(xì)胞質(zhì)中，cyto C向胞質(zhì)的釋放是引發(fā)凋亡的關(guān)鍵步驟[17]。MMP降低和ROS水平的升高均可通過不同作用途徑誘導(dǎo)cyto C向胞質(zhì)的釋放[18]。除此之外，其向胞質(zhì)的釋放還依賴于線粒體外膜特異性通道的調(diào)控，該通道主要由Bcl-2家族成員形成。其中，Bcl-2（抗凋亡蛋白）和Bax（促凋亡蛋白）是Bcl-2家族的核心成員[19]。Bcl-2的上調(diào)可以穩(wěn)定線粒體外膜，阻斷cyto C自線粒體釋放入胞質(zhì)，從而抑制細(xì)胞凋亡；而Bax的上調(diào)則可以促進(jìn)cyto C向胞質(zhì)的釋放，誘發(fā)凋亡[20]。研究結(jié)果顯示，不同濃度的GTP預(yù)處理不僅可以挽救Aβ25-35誘導(dǎo)導(dǎo)致的MMP降低和ROS水平升高，同時(shí)可以上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)、抑制促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，抑制cyto C從線粒體向胞質(zhì)中的釋放，降低胞質(zhì)中cyto C含量，降低細(xì)胞凋亡，最終對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡起到保護(hù)作用。

綜上，本研究證明了GTP對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)SHSY5Y細(xì)胞的保護(hù)作用效應(yīng)，并從線粒體功能維系及線粒體相關(guān)凋亡信號(hào)途徑闡明了作用機(jī)制，為抗AD有效藥物的研發(fā)提供了理論依據(jù)。