海馬水解蛋白的氨基酸組成與抗氧化能力的關(guān)系

葛曉鳴 顧 偉 徐永健

(寧波大學(xué)海洋學(xué)院,浙江 寧波 315211)

自由基是指帶有不成對電子或獨立存在的化學(xué)性質(zhì)及其活潑的原子或者原子團。 細胞內(nèi)的自由基會與脂類、蛋白質(zhì)等生物大分子反應(yīng),引發(fā)細胞損害,從而引起生物體衰老和疾病[1]。 抗氧化劑是指任何能夠延緩和阻止氧化反應(yīng)發(fā)生的一類物質(zhì)[2-3],包括人工合成抗氧化劑及天然抗氧化劑兩類,丁基羥基茴香醚(butyl hydroxy anisd, BHA)、 二 丁 基 羥 基 甲 苯(butylated hydroxytoluene,BHT)、特丁基對苯二酚(tert-butylhydroquinone,TBHQ)等人工合成抗氧化劑已被證實作為食品添加劑會產(chǎn)生食品安全問題,并已受到嚴格控制。 因此,尋找天然抗氧化劑具有重要意義。

據(jù)報道,已從天然材料中分離出抗氧化劑——抗氧化多肽,如豆類蛋白[4-5]、魚皮膠原蛋白[6]、油料種子蛋白[7]和水稻胚乳蛋白[8]等,但這些不同來源的抗氧化多肽清除自由基的能力是不同的,與多肽的分子量、氨基酸組成及氨基酸排列順序密切相關(guān)[9]。 從以上多肽的組成氨基酸看,這些抗氧化多肽基本上包含His、Pro、Phe、Met、Tyr、Glu、Leu、Ile、Val、Arg、Asp 及Lys 等12 種氨基酸中的一個或多個氨基酸殘基[10-12],這些氨基酸可劃分為極性氨基酸、疏水性氨基酸和芳香族氨基酸三大類,均對自由基的清除能力有重要作用[8]。 但有關(guān)氨基酸組成與自由基清除能力之間內(nèi)在相關(guān)關(guān)系的研究尚鮮見報道。

海馬(Hippocampus)是中國傳統(tǒng)藥材之一,粗蛋白含量高達67.90%～73.56%[13-14]。 目前,對海馬蛋白高效開發(fā)和利用的研究報道較少,其中Jiang 等[14]、袁學(xué)會等[15]和Sanaye 等[16]都曾用蛋白酶水解海馬,并測定酶解產(chǎn)物的清除自由基能力,但有關(guān)產(chǎn)物多肽清除自由基的能力與氨基酸之間的關(guān)系未涉及。 本研究通過對海馬的酶解蛋白進行分離純化,分析其抗氧化能力,并利用回歸分析進一步探討抗氧化能力與氨基酸組成間的關(guān)系,以期為海馬蛋白的高效開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大海馬(Hippocampus kuda Bleeker)為1 齡人工養(yǎng)殖成體,全長15.73±1.86 cm、濕體重12.08±3.14 g,由寧波甬禾生物科技有限公司特種水產(chǎn)養(yǎng)殖基地提供。

堿 性 蛋 白 酶 ( EC3.4.21.14 )、 胰 蛋 白 酶(EC3.4.21.4)、超濾膜(US200/1812、US100/1812、US50/1812、 US25/1812)購自北京索萊寶科技有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)、氨基酸標準品(A9781-5ML)、異硫氰酸苯酯(PITC)、 三乙胺、乙腈等購自美國Sigma 公司;其他試劑均購自上海國藥集團有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

FD-1A-50 真空冷凍干燥機,北京博醫(yī)康有限公司;SQW-6DI 粉碎機,溫嶺大德藥機公司;AS200 震篩機,美國Retsch 公司;L-530R 低速冷凍離心機,長沙湘儀有限公司;Speed 型超臨界萃取儀,美國ASI 公司;LNG002 實驗室超濾膜分離設(shè)備,上海朗極膜分離設(shè)備工程有限公司;LC-20A 高效液相色譜儀,日本島津公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 海馬蛋白酶解液的制備 將已冷凍干燥的脫脂海馬粉碎處理,過60 目篩即得海馬粉。 根據(jù)姜展志[17]的方法,采用超臨界二氧化碳流體萃取方法(SFE-CO2)對海馬粉脫脂,得脫脂海馬粉,然后取100 g 脫脂海馬粉,通過酶解脫脂海馬粉制得海馬蛋白酶解液(記作PH)。

1.3.2 海馬酶解液的超濾處理 參照You 等[18]的方法。 選用截流分子量(molecular weight cutoff,MWCO)分別為20、10、5、2.5 kDa 的超濾膜,并控制超濾參數(shù)(工作壓力≤15 bar,清洗壓力≤0.6 MPa,清洗時間每次1.5～2 h),分別收集不同區(qū)間段的多肽,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮并冷凍干燥后,-20℃保存?zhèn)溆谩?按照公式計算多肽回收率:

1.3.3 海馬酶解液多肽抗氧化能力的測定 將上述蛋白酶解液及各酶解多肽的濃度配置為1.5 mg·mL-1,備用。

1)DPPH 自由基(DPPH·)清除率的測定[19]:取樣品0.5 mL,加入1.0 mL 4×10-5mol·L-1DPPH 溶液混勻,避光反應(yīng),以空白管調(diào)零,室溫下避光反應(yīng)30 min,測定波長517 nm 處吸光度值A(chǔ)i,同時以無水乙醇為空白對照組(Ac)。 按照公式計算DPPH·清除率:

3)鐵離子(Fe3+)還原力的測定[18,21]:取2 mL 不同濃度的樣品,分別加入0.2 mol·L-1磷酸緩沖液(pH值6.6)2 mL、質(zhì)量分數(shù)為1%的鐵氰化鉀溶液2 mL,混勻后50℃水浴保溫20 min,再加入質(zhì)量分數(shù)為10%的三氯乙酸溶液2 mL,震蕩混勻后,3 000 r·min-1離心5 min,取上清液2 mL,然后加入2 mL 蒸餾水和0.4 mL 質(zhì)量分數(shù)為0.1%的三氯化鐵溶液,混勻后50℃水浴保溫10 min;溶液由黃色變?yōu)樗{色,在波長700 nm外測定其吸光度。 以蒸餾水代替樣品作為空白對照。

1.3.4 海馬酶解多肽氨基酸組成分析 將上述各多肽樣送至上海微譜化工技術(shù)服務(wù)有限公司作氨基酸組成分析。 參照GB/T 5009.124-2003[22]的方法,樣品經(jīng)酸水解和異硫氰酸苯脂(phenyl isothiocyanate,PITC)衍生化后,將衍生化的氨基酸衍生物通過高效液相色譜儀分離檢測。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析采用Microsoft Excel 2013 軟件和SPSS 22.0,以95%為置信區(qū)間;圖形繪制采用Origin V7.5軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 海馬酶解多肽組分的回收率與抗氧化能力分析

圖1 不同海馬多肽組分的回收率Fig.1 Recovery of different hippocampal peptide components

試驗所得脫脂海馬粉總量為100±0.43 g,由圖1可知,回收的多肽總量為脫脂海馬粉總量的85.87%,為海馬粉的60.91%。 以水解度(DH%)為指標,測得脫脂海馬的水解度為14.41%±0.16%。 海馬酶解液經(jīng)超濾處理后分離得到5 種不同分子量海馬酶解多肽:PH-Ⅰ(＞20 kDa)、PH-Ⅱ(10 ～20 kDa)、PH-Ⅲ(5 ～10 kDa)、PH-Ⅳ(2.5 ～5 kDa)和PH-Ⅴ(＜2.5 kDa),各海馬多肽組分的回收率表現(xiàn)出較大差異,PH-Ⅰ、PH-Ⅳ和PH-Ⅴ回收率較高均超過了10%。 就DPPH·、和Fe3+還原力來說,除PH-Ⅱ與PH-Ⅳ的回收率無差異外,其他幾個組分之間均表現(xiàn)出顯著性差異(P＜0.05)(圖2)。 其中,PH-Ⅴ的抗氧化能力最強,其對DPPH·清除率為34.2%±0.1%,清除能力為29.2%±0.1%,Fe3+還原力為0.28±0.005,顯著高于其他4 組分(P＜0.05);其次為PH-Ⅲ,該組成的抗氧化能力略弱于PH-Ⅴ,但顯著強于另外3 個組分;PH-Ⅰ的抗氧化能力最低。

2.2 海馬酶解液多肽組分氨基酸的組成分析

圖2 海馬多肽組分的抗氧化能力分析Fig.2 Analysis of antioxidant capacity of hippocampal Peptide components

表1 海馬酶解多肽的氨基酸組成成分Table 1 Amino acid compositions of hippocampal enzymatic peptides /(g·100g-1)

前期預(yù)試驗結(jié)果表明,海馬5 種多肽組分中各類氨基酸的所占比例與海馬多肽中各類氨基酸占多肽總量的比例相當,故本試驗用多肽各組分中各類氨基酸所占比例的平均值表示多肽中各類氨基酸的占比(含量)。 由表1 可知,海馬多肽含有豐富的Gly、Ala 和Pro 等組分,但His、Met 和Tyr 含量較低。 由表2 可知,從3 類氨基酸的組成看,海馬多肽組分中疏水性氨基酸含量為19.2%,親水性氨基酸含量為32.61%;極性氨基酸含量為21.33%,非極性氨基酸含量為30.47%;脂肪族氨基酸含量為34.88%,芳香族氨基酸含量為16.92%。 與其他組分相比,PH-Ⅰ中非極性氨基酸含量(32.55%)和芳香族氨基酸含量(19.02%)最高,極性氨基酸含量(19.21%)和脂肪族氨基酸含量(32.74%) 最低; PH-Ⅱ中親水性氨基酸含量(33.87%)和極性氨基酸含量(23.32%)最高,非極性氨基酸含量(28.90%)最低;PH-Ⅲ中疏水性氨基酸、非極性氨基酸和芳香族氨基酸含量高于PH-Ⅱ、PH-Ⅳ;PH-Ⅱ和PH-Ⅳ中疏水性氨基酸、親水性氨基酸、非極性氨基酸及芳香族氨基酸含量相近;PH-Ⅴ中疏水性氨基酸含量(21.39%)和脂肪族氨基酸含量(37.04%)最高,且高于PH-Ⅳ,但親水性氨基酸和芳香族氨基酸含量最低。

表2 不同海馬酶解多肽組分氨基酸的分類與含量Table 2 Classification and content of amino acids in different hippocampal enzymatic peptide components /%

2.3 海馬多肽組分自由基清除能力與氨基酸組成間的關(guān)系

2.3.1 按疏水性氨基酸與親水性氨基酸分類 各海馬多肽的疏水性氨基酸(X1)和親水性氨基酸(X2)含量,海馬多肽各組分分子量(M)與對應(yīng)的自由基清除能力間的關(guān)系,經(jīng)回歸分析其回歸方程如下:

圖3 X1、X2 及M 對海馬多肽組分抗氧化能力標準化系數(shù)的影響Fig.3 Effect of X1, X2and M on the standardized coefficient of antioxidat capacity of hippocampal polypeptide components

由回歸方程(1)～(3)可知,疏水性氨基酸和親水性氨基酸與DPPH·清除能力、清除能力和Fe3+還原力具有較強的相關(guān)性,經(jīng)檢驗,回歸方程差異極顯著。 綜合圖3 可知,疏水性氨基酸在DPPH·、Fe3+還原力在疏水性氨基酸上的標準化系數(shù)分別為0.403、0.422,略高于(0.335),表明疏水性氨基酸對DPPH·、Fe3+的清除起到?jīng)Q定性的作用。 與親水性氨基酸在DPPH·(0.03)、清除能力(-0.058)和Fe3+還原力(0.045)的標準化系數(shù)相比,優(yōu)勢明顯。

2.3.2 按極性氨基酸和非極性氨基酸分類 各海馬多肽組分的極性氨基酸(Y1)和非有性氨基酸(Y2)含量與對應(yīng)的自由基清除能力間的關(guān)系,經(jīng)回歸分析,回歸方程如下:

由回歸方程(4)～(6)可知,極性氨基酸和非極性氨基酸在DPPH·清除方面極顯著相關(guān),對多肽組分的抗氧化能力都有著重要的作用。 綜合圖4 可知,極性氨基酸和非極性氨基酸的標準化系數(shù)相似且均為正相關(guān),表明極性氨基酸和非極性氨基酸可通過協(xié)同作用來增強多肽清除自由基的有效濃度,在DPPH·上的標準化系數(shù)分別為0.719、0.829,在上為0.683、0.835,在Fe3+還原力上標準化系數(shù)為0.741、0.851。對標準化系數(shù)與相應(yīng)的氨基酸含量作量化處理分析:每個單位的極性氨基酸對DPPH·和Fe3+的清除能力分別是非極性氨基酸的1.23、1.16 和1.24 倍。

圖4 Y1、Y2 及M 對海馬多肽組分抗氧化能力標準化系數(shù)的影響Fig.4 Effect of Y1, Y2 and M on the standardized coefficient of antioxidant capacity of hippocampal polypeptide components

2.3.3 按脂肪族氨基酸和芳香族氨基酸分類 各海馬多肽的脂肪族氨基酸(Z1)和芳香族氨基酸(Z2)含量與對應(yīng)的自由基清除能力間的關(guān)系,經(jīng)回歸分析,回歸方程如下:

由回歸方程(7)～(9)可知,脂肪族氨基酸和芳香族氨基酸表現(xiàn)出較好的協(xié)同作用。 脂肪族氨基酸和芳香族氨基酸在DPPH·清除力、清除力和Fe3+還原力上的標準化系數(shù)分別為1.017、0.958、1.042,1.030,1.051、0.990。 綜合圖5 可知,經(jīng)量化處理可得,每個單位的芳香族氨基酸在DPPH·、和Fe3+還原力的抗氧化能力分別是脂肪族氨基酸的1.96 倍、2.10 倍和1.95 倍,此外,芳香族氨基酸對的清除效果要好于DPPH·和Fe3+還原力。

2.4 海馬多肽組分分子量與抗氧化能力間的關(guān)系

根據(jù)回歸方程(1)～(9)和圖3～5 可知,海馬多肽組分的分子量與其抗氧化能力間存在著明顯的負相關(guān)關(guān)系。 由表2 可知,PH-Ⅰ(＞20 kDa)的芳香族氨基酸含量最高(19.02%), 疏水性氨基酸含量為(19.66%),非極性氨基酸含量為(32.55%),但PH-Ⅰ的抗氧化能力是海馬多肽組分中最弱的;PH-Ⅴ(＜2.5 kDa)的分子質(zhì)量最小,但抗氧化效果最好。

圖5 Z1、Z2 及M 海馬多肽組分對抗氧化能力的標準化系數(shù)的影響Fig.5 Effect of Z1, Z2 and M on the standardized coefficient of antioxidat capacity of hippocampal polypeptide components

3 討論

本試驗通過超濾法實現(xiàn)了海馬蛋白酶解液中多肽的回收,回收率高達60.91%,接近于脫脂海馬粗蛋白含量[13-14]。 多肽分離純化的方法很多,如色譜柱、高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)等,這些方法均是根據(jù)多肽的理化性質(zhì)分離各多肽組分的,但海馬蛋白酶解產(chǎn)物的理化性質(zhì)和成分較為復(fù)雜,會影響HPLC 分離純化海馬中多肽時的效率和生產(chǎn)率[23-24],且費時費力,不利于規(guī)?；a(chǎn)。而超濾法能夠大規(guī)模處理樣品,可獲得不同分子量的多肽,且具有較高的回收率[25]。 本研究中,100 g 脫脂海馬粉獲得60.91 g 干燥海馬多肽組分,約占脫脂海馬粉總量的85.87%,因此超濾法較適用于分離海馬酶解液中的多肽。

多肽的分子量、氨基酸的組成和順序是影響多肽的抗氧化能力的重要因素[9]。 本試驗結(jié)果表明,多肽分子量與其抗氧化能力間存在明顯負相關(guān)關(guān)系,如在5 個多肽組分中, PH-Ⅴ的抗氧化能力最強, PH-Ⅰ的抗氧化能力最弱。 研究表明,分子量小于3 kDa 的多肽具有較高的抗氧化能力[26],PH-Ⅴ的抗氧化能力強也證實了分子量與抗氧化能力密切相關(guān)。 據(jù)報道,僅包含5～16 氨基酸殘基(約450～1 360 Da)的抗氧化肽更容易通過小腸粘膜與自由基反應(yīng)[27],故PH-Ⅴ還需被進一步分離,以便獲得更好的抗氧化效果。 此外,多肽組分PH-Ⅳ的抗氧化能力不如PH-Ⅲ,表明多肽的抗氧化性能可能還受其他因素的影響。

通?？寡趸牡腘-端具有疏水性氨基酸殘基[27-28](如Val、Ile 和Leu 等),或是序列中含有His或Tyr。 黃湛媛等[29]發(fā)現(xiàn)Gly-Asn-Gly-Leu-Pro 的結(jié)構(gòu)序列對自由基清除具有重要影響。 本研究中,海馬酶解多肽PH-V 中的Tyr、Met、Phe 含量要高于其他組分,相應(yīng)地其抗氧化能力也較強,與前人研究結(jié)果一致。 這可能是由于疏水性氨基酸作為氫供體,與其他氨基酸相互作用來增強多肽的疏水性質(zhì),進而增強了抗氧化能力[27],也可能是疏水性氨基酸更容易與金屬離子發(fā)生螯合作用,或作為供氫體與自由基發(fā)生反應(yīng)或降低氧化速率來增強多肽抗氧化能力[30]。

極性氨基酸可以通過側(cè)鏈的螯合作用抑制自由基的氧化反應(yīng)[31]。 在本研究中,海馬多肽組分PH-Ⅴ表現(xiàn)出更強的抗氧化能力,也可能與其有較高的極性氨基酸含量有關(guān)(如Lys、Arg 含量遠高于其他組分),相對的PH-Ⅳ中極性氨基酸含量較低。 極性氨基酸的還原力強于非極性氨基酸,且其可與非極性氨基酸作用,以提高抗氧化能力[31-34],徐力等[35]從玉米蛋白中分離所得抗氧化肽中極性氨基酸的還原力為非極性氨基酸的1.24 倍。 本研究中,海馬多肽組分的每個單位極性氨基酸對DPPH·清除率、清除率和Fe3+還原力能力分別為非極性氨基酸的1.23、1.16 和1.24 倍。

芳香族氨基酸抗氧化能力歸因于氨基酸上的咪唑環(huán),因為咪唑環(huán)具有供氫和捕捉自由基的能力。 這類氨基酸通過與其他氨基酸相互作用,提高其疏水能力以增強多肽的抗氧化能力[27]。 脂肪族氨基酸和芳香族氨基酸對自由基的清除能力也表現(xiàn)出很強的相關(guān)性,且芳香族氨基酸含量通常能決定多肽清除自由基的能力[36-37]。 本試驗結(jié)果表明,海馬多肽組分中每單位的芳香族氨基酸清除自由基的能力是脂肪族氨基酸的2 倍(圖5)。 此外,芳香族氨基酸具有共振結(jié)構(gòu),能夠保持多肽抗氧化能力的穩(wěn)定性[12]。 本研究中,相比極性氨基酸和疏水性氨基酸,芳香族氨基酸清除率(1.030)高于Fe3+還原力(0.990)、DPPH·(0.958)清除率。

4 結(jié)論

在海馬蛋白質(zhì)經(jīng)堿性蛋白酶和胰蛋白酶水解后得到的酶解多肽組分中,PH-Ⅴ擁有最強的抗氧化能力,是一類有開發(fā)價值的抗氧化多肽,且在酶解液中的含量較高。 PH-Ⅴ表現(xiàn)出較強的抗氧化能力, DPPH·清除率為34.2%±0.1%,清除率為29.2%±0.1%,Fe3+還原力為0.28%±0.005%,這與其疏水性氨基酸、極性氨基酸和芳香族氨基酸的組成含量較高有關(guān),其相對的分子量較小也是原因之一。 若PH-Ⅴ進一步分離純化,很可能得到抗氧化性能更好的組分,且可進一步提高海馬蛋白質(zhì)的利用價值。