兒童肺泡灌洗液肺炎支原體檢出率及基因型分析

汪小五，丁圣剛，王林定，唐振華，朱義朗，高 勇

社區(qū)獲得性肺炎中比較常見(jiàn)的病原體就是肺炎支原體(Mycoplasmapneumoniae,MP)[1]。肺炎支原體肺炎(MPP)是一種自限性疾病，但是有時(shí)會(huì)引起各種肺部疾病如支氣管炎、腦炎、壞死性肺炎，嚴(yán)重者甚至?xí)?dǎo)致死亡[2]。MP感染的流行周期為3～4年[1,3]。MPP還沒(méi)有明確的發(fā)病機(jī)制，從臨床癥狀分析可能是病原體入侵機(jī)體呼吸上皮細(xì)胞的纖毛狀上皮細(xì)胞或者是機(jī)體免疫反應(yīng)的結(jié)果[4]。P1基因具有其自然特性即高度保守性，且隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展可根據(jù)分離株中P1氨基酸序列之間的差異把其分成兩大類(lèi)型P1-Ⅰ型和P1-Ⅱ型[5]。對(duì)MP流行株的基因型進(jìn)行分析可對(duì)其發(fā)病機(jī)制和臨床診斷治療進(jìn)行探討[5]。本實(shí)驗(yàn)收集兒童的肺泡灌洗液標(biāo)本，了解合肥地區(qū)兒童MP流行株基因型的現(xiàn)狀。

1 資料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對(duì)象 選取2013年8月至2016年1月安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科兒童肺泡灌洗液標(biāo)本136例。本研究通過(guò)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核同意，研究對(duì)象同意并簽署知情同意書(shū)。-80 ℃保存樣本。

1.1.2 材料來(lái)源 MP(FH；ATCC15531)標(biāo)準(zhǔn)菌株(美國(guó)ATCC產(chǎn)品)為實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 主要試劑 MP快速培養(yǎng)試劑盒購(gòu)自珠海迪爾生物工程有限公司；細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自北京天根生化有限公司；DNA膠回收試劑盒購(gòu)自上海生物工程有限公司。

1.1.4 引物 普通PCR引物[6]為含內(nèi)切酶BamH Ⅰ酶切位點(diǎn)的上游引物為5′-TTG GAT CCA AGG GGG TGT GGG CGG A-3′；內(nèi)切酶SalⅠ酶切位點(diǎn)的下游引物為5′-TCG TCG ACG GTG GAG GAG GTG TTT C-3′。BamH Ⅰ酶和SalⅠ酶切位點(diǎn)分別為GGA TCC和GTC GAC。巢式和多重PCR引物參照文獻(xiàn)[7]由上海生物工程有限公司合成。巢式PCR-P1基因的重復(fù)序列RepMP4序列的外內(nèi)側(cè)引物分別為ADH2F/ADH2R：5′-GGC AGT GGC AGT CAA CAA ACC ACG TAT-3′/5′-GAA CTT AGC GCC AGC AAC TGC CAT-3′和內(nèi)側(cè)引物ADH3F/ADH3R：5′- GAA CCG AAG CGG CTT TGA CCG CAT-3′/5′-GTT GAC CAT GCC TGA GAA CAG TAA-3′。P1基因的重復(fù)序列RepMP2/3序列的外內(nèi)側(cè)引物分別為ADH3/MP2/3-R1：5′-CGA GTT TGC TGC TAA CGA GT-3′/5′-AGA TTG ACC TGA GCC TGA AG-3′和內(nèi)側(cè)引物MP2/3-F2/MP2/3-R2：5′-CAC AAG TGG TTC GCG TTC CT-3′/5′-GGC TGG GTG GAA TGG TCT GT-3′。多重PCR-P1基因重復(fù)序列引物為ADH4F：5′-GAC CGC ATC AAC CAC CTT TGC GTT ACG-3′/N1：5′- CCC GGT GGT GGA AGT ATT TT-3′/ 2N2C： 5′-CGA GTT TGC TGC TAA CGA GT-3′/MP2/3-F3： 5′-TCG ACC AAG CCA ACC TCC AG-3′/ R3-1 ：5′-TTG GAA TCG GAC CCA CTT CG-3′/R3-2 ： 5′- CGA CGT TGT GTT TGT GCC AC-3′ /R3-2V 5′-CGG TAT AGC TAA TTT GGT AC-3′ 。

1.2 MP陽(yáng)性標(biāo)本的篩查和基因分型

1.2.1 肺泡灌洗液的收集 行纖維支氣管鏡術(shù)，取液體標(biāo)本在1 h內(nèi)處理標(biāo)本，保存于-80 ℃待實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 MP(FH；ATCC15531)標(biāo)準(zhǔn)菌株培養(yǎng) 嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)室購(gòu)買(mǎi)的MP快速培養(yǎng)試劑盒說(shuō)明書(shū)中的步驟操作。

1.2.3 普通PCR法篩查MP陽(yáng)性標(biāo)本 cDNA提?。?80 ℃取出136份肺泡灌洗液標(biāo)本和MP(FH；ATCC15531)標(biāo)準(zhǔn)菌株轉(zhuǎn)陽(yáng)培養(yǎng)液按細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA。普通PCR技術(shù)篩查MP陽(yáng)性標(biāo)本。

1.2.4 MP陽(yáng)性標(biāo)本的基因分型 P1基因的重復(fù)序列RepMP4序列和RepMP2/3序列的外側(cè)引物和內(nèi)側(cè)引物以及試劑盒提取的基因組DNA模板按照巢式PCR擴(kuò)增體系進(jìn)行擴(kuò)增。外側(cè)擴(kuò)增體系為50 μL總體積：RepMP4序列退火溫度為75 ℃ 30 s；RepMP2/3序列退火溫度為61 ℃ 30 s。內(nèi)側(cè)擴(kuò)增體系為50 μL總體積：RepMP4序列退火溫度為73 ℃ 30 s；RepMP2/3序列退火溫度為65 ℃ 30 s。多重PCR進(jìn)行分型擴(kuò)增體系為50 μL總體積：RepMP4序列退火溫度為70 ℃ 30 s，DNA模板為巢式PCR RepMP4序列擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋1 000倍；RepMP2/3序列退火溫度為70 ℃ 30 s，DNA模板為巢式PCR RepMP4序列擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋1 000倍。

1.2.5 MP陽(yáng)性標(biāo)本擴(kuò)增條帶確定 1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證及基因測(cè)序。

2 結(jié)果

2.1 MP陽(yáng)性標(biāo)本的篩查 普通PCR法對(duì)從肺泡灌洗液中提取的基因組DNA中進(jìn)行擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳后顯示有513 bp目的條帶(見(jiàn)圖1)。136例標(biāo)本中檢測(cè)出52例MP陽(yáng)性標(biāo)本，陽(yáng)性率為38.2%。

2.2 MP陽(yáng)性標(biāo)本的基因分型 1%瓊脂糖凝膠電泳分析MP陽(yáng)性標(biāo)本巢式多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)：RepMP4重復(fù)序列擴(kuò)增出了大約343 bp條帶；RepMP2/3重復(fù)序列擴(kuò)增出了大約394 bp 條帶(見(jiàn)圖2)。FH標(biāo)準(zhǔn)菌株則在RepMP4重復(fù)序列擴(kuò)增出了大約560 bp條帶；RepMP2/3重復(fù)序列擴(kuò)增出了大約617 bp 條帶(見(jiàn)圖3)?；蛐蛄袦y(cè)序匹對(duì)后正確。

3 討論

肺炎是兒童和青少年常見(jiàn)的呼吸道感染引起的一種疾病，往往發(fā)病都考慮為細(xì)菌或者病毒感染引起，會(huì)常常忽略支原體的感染而延誤治療[8]?？焖贉?zhǔn)確的檢測(cè)方法非常重要。MP檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)是培養(yǎng)法，但是其培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，市場(chǎng)快速培養(yǎng)試劑盒檢出率又低[9]。核酸檢測(cè)方法是近年來(lái)比較流行的檢測(cè)方法，可直接從呼吸道標(biāo)本中檢測(cè)出病原體特殊的DNA片段[8]。本實(shí)驗(yàn)收集了行纖維支氣管鏡術(shù)兒童肺泡灌洗液標(biāo)本進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增檢測(cè)其感染MP的情況，發(fā)現(xiàn)136例疑似感染MP標(biāo)本中有52例是擴(kuò)增陽(yáng)性結(jié)果，其感染率為52.8%。該數(shù)據(jù)可以反映合肥地區(qū)兒童在近期感染MP情況。

MP基因型依賴(lài)于P1基因的快速循環(huán)PCR(Rapid-Cycle PCR)和PCR-限制性長(zhǎng)度多態(tài)性分析(RFLP)方法[10]。本實(shí)驗(yàn)室采用巢式多重PCR技術(shù)對(duì)52例陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行了分析：均擴(kuò)增出了P1-Ⅰ

型的目的條帶。對(duì)照組擴(kuò)增出P1-Ⅱ型的目的條帶。該數(shù)據(jù)可以反映合肥地區(qū)兒童感染MP流行基因型均為P1-Ⅰ型。

王楠等[5]檢測(cè)西安地區(qū)兒童感染MP流行基因型均為P1-Ⅰ型。KENRI等[7]采用的巢式多重PCR的方法將1995-2005年十年間的MP菌株進(jìn)行了分型發(fā)現(xiàn)P1-Ⅰ型和P1-II型交替存在并發(fā)現(xiàn)了變異株。本實(shí)驗(yàn)未能發(fā)現(xiàn)亞型，可能是由于樣本量的局限。

收集來(lái)的136份肺泡灌洗液標(biāo)本中有52份是MP陽(yáng)性標(biāo)本，即合肥地區(qū)兒童MP的感染率為38.2%，而且全部為P1-Ⅰ型。該調(diào)查結(jié)果初步說(shuō)明合肥地區(qū)兒童感染MP主要為P1-Ⅰ型。雖然樣本量有限，后期還會(huì)繼續(xù)擴(kuò)大樣本量，來(lái)補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的不足，但是該結(jié)果對(duì)臨床治療還是有一定的指導(dǎo)意義。