布魯氏菌鞭毛研究進(jìn)展

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布魯氏菌是一種兼性胞內(nèi)病原體，能夠引發(fā)人畜共患病-布魯氏菌病，因?yàn)椴剪斒暇哂懈叨鹊膫魅拘裕軌蛲ㄟ^空氣進(jìn)入呼吸道傳播，且初始癥狀容易與流行性感冒相混淆，是潛在的生化武器，被我國列為乙類傳染病。自上世紀(jì)90年代以后，由于多種因素的影響，我國布魯氏菌病呈現(xiàn)出明顯上升的發(fā)病趨勢，流行范圍呈現(xiàn)明顯的擴(kuò)散趨勢[1]，探究布魯氏菌毒力機(jī)制，研發(fā)布魯氏菌人畜疫苗是未來的研究重點(diǎn)[2]。布魯氏菌之前被認(rèn)為無鞭毛，直到近幾年電鏡技術(shù)的發(fā)展才確定它的存在，并已有一些研究證實(shí)其有構(gòu)成布魯氏菌毒力，作為疫苗候選的潛在可能性。

布魯氏菌病發(fā)病機(jī)制主要與布魯氏菌入侵宿主細(xì)胞并在其胞內(nèi)存活和復(fù)制有關(guān)[3-4]。在布魯氏菌侵入宿主細(xì)胞并在宿主細(xì)胞內(nèi)生存繁殖的過程中，多種毒力因子相互協(xié)調(diào)發(fā)揮保護(hù)細(xì)菌免受機(jī)體免疫系統(tǒng)殺傷的作用，布魯氏菌鞭毛在其中發(fā)揮的作用值得進(jìn)一步的研究。

1 布魯氏菌鞭毛的發(fā)現(xiàn)

細(xì)菌的鞭毛是從菌體伸出的細(xì)長的絲狀物。它使細(xì)菌能更好地適應(yīng)環(huán)境，是細(xì)菌在進(jìn)化過程中長期適應(yīng)的結(jié)果。它既是一個(gè)運(yùn)動器官，又是一個(gè)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)/組裝裝置。它由3個(gè)部分組成，包括基體(Basal body)、鉤型鞘(Hook)和鞭毛絲(Flagellar filament)[5]。

關(guān)于鞭毛的研究通常建立在細(xì)菌運(yùn)動性的基礎(chǔ)上，而布魯氏菌并無運(yùn)動特征也是布魯氏菌一直以來被認(rèn)為無鞭毛的原因之一。1998年Halling發(fā)現(xiàn)牛種布氏菌含有幾種鞭毛相關(guān)蛋白同源物的開放閱讀框[6]，2002年DelVecchio和Paulsen等人的研究發(fā)現(xiàn)布魯氏菌具有趨化基因外所有鞭毛結(jié)構(gòu)基因，組成3個(gè)基因座，并與苜蓿中華根瘤菌具有廣泛的基因同源性[7-8]，這些基因位于小染色體上。

2005年D.Fretin等人一方面構(gòu)建了包含鞭毛基因fliF啟動子的質(zhì)粒，通過β-半乳糖苷酶測定法驗(yàn)證布魯氏菌侵染巨噬細(xì)胞過程中鞭毛基因fliF基因的瞬時(shí)表達(dá)；另一方面對從羊種布氏菌獲得的全細(xì)胞提取物進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析，在布魯氏菌指數(shù)增長期早期檢測到布魯氏菌鞭毛鉤蛋白fliE和鞭毛蛋白fliC的表達(dá)[9]。從這兩方面可以看出布魯氏菌鞭毛基因、蛋白質(zhì)或鞭毛器并非不表達(dá)，其表達(dá)依賴于生長期，透射電鏡下觀察其鞭毛屬單一極性鞭毛，同副溶血弧菌一樣在鞭毛表面包裹著一層鞘膜，有研究發(fā)現(xiàn)此鞭毛與布魯氏菌毒力相關(guān)，并在布魯氏菌持續(xù)感染中有不可或缺的意義[10-11]。

2 布魯氏菌鞭毛染色及鏡下觀察

作為細(xì)菌的運(yùn)動器官，鞭毛的數(shù)量、形態(tài)和它在菌體的分布位置是鑒定細(xì)菌的重要指標(biāo)，但由于它的直徑非常纖細(xì)，必須采用特殊的染色方法才能在顯微鏡下觀察到。常見的細(xì)菌鞭毛染色方法包括賴夫生染色法、西薩-基爾染色法、銀鹽染色法、柯達(dá)卡溶液染色法及負(fù)染法。需要注意的是：布魯氏菌僅在早期指數(shù)生長期才能觀察到鞭毛，并且對培養(yǎng)基的營養(yǎng)需求較高(國外研究證實(shí)在2YT培養(yǎng)基中培養(yǎng)可實(shí)現(xiàn))[12]。

根據(jù)報(bào)道，Ryu染色法可觀察到布魯氏菌鞭毛。方法如下：將10 mL 5%苯酚水溶液、2 g單寧酸和10 mL飽和硫酸鋁鉀-12水合物制成媒染劑；將結(jié)晶紫的飽和乙醇溶液(25 g 95%乙醇中的3 g)制成染色劑；之后將媒染劑與染色劑以1∶10混合并過濾得到最終的RYU著色劑；將1滴細(xì)胞培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到載玻片上，蓋上蓋玻片；5～10 min后將2滴Ryu染色劑施加到蓋玻片的邊緣通過毛細(xì)管作用流動到蓋玻片下面并與細(xì)胞懸液混合；室溫5～10 min后在相差顯微鏡下觀察細(xì)菌鞭毛[12-13]。相差顯微鏡下結(jié)果見圖1[12]。

圖1 布魯氏菌及其鞭毛相差顯微鏡結(jié)果Fig.1 Brucella and its flagella under the phase-contrast microscopy

透射電子顯微鏡(TEM)能看到光學(xué)顯微鏡下無法看清的結(jié)構(gòu)(亞顯微結(jié)構(gòu))，適合布魯氏菌鞭毛觀察，觀察方法如下：細(xì)菌在37 ℃的豐富培養(yǎng)基培養(yǎng)至OD600nm處為0.25的狀態(tài)，1 000 r/min離心20 min，得沉淀用PBS懸浮，之后應(yīng)用醋酸鈾負(fù)染法于透射電鏡下觀察。透射電鏡鏡下結(jié)果見圖2[12]。

圖2 布魯氏菌及其鞭毛電子顯微鏡結(jié)果Fig.2 Brucella and its flagella under the transmission electron microscopy

3 布魯氏菌鞭毛基因測序及其表達(dá)調(diào)控

經(jīng)基因組測序發(fā)現(xiàn)，布魯氏菌具有除趨化基因外所有鞭毛結(jié)構(gòu)基因，并被認(rèn)為屬于隱性遺傳物。不同布魯氏菌屬的幾種鞭毛基因中存在變異，將對揭示布魯氏菌遺傳進(jìn)化過程有指導(dǎo)作用[14-16]。

在2005年D.Fretin等人的研究發(fā)現(xiàn)布魯氏菌鞭毛基因在早期生長指數(shù)期可以表達(dá)，并通過透射電子顯微鏡TEM觀察到由LPS軸承護(hù)套包圍的完整極性鞭毛結(jié)構(gòu)[9]。多種基因參與布魯氏菌鞭毛生成。在2007年S.Leonard和J.Ferooz等人的研究中羊種布魯氏菌ftcR作為鞭毛的主調(diào)節(jié)因子發(fā)揮作用，是vjbR調(diào)節(jié)鞭毛系統(tǒng)的中間環(huán)節(jié)，ftcR具有雙組份響應(yīng)調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域以及DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并被編碼在羊種布魯氏菌的第一鞭毛位點(diǎn)，在ftcR失活的情況會導(dǎo)致鞭毛基因表達(dá)下降和布魯氏菌毒力受損[17]。在之后2011年J.Ferooz驗(yàn)證了fibT基因在鞭毛蛋白flic生成中的作用。而sigma因子rpoE1的突變則會引起鞭毛基因fliF,flgE,fliC,flaF和fibT的過表達(dá)，與鞭毛長絲的產(chǎn)生相關(guān)，驗(yàn)證了rpoE是一個(gè)鞭毛阻遏基因。而rpoE1的突變會增加鞭毛主調(diào)節(jié)因子ftcR的啟動子活性。這表明rpoE1上層調(diào)控ftcR[18]。鞭毛表達(dá)受一系列基因調(diào)控，具有復(fù)雜的調(diào)節(jié)機(jī)制。

4 布魯氏菌鞭毛與毒力

常規(guī)認(rèn)為鞭毛及其運(yùn)動功能可促進(jìn)細(xì)菌對于宿主細(xì)胞的黏附與侵襲，在細(xì)菌生物被膜形成過程中起重要作用，與細(xì)菌毒力因子的分泌也密切相關(guān)。有研究表明費(fèi)氏弧菌可通過鞭毛的旋轉(zhuǎn)調(diào)節(jié)外膜蛋白釋放，從而影響毒力[19]。布魯氏菌與費(fèi)氏弧菌皆為單極鞘鞭毛，有一定的參考價(jià)值。另外布魯氏菌毒力的一個(gè)重要方面是其在感染細(xì)胞內(nèi)的存活，復(fù)制和持續(xù)的能力。當(dāng)前對布魯氏菌鞭毛毒力的探索建立在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動物實(shí)驗(yàn)之上。在體外實(shí)驗(yàn)層面，D.Fretin等人構(gòu)建鞭毛基因突變體，并與野毒株共同侵襲細(xì)胞，比較其細(xì)胞侵襲及胞內(nèi)復(fù)制的能力，觀察一定時(shí)間后菌落形成單位結(jié)果顯示無明顯差別；2013年Matthieu Terwagne等人的研究顯示同樣的結(jié)果[10]。

在動物實(shí)驗(yàn)層面，D.Fretin等人研究顯示布魯氏菌鞭毛突變體在小鼠中減毒，通過構(gòu)建鞭毛基因突變體，并與親本株一起感染小鼠感染初期無明顯差別，感染后期感染突變體小鼠平均脾重顯著低于親本株感染小鼠，提示羊種布氏菌在小鼠中的持續(xù)感染需要鞭毛結(jié)構(gòu)的表達(dá)[9]。而Matthieu Terwagne等人的研究顯示過表達(dá)鞭毛蛋白fliC菌株在小鼠中減毒，同樣條件fliC缺失株增強(qiáng)了羊種16M菌株在體內(nèi)毒力的持續(xù)性。

布魯氏菌鞭毛蛋白對毒力的影響較為復(fù)雜，尚需進(jìn)一步的研究。

5 布魯氏菌鞭毛與免疫“逃避”策略

有研究表明，布魯氏菌使用被動以及主動機(jī)制來逃避先天性免疫系統(tǒng)的TLR檢測。布魯氏菌鞭毛蛋白TLR5活性的缺乏以及其對宿主細(xì)胞的合成或遞送的調(diào)節(jié)都是布魯氏菌對先天免疫系統(tǒng)的隱身策略的一部分[10]。盡管鞭毛蛋白逃避TLR5的檢測，但仍可引起胞質(zhì)模式識別受體PRRs的檢測進(jìn)而啟動免疫應(yīng)答。鞭毛蛋白引起的固有免疫可以破壞布魯氏菌進(jìn)入宿主時(shí)的“隱身”能力，在這種情況下，鞭毛蛋白可被認(rèn)為是“宿主保護(hù)因子”[20]。

實(shí)際上，布魯氏菌對于宿主免疫系統(tǒng)來說并非完全不可見，它們?nèi)匀豢梢詸z測到它們并形成TH1應(yīng)答來控制感染。然而，宿主免疫應(yīng)答不足以消除細(xì)菌，導(dǎo)致以病原體毒力和宿主抗性之間的平衡為特征的慢性感染狀態(tài)。TLR5和NLRC4/NAIP5復(fù)合物被視為目前唯一胞外/胞質(zhì)細(xì)菌鞭毛蛋白先天免疫傳感器的蛋白質(zhì)。通過逃避TLR5介導(dǎo)的檢測，布魯氏菌獲得一定程度的“隱身”。布魯氏菌fliC是第一個(gè)發(fā)現(xiàn)以NLRC4獨(dú)立方式體外誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌IL-1β的鞭毛蛋白。通過鞭毛蛋白激活先天性免疫途徑來限制體內(nèi)布魯氏菌的復(fù)制將成為應(yīng)對布魯氏菌病的一種新方法。

6 布魯氏菌鞭毛免疫原性與群體感應(yīng)

鞭毛蛋白作為革蘭氏陰性菌的主要結(jié)構(gòu)蛋白，是TLR5的配體和寡聚核酸區(qū)域(NOR)末梢感受器(NLR)家族的固有感受器。當(dāng)它通過不同方式以共價(jià)鍵與抗原結(jié)合時(shí)展現(xiàn)出強(qiáng)大的免疫原性[19]。因此，鞭毛蛋白已經(jīng)作為疫苗研制的新平臺成功應(yīng)用于各類菌株。例如幽門螺桿菌、愛德華氏菌等多種病菌[20-21]。鞭毛蛋白可作為各種細(xì)胞類型先天和適應(yīng)性免疫的有效激活劑。有研究證明布魯氏菌鞭毛蛋白有著促進(jìn)一系列先天細(xì)胞免疫類型的細(xì)胞因子產(chǎn)生的能力。2012年研究發(fā)現(xiàn)在其檢測范圍內(nèi)，5種布魯氏菌鞭毛蛋白可刺激來自S19免疫小鼠的脾細(xì)胞中顯著更高水平的IFN-γ分泌，表明其具有T細(xì)胞誘導(dǎo)活性。

細(xì)菌通過群體感應(yīng)系統(tǒng)自發(fā)產(chǎn)生、釋放一些特定的信號分子，并能感知其濃度變化，調(diào)節(jié)微生物的群體行為。雖然每種革蘭氏陰性菌所產(chǎn)生的的群體感應(yīng)機(jī)制不同，但其調(diào)控蛋白具有高度同源性，目前研究到大多數(shù)革蘭氏陰性菌都存在名為LuxI-AHL型的群體感應(yīng)系統(tǒng)，有研究證明布魯氏菌鞭毛基因作為布魯氏菌潛在毒力因子，受群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控。VjbR是LuxR家族的群體感應(yīng)調(diào)節(jié)因子，可以調(diào)節(jié)fliF和figE基因的表達(dá)[11, 22]。

7 布魯氏菌鞭毛蛋白展望

通過構(gòu)建鞭毛蛋白和保護(hù)性抗原結(jié)合后的融合蛋白，由此方法已經(jīng)產(chǎn)生許多證明有效的動物疫苗。布魯氏菌鞭毛蛋白具有一定免疫原性，已有研究證明其通過添加佐劑可作為布氏菌病疫苗候選[21, 23]，但要注意鞭毛蛋白融合蛋白的長期儲存可能導(dǎo)致形成以TLR5非依賴性方式起作用的大聚集體，類似動態(tài)光散射的方法是確保鞭毛蛋白和鞭毛蛋白融合蛋白是單體且不聚集的有效手段[24]。

目前對布魯氏菌鞭毛蛋白的研究尚處于初級階段，其出現(xiàn)的確切時(shí)條件，對布氏菌隱身策略乃至毒力的影響等方面尚無定論，而其在毒力探索及疫苗研制方面所起的作用確有研究價(jià)值，值得進(jìn)一步的研究。

利益沖突：無