雙柱在線凈化快速測定魚肉中孔雀石綠、結晶紫及其代謝物

（天津海關動植物與食品檢測中心，天津300456）

孔雀石綠（malachite green，MG）和結晶紫（crystal violet，CV）均屬于三苯甲烷類工業(yè)染料，由于其可以作為殺菌劑用于控制魚類或魚卵的寄生蟲、真菌和細菌感染，早期在水產養(yǎng)殖上用來預防和治療水產動物的鰓霉病、水霉病和水體環(huán)境消毒[1-2]。它們在被魚類吸收后，大部分會快速地轉化為隱色孔雀石綠（leucomalachite green，LMG）和隱色結晶紫（leucocrystal violet，LCV），代謝物由于其具有很好的親脂性，因而在魚類的脂肪組織中會形成比較穩(wěn)定的殘留[2]。研究表明，此類藥物具有致癌、致畸、致突變等副作用[3]，歐盟、美國、日本以及我國等均宣布禁止其在水產品養(yǎng)殖過程中使用。但由于其價格低廉、效果顯著，且尚無更好的替代品，所以在水產養(yǎng)殖中的使用屢禁不止。

目前國內外孔雀石綠、結晶紫及其代謝產物的方法主要有高效液相色譜法（high performancy liquit chromatography，HPLC）[4-5]、高效液相色譜-串聯(lián)質譜法（high performancy liquit chromatography-mass tande mass spectrometry，HPLC-MS/MS）[6-11]等。HPLC 方法前處理步驟復雜，檢測靈敏度不高，且容易出現(xiàn)干擾，需要進一步的確證；HPLC-MS/MS方法前處理復雜，且水產樣品基質復雜，容易產生基質效應。在線凈化技術是針對質譜分析的高級在線復雜基質樣品萃取技術，結合了擴散、化學和體積排除的原理，在捕獲目標化合物的同時能夠快速凈化樣品[12-14]。堵燕鈺等[15]采用Turboflow在線凈化技術與HPLC-MS/MS聯(lián)用技術檢測水產品中孔雀石綠及隱性孔雀石綠的殘留，但未對結晶紫及隱色結晶紫殘留進行研究。本研究是對在線凈化技術的改進，通過兩根不同凈化柱的串聯(lián)使用，進一步提高了復雜樣品的凈化效果。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

TSQ Quantum Ultra AM三重四極質譜儀、Turboflow在線液相色譜系統(tǒng)（包括兩個Transcend 600泵和CTC多功能進樣器）、Aria OS及Xcalibur操作軟件：美國Thermo Fisher公司；Waters 515液相泵：美國Waters公司；08895-67型超聲波提取儀：美國 Cole Parmer公司；CR22高速離心機：日本日立公司；MILLI-Q純水器：美國Millipore公司。

1.1.2 試劑

甲醇、乙腈和甲酸（HPLC純）：美國Dikma公司；醋酸銨（色譜純）：天津光復精細化工研究所；孔雀石綠（MG，純度≥99%）、結晶紫（CV，純度≥99%）、隱身孔雀石綠（LMG，純度≥99%）、隱色結晶紫（LCV，純度≥99%）、同位素內標孔雀石綠-d5（MG-d5，純度≥99%），同位素內標隱色孔雀石綠-d6（LMG-d6，純度≥99%）：美國Biopure公司。

儲備液及工作液的配制：用乙腈將各固體標準品配制為0.1 mg/mL的標準儲備液。取各儲備液適量，用乙腈將儲備液配制為1.0 μg/mL的混合工作液。

內標儲備液及工作液的配制：用乙腈將MG-d5和LMG-d6標準品配制為0.1 mg/mL的標準儲備液。取各儲備液適量，用乙腈將儲備液配制為1.0 μg/mL的混合中間液和0.1 μg/mL混合內標工作液。

1.2 質譜條件的優(yōu)化

采用針泵連續(xù)進樣的方式，在正離子模式（ESI+）下，先對各個目標物進行母離子全掃描，然后對其子離子進行全掃描，分別選定定性離子和定量離子，并對噴霧電壓、離子源溫度、鞘氣、輔助氣、離子透鏡電壓等參數(shù)進行優(yōu)化。

1.3 雙柱在線凈化原理

雙柱在線凈化技術通過柱切換實現(xiàn)樣品的兩步凈化與測定一體化。主要包括3步：上樣、一維凈化、轉移、二維凈化、轉移、測定，其中測定的同時包括在線凈化柱的清洗與平衡。上樣與測定步驟柱連接方式相同。圖1為上樣和測定過程的示意圖，圖2、圖3分別為轉移過程示意圖，圖中A、B、C和D分別表示不同的洗脫溶劑。

1.4 雙柱在線凈化方法優(yōu)化

根據(jù)孔雀石綠等藥物性質，優(yōu)化選擇一維凈化柱，試驗不同上樣溶液及洗脫溶液對藥物的富集效果。一維富集后，藥物洗脫至二維凈化柱，優(yōu)化選擇二維凈化柱類型，選擇適當活性的萃取柱，試驗不同洗脫溶劑的洗脫效果。

1.5 色譜條件優(yōu)化

圖1 上樣和測定過程示意圖Fig.1 Schematic diagram of loading and detecting

根據(jù)優(yōu)化選擇不同的流動相，使各藥物質譜響應最佳。優(yōu)化梯度洗脫程序，使各化合物峰形尖銳，對稱。

圖2 轉移至二維凈化過程示意圖Fig.2 Schematic diagram of transferring to the second cleanup-column

圖3 轉移至分析柱凈化過程示意圖Fig.3 Schematic diagram of transferring to analysis column

1.6 基質工作曲線的繪制

以空白樣品提取液，分別加入孔雀石綠等藥物混標工作液以及內標工作液適量，配制系列標準基質溶液（0.1、0.2、0.5、1、2 ng/mL，內標為 1 ng/mL）進行測試，以藥物濃度為橫坐標，藥物與相應內標峰面積比為縱坐標（孔雀石綠-d5作為孔雀石綠和結晶紫的內標，隱色孔雀石綠-d6作為隱形孔雀石綠和隱色結晶紫的內標），繪制標準工作曲線。

1.7 樣品處理方法優(yōu)化

優(yōu)化建立與在線凈化相適應的前處理方法，樣品經簡單的溶劑提取過濾后直接上機測定。比較不同溶劑的提取效果，以空白樣品添加一定濃度的標準溶液，以絕對回收率評價提取效果。

1.8 加標回收試驗

以未檢測出孔雀石綠等藥物的魚肉作為空白基質，加入標準混合溶液及內標，選擇優(yōu)化后的前處理條件和儀器條件，上機檢測，計算回收率。

1.9 儀器條件

1.9.1 色譜條件

表1 雙柱在線凈化系統(tǒng)洗脫程序表Table 1 Elution program of positive electrospray ionization

一維凈化柱為Cyclone MCX（50 mm×0.5 mm），上樣溶劑為0.1%甲酸水溶液，洗脫溶液為乙腈-丙酮-氨水（47.5+47.5+5，體積比），洗脫流速 0.4 mL/min。二維凈化柱為C8XL（50 mm×0.5 mm），上樣溶劑為0.1%甲酸水溶液，洗脫溶液為1%氨水甲醇溶液，洗脫流速0.3 mL/min。分析柱為Atlantis dC18色譜柱（150 mm×2.1mm，3μm），流動相為0.1%甲酸溶液（含有0.01mol/L甲酸氨）+乙腈，洗脫程序見表1。進樣量100 μL（每次進樣 25 μL，共 4 次，計 100 μL），外標法定量。

續(xù)表1 雙柱在線凈化系統(tǒng)洗脫程序表Continue table 1 Elution program of positive electrospray ionization

1.9.2 質譜條件

電噴霧離子源（ESI），正離子模式，噴霧電壓設定為3 000 V，噴霧加熱器溫度350℃，離子傳輸管溫度300℃，鞘氣壓力8 750 kPa，輔助氣壓力2 625 kPa。

采用選擇性反應監(jiān)測模式（selective reaction monitoring，SRM）采集質譜數(shù)據(jù)，質譜條件分別見表2。

2 結果與分析

2.1 質譜條件的優(yōu)化

1.0 μg/mL標準溶液直接泵入質譜，在ESI+模式進行一級全掃描，調節(jié)噴霧電壓、鞘氣、輔助氣、離子透鏡電壓等質譜條件，獲得豐度較高的各化合物準分子離子峰，優(yōu)化各母離子的離子透鏡電壓。以其作為母離子進行二級質譜掃描，選取響應信號最強的兩個特征碎片離子，作為子離子，較高的作為定量離子，次之的為定性離子，優(yōu)化子離子碰撞能量，最終優(yōu)化后質譜參數(shù)見表2。

2.2 雙柱在線凈化系統(tǒng)優(yōu)化

2.2.1 一維凈化柱的操作條件優(yōu)化

孔雀石綠等藥物為陽離子藥物，同時其極性較弱，因此其在陽離子交換柱（MCX）和反相C18或C8上都有較好的保留。由于MCX作用機理主要是離子交換，其抗干擾能力和選擇性由于反相凈化柱。因此選擇MCX作為一維凈化柱。

上樣溶劑選擇0.1%甲酸水最為方便，酸性條件有利于孔雀石綠等藥物在凈化柱上的保留。純水作為上樣溶劑經過洗脫后，活性無法完全恢復，影響孔雀石綠等藥物的吸附。

MCX作為離子交換柱，洗脫溶劑需要一定濃度的氨水，且由于孔雀石綠等藥物極性較弱，洗脫溶劑極性需要調節(jié)適當。洗脫溶劑試驗了甲醇-氨水體系，乙腈-氨水體系，乙腈-丙酮-氨水體系，采用乙腈-丙酮-氨水體系時結晶紫和隱色結晶紫洗脫峰尖銳，其他溶劑體系洗脫能力不夠，最終優(yōu)化采用乙腈-丙酮-氨水（47.5+47.5+5，體積比）作為一維凈化柱的洗脫溶劑。

2.2.2 二維凈化柱的操作條件優(yōu)化

孔雀石綠等藥物經一維MCX柱凈化后轉移至二維凈化柱，進一步富集凈化。二維凈化柱選擇與一維凈化柱不同凈化機理的有助于進一步去除干擾，因此二維凈化柱選擇反相柱。由于反相C18或C8上都有較好的保留，試驗優(yōu)化了 HLB、C18P、C18XL、C8XL 等反相凈化柱，發(fā)現(xiàn)各凈化柱對結晶紫和隱色結晶紫吸附能力為HLB>C18P>C18XL>C8XL，由于二維凈化柱洗脫液進入分析柱，需要該凈化柱適當保留即可，洗脫液洗脫能力過大將影響分析柱上的保留及洗脫，最后導致峰形較差，影響定量。因此選擇C8XL作為二維凈化柱。

C8XL凈化柱的洗脫液可使用機溶劑，試驗發(fā)現(xiàn)一定濃度的氨水可以提高洗脫能力，避免使用極性較弱的溶劑影響孔雀石綠等藥物在分析柱上的保留。洗脫溶劑要求極性越強越好，氨水比例越低越好，經優(yōu)化1%的氨水-甲醇即可完成C8XL柱的洗脫。

2.3 色譜條件的優(yōu)化

為獲得良好的峰形，最佳的質譜響應，考察了甲酸溶液、甲酸氨-甲酸溶液分別作為水相，甲醇、乙腈分別作為有機相，試驗優(yōu)化發(fā)現(xiàn)采用甲酸氨-甲酸溶液+乙腈作為流動相，梯度洗脫，各化合物峰形最尖銳，且質譜響應最佳。

流動相起始比例為95%水相，用于稀釋轉移至分析柱的高比例有機相及中和氨水，試驗發(fā)現(xiàn)轉移過程中各藥物無不保留流出情況，梯度洗脫，逐漸增加有機相比例，各藥物依次洗脫，分離良好且峰形尖銳、對稱。優(yōu)化后1 ng/mL混合標準溶液定量離子色譜圖見圖4。

圖4 標準溶液SRM定量離子色譜圖Fig.4 Quantitative ion chromatography

2.4 樣品前處理方法優(yōu)化

孔雀石綠等4種藥物為陽離子型藥物，同時極性較弱，可以使用一定極性有機溶劑提取。為獲得最大的提取效率，試驗了甲醇、乙腈、甲醇-甲酸、甲醇-氨水、乙腈-甲酸、乙腈-氨水等提取溶劑，試驗發(fā)現(xiàn)酸化乙腈對4種藥物提取效果最好，進一步試驗發(fā)現(xiàn)1%甲酸最佳。

2.5 方法的線性范圍與檢測限

以空白樣品提取液，配制系列標準基質溶液（0.1、0.2、0.5、1、2 ng/mL，內標為 1 ng/mL）曲線進行測試，繪制標準工作曲線，各藥物線性回歸方程、相關系數(shù)（R2）、線性范圍和定量限（10倍信噪比）。

表3 孔雀石綠等4種藥物的線性回歸方程、相關系數(shù)（R2）及定量限（LOQs，S/N=10）Table 3 Regression equation correlation coefficient（R2）and limits of quantization（LOQs，S/N=10）of four drug

2.6 方法的準確度與精密度

方法的準確度和精密度通過加標回收試驗進行評價。在空白魚肉樣品中按0.5、1.0、2.0 μg/kg的水平進行標準添加，測定回收率，平行測定6份，考察方法的回收率與重現(xiàn)性，結果見表4。

2.7 實際樣品測試

應用本方法對市售20個魚樣品進行測定，其中1個樣品檢出隱色孔雀石綠，含量為0.68 μg/kg，同時檢出低于定量限的孔雀石綠及結晶紫；其他樣品各藥物均未檢出。實際樣品測定結果顯示，各藥物基線平穩(wěn)，峰形對稱，無明顯雜峰干擾，說明在線凈化效果較好。 陽性樣品SRM定量離子色譜圖見圖5。

表4 空白魚樣的加標回收率和相對標準偏差（n=6）Table 4 Spiked recoveries and relative standard deviations（RSD）（n=6）%

圖5 陽性樣品SRM定量離子色譜圖Fig.5 Quantitative ion chromatography of postive sample

3 結論

本研究利用雙柱在線凈化、HPLC-MS/MS技術，建立了一種快速、靈敏測定魚中孔雀石綠、結晶紫、隱色結晶紫、隱色孔雀石綠的方法。該方法4種藥物的定量限為0.5 μg/kg，達到較高靈敏度。雙柱在線凈化，實現(xiàn)了樣品凈化的自動化，節(jié)省了檢測成本，同時凈化效率高，凈化效果好，加快了檢測速度。本方法回收率穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，適合于魚肉樣品中孔雀石綠、結晶紫、隱色結晶紫、隱色孔雀石綠的快速測定。