正交試驗(yàn)比較金銀花中綠原酸、異綠原酸A的提取工藝

湯 潔，程慶兵，付恩桃，劉修樹，范高福，方麗波

金銀花即忍冬的干燥花蕾，味甘，性寒，具有清熱解毒、疏風(fēng)散熱之功效。金銀花的活性成分主要有黃酮類、有機(jī)酸類、揮發(fā)油、三萜類，其中以有機(jī)酸類的綠原酸、異綠原酸生物活性顯著，具有抗菌(煙曲霉、大腸埃希菌)[1-2]、抗氧化、抗炎[3]、抗病毒，參與人體血小板凝集和凝血因子的生成等作用[4]。因此，有機(jī)酸類的活性成分一直是衡量金銀花提取效率優(yōu)劣的重要指標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[5-7]，優(yōu)化了一個(gè)簡(jiǎn)便的高效液相色譜法(HPLC)同時(shí)檢測(cè)金銀花中綠原酸及異綠原酸A含量的方法，并采用正交設(shè)計(jì)的方法探討金銀花提取工藝的最佳條件。王玥等[8-9]運(yùn)用HPLC法已驗(yàn)證綠原酸作為單一指標(biāo)回流法顯著優(yōu)于超聲法，在這基礎(chǔ)上，我們將超聲波與傳統(tǒng)醇回流提取聯(lián)用，一方面利用超聲波技術(shù)的空化作用，能有效縮短整個(gè)提取工藝的時(shí)間，提高提取效率，另一方面擬解決回流法彌補(bǔ)超聲波提取綠原酸量低的問題。現(xiàn)作報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 藥品級(jí)主要試劑 金銀花藥材購(gòu)自亳州市永剛飲片廠有限公司；綠原酸對(duì)照品(批號(hào)110753-201716)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，異綠原酸A對(duì)照品(批號(hào)B21539，純度≥98%)購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；甲醇、乙腈為色譜純，磷酸、95%乙醇為分析純，水為屈臣氏飲用水。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 戴安U3000型高效液相色譜儀(包括HPG-3400SD泵，自動(dòng)進(jìn)樣器，DAD-3000型檢測(cè)器，Chromeleon 7.0 工作站)；Mettler Toledo XPE 205型分析天平(0.01 mg)，JP300G型超聲波提取機(jī)組，F(xiàn)XB系列小型中藥粉碎機(jī)，RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水真空泵。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 綠原酸、異綠原酸A的測(cè)定

1.2.1.1 色譜條件 Waters SunFire C18色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為0.4%磷酸溶液∶乙腈為87∶13，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)326 nm，柱溫40 ℃。

1.2.1.2 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取綠原酸對(duì)照品10.390 mg、異綠原酸A 對(duì)照品9.995 mg，分別置25 mL 棕色容量瓶中，加50 %甲醇超聲溶解稀釋至刻度，制成質(zhì)量濃度分別為415.60、399.80 μg/mL的綠原酸、異綠原酸A對(duì)照品的儲(chǔ)備液。分別精密移取綠原酸、異綠原酸A各2 mL定容于25 mL的棕色容量瓶中，制成每1 mL含綠原酸33.248 μg、異綠原酸A 31.984 μg的混合對(duì)照品溶液。

1.2.1.3 供試品溶液的制備 精密稱定過五號(hào)篩的金銀花細(xì)粉5.0 g，加15倍量乙醇[8]超聲、回流提取，抽濾，減壓濃縮至浸膏，用50%甲醇溶解并定容至50 mL，搖勻，4 000 r/min離心12 min，取上清液1 mL，用50%甲醇定容至25 mL后，再取3 mL定容至10 mL的棕色容量瓶中備用。

1.2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別精密吸取混合對(duì)照品溶液2、4、5、8、10、12 μL按色譜條件進(jìn)樣，以峰面積Y為縱坐標(biāo)，以進(jìn)樣量X(μg)為橫坐標(biāo)，計(jì)算綠原酸、異綠原酸A線性回歸方程。

1.2.1.5 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液10 μL，按色譜條件連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算綠原酸、異綠原酸A色譜峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

1.2.1.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱定6份5.0 g金銀花藥材細(xì)粉，60%乙醇經(jīng)200 W超聲15 min處理，0.5 h回流提取1次，按1.2.1.3項(xiàng)制備供試品溶液，記錄峰面積，計(jì)算RSD。

1.2.1.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 分別于0、2、4、8、12 h，精密吸取同一供試品溶液進(jìn)樣，計(jì)算色譜峰面積的RSD。

1.2.1.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取已知含量的藥材粉末約50 mg，60%乙醇經(jīng)200 W超聲15 min處理，0.5 h回流提取1次，按1.2.1.3項(xiàng)制備供試品溶液，精密加入高、中、低3個(gè)不同濃度的對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，每個(gè)濃度各做3份，計(jì)算各自的含量。

1.2.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化金銀花最佳提取方法[8-10]精密稱定金銀花細(xì)粉(過五號(hào)篩)5.0 g，選用 L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)，因素與水平見表1。藥材加15倍量乙醇經(jīng)超聲處理1次，回流提取1次，抽濾，減壓濃縮至浸膏，按1.2.1.3項(xiàng)制備供試品。

表1 因素水平

2 結(jié)果

2.1 綠原酸、異綠原酸A的測(cè)定

2.1.1 色譜條件 在1.2.1.1項(xiàng)下測(cè)得混合對(duì)照品和供試品溶液分離度良好，色譜圖見圖1。

2.1.2 線性關(guān)系 綠原酸在0.066 5～0.399 0 μg，異綠原酸A在0.064 0～0.383 8 μg的質(zhì)量范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。線性回歸方程分別是，綠原酸：Y=34.085 84X+0.229 7(r=0.999 91)，異綠原酸A：Y=40.246 95X+0.206 73(r=0.999 12)。

2.1.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 精密度：計(jì)算得綠原酸、異綠原酸A的RSD分別為0.32%、0.40%。表明儀器精密度良好。重復(fù)性：綠原酸、異綠原酸A的RSD分別為1.05%、1.17%。表明該方法的重復(fù)性良好。穩(wěn)定性：綠原酸、異綠原酸A的RSD分別為0.45%，0.73%。表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。加樣回收率實(shí)驗(yàn)：計(jì)算得到綠原酸、異綠原酸A 的平均回收率分別是99.63%、100.18%，RSD分別為1.76%、1.89%(見表2)。

2.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化金銀花最佳提取方法 綠原酸、異綠原酸A的提取結(jié)果：分別吸取正交試驗(yàn)條件下的供試品溶液按1.2.1.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，依法測(cè)定綠原酸、異綠原酸A的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行直觀分析結(jié)果見表3，方差分析見表4～5。

表2 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

以綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為指標(biāo)進(jìn)行直觀分析(見表3)，影響因素的順序是A>D>B>C，即乙醇濃度>超聲時(shí)間>回流時(shí)間>超聲功率。最佳提取工藝為A1B2C3D3，即60%乙醇超聲(功率500 W)45 min，再回流提取1 h。以偏差平方和最小的因素為誤差項(xiàng)進(jìn)行方差分析(C因素)(見表4)。結(jié)果表明A因素有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，B、D因素?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

以異綠原酸A質(zhì)量分?jǐn)?shù)為指標(biāo)進(jìn)行直觀分析，影響因素的順序是C>A>B>D，即超聲功率>乙醇濃度>回流時(shí)間>超聲時(shí)間。最佳提取工藝為A1B2C3D1，即60%乙醇超聲(功率500 W)15 min，再回流提取1 h(見表3)。以偏差平方和最小的因素為誤差項(xiàng)進(jìn)行方差分析(D因素)(見表5)。結(jié)果表明A、B、C因素均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜合評(píng)估金銀花提取效果，以綠原酸和異綠原酸A的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為指標(biāo)，權(quán)重系數(shù)各為50進(jìn)行計(jì)算，得“綜合評(píng)分=綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)/27.24×50+異綠原酸A質(zhì)量分?jǐn)?shù)/17.43×50”。以綜合評(píng)分為指標(biāo)進(jìn)行直觀分析，影響因素的順序是A>C>B>D，結(jié)果表明A、B、C因素?zé)o顯著性差異。即乙醇濃度>超聲功率>回流時(shí)間>超聲時(shí)間。最佳提取工藝為A1B2C3D3，即60%乙醇超聲(功率500 W)45 min，再回流提取1 h(見表3)。以偏差平方和最小的因素為誤差項(xiàng)進(jìn)行方差分析(D因素)，結(jié)果表明A、B、C因素差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表6)。

表3 正交試驗(yàn)安排及結(jié)果

表4 綠原酸方差分析

表5 異綠原酸A方差分析

表6 綠原酸、異綠原酸A方差分析

3 討論

本研究建立了HPLC同時(shí)測(cè)定金銀花中綠原酸和異綠原酸A的方法，該方法快捷、簡(jiǎn)便、穩(wěn)定。選擇流動(dòng)相為0.4%磷酸溶液∶乙腈=87∶13的等度洗脫，波長(zhǎng)為326 nm，檢測(cè)的綠原酸和異綠原酸A的峰響應(yīng)均較高，在22 min內(nèi)可以完成出峰，且各峰間的分離度符合要求，特異性顯著。

通過分析正交試驗(yàn)表4～6的結(jié)果分析，單以綠原酸為指標(biāo)，最佳提取工藝是60%乙醇超聲(功率500 W)45 min，再回流提取1 h；且60%的乙醇提取(P<0.05)。以綠原酸、異綠原酸A的綜合評(píng)分為指標(biāo)，最佳提取工藝是60%乙醇超聲(功率500 W)45 min，再回流提取1 h。該方法采用超聲輔助醇提，在實(shí)際生產(chǎn)中可取消藥材浸泡的環(huán)節(jié)，縮短提取時(shí)間，此種方法經(jīng)濟(jì)、快捷，提取效率高。原因是超聲波提取產(chǎn)生的空化作用可以加快固液之間的傳質(zhì)，加速藥材中有效成分的浸出。

金銀花提取工藝中綠原酸和異綠原酸A的提取效率不太高的原因可能與金銀花藥材的產(chǎn)地有關(guān)，即不同產(chǎn)地的金銀花藥材其綠原酸、異綠原酸A的含量存在差異；藥材在常壓回流水浴的溫度達(dá)89 ℃，較高的溫度可能使綠原酸與異綠原酸A的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，后期可采用減壓回流的提取方式使60%乙醇提取溶劑的沸點(diǎn)降低，增加回流的效率。