不同耐濕基因型芝麻響應(yīng)濕害脅迫的生理指標(biāo)變化的研究

劉愛麗 王林海 黎冬華 周 瑢 江詩(shī)洋 張秀榮

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所/農(nóng)業(yè)部油料作物生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 武漢 430062)

芝麻(Sesamum indicum L.)是我國(guó)的特色油料作物,栽培歷史悠久,遍布全國(guó)各地[1]。 研究發(fā)現(xiàn)芝麻對(duì)濕害較敏感,而土壤淹水或過濕是常見且不可避免的自然現(xiàn)象,因此濕害嚴(yán)重影響芝麻的生產(chǎn)[2]。 我國(guó)芝麻種植生長(zhǎng)季節(jié)通常在5-9月份,是雨量最為充沛的時(shí)期,尤其是在江淮芝麻主產(chǎn)區(qū)的湖北、河南、安徽、江西等地,芝麻遭受濕害危害最為嚴(yán)重[3],因此開展芝麻耐濕方面的研究具有重要意義。

國(guó)內(nèi)外關(guān)于其他作物耐濕性的研究已有大量報(bào)道,主要集中在濕害脅迫對(duì)作物的形態(tài)性狀、產(chǎn)量結(jié)構(gòu)、遺傳表達(dá)、品種間耐濕性差異等方面的影響。 如Li 等[4]通過對(duì)甘藍(lán)型油菜的耐濕性數(shù)量性狀基因座(quantitative trait loci, QTL)分析發(fā)現(xiàn),在耐濕性雙單倍體(doubled haploid, DH)遺傳群體中有4 個(gè)相關(guān)QTL 分布在遺傳連鎖群上。 Boru 等[5]對(duì)小麥進(jìn)行耐漬研究,發(fā)現(xiàn)耐濕性一般受加性基因效應(yīng)控制。 趙竑緋等[6]對(duì)紅皮柳和青皮柳兩杞柳品種進(jìn)行淹水研究,發(fā)現(xiàn)青皮柳更耐淹,更適宜在河岸帶、消落區(qū)生長(zhǎng)。 闞靖博等[7]對(duì)淹水脅迫下水稻土細(xì)菌豐度等變化規(guī)律進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)細(xì)菌微生物可能對(duì)水稻土的理化性質(zhì)、生態(tài)學(xué)特征有重要影響。 此外,關(guān)于白菜[8]、大麥[9]等在耐濕性方面的研究以及濕害條件下作物生理機(jī)理的研究也有大量報(bào)道。 如Leul 等[10]研究表明,濕害導(dǎo)致油菜幼苗丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量、相對(duì)導(dǎo)電率明顯升高,相關(guān)保護(hù)酶活性顯著下降。 劉凱文等[11]通過對(duì)棉花幼苗進(jìn)行不同時(shí)長(zhǎng)淹水,發(fā)現(xiàn)淹水第3、第9、第12 天是棉花生理代謝變化的關(guān)鍵期。 楊鵬等[12]研究青楊雌雄幼苗對(duì)濕害的適應(yīng)性,發(fā)現(xiàn)濕害對(duì)青楊雌雄幼苗均有嚴(yán)重的抑制作用,且雌株耐濕性強(qiáng)于雄株。

目前,國(guó)內(nèi)外已有關(guān)于芝麻耐濕性的研究報(bào)道。如王文泉等[13]通過對(duì)幾種耐漬性不同的芝麻品種在淹水脅迫下根系無氧呼吸酶活性、根的形態(tài)解剖結(jié)構(gòu)等的研究,發(fā)現(xiàn)淹水訓(xùn)練能改善芝麻品種的耐漬力。王美榮[14]研究澇漬脅迫下芝麻幼苗期的生理生化指標(biāo),發(fā)現(xiàn)淹水后芝麻體內(nèi)會(huì)積累一些有害物,同時(shí)機(jī)體也會(huì)通過自身調(diào)節(jié)產(chǎn)生一些保護(hù)類酶,以清除有害物。Molaei 等[15]研究水脅迫下Oltan 芝麻品種的相對(duì)含水量、脯氨酸(proline,Pro)含量等變化情況,發(fā)現(xiàn)脅迫導(dǎo)致該品種脯氨酸含量增高,但葉片相對(duì)含水量未顯著降低。 Heidari 等[16]研究淹水脅迫下硫和鐵對(duì)芝麻產(chǎn)量及性狀的影響,發(fā)現(xiàn)噴灑鐵元素和硫元素能減輕濕害對(duì)芝麻生長(zhǎng)及產(chǎn)量性狀的影響。 張根峰等[17]通過研究不同澇漬時(shí)間對(duì)不同基因型芝麻比葉重、葉綠素含量及根系活力等影響,發(fā)現(xiàn)隨著淹水時(shí)間延長(zhǎng),芝麻的上述指標(biāo)均有所下降。 丁霞等[3]在盛花期對(duì)我國(guó)43 個(gè)芝麻主栽品種進(jìn)行耐濕鑒定,發(fā)現(xiàn)這些芝麻品種耐濕性普遍不高。 王林海等[18]和張艷欣等[19]對(duì)芝麻材料在芽期進(jìn)行耐濕遺傳差異評(píng)價(jià),將其分為極不耐濕、不耐濕、中耐、耐濕和高耐濕5 類。 孫建等[20-21]對(duì)不同芝麻品種(系)進(jìn)行耐濕性綜合評(píng)價(jià),通過研究濕害對(duì)不同生育時(shí)期芝麻保護(hù)酶活及種子產(chǎn)量的影響,發(fā)現(xiàn)芝麻盛花期是對(duì)濕害反應(yīng)最為敏感的時(shí)期。 前人關(guān)于芝麻耐濕方面的研究多在淹水時(shí)間間隔較長(zhǎng)的條件下進(jìn)行,部分重要生理指標(biāo)的變化尚未見報(bào)道,結(jié)果不夠系統(tǒng)全面。 因此,本研究基于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所芝麻種質(zhì)資源課題組獲得的穩(wěn)定耐濕、敏感的2 種基因型材料,針對(duì)芝麻對(duì)濕害最敏感時(shí)期(盛花期)[21],將這2 種基因型材料進(jìn)行不同時(shí)間的淹水,對(duì)其葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)及所有保護(hù)酶活性的動(dòng)態(tài)響應(yīng)變化進(jìn)行系統(tǒng)、全面的研究,以期為今后深入研究芝麻耐濕機(jī)理和耐濕相關(guān)基因的挖掘提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

耐濕基因型材料(湖北竹山白)和濕害敏感基因型材料(鄂芝2 號(hào))均是經(jīng)多年鑒定獲得的耐濕性穩(wěn)定材料[3,18]。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2015年在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所(武昌)進(jìn)行。 采用盆栽種植,盆缽內(nèi)口徑為30 cm,深40 cm,盆底有導(dǎo)水孔,配有底盤[22]。 試驗(yàn)所用營(yíng)養(yǎng)土采用0～25 mm 規(guī)格的泥炭土與當(dāng)?shù)剡m宜芝麻生長(zhǎng)的壤土按2 ∶1均勻混合,每盆所裝重量相同,盆沿距土表面約5 cm 高度,各留苗4 株。 濕害處理時(shí),將大號(hào)塑料桶套于盆缽?fù)?裝入水,水位保持在距離土壤表面2 cm 處,淹水時(shí)間一到,立即將裝有水的盆缽移出,開始取材。

于盛花期(芝麻進(jìn)入初花期15 d 后)分別對(duì)芝麻材料進(jìn)行4、8、12、16、20、24、28、32 和36 h 淹水處理(36 h 為本試驗(yàn)最長(zhǎng)淹水時(shí)間)。 為研究撤水后2 種材料的生理指標(biāo)變化走勢(shì),試驗(yàn)將一部分持續(xù)淹水36 h 的試驗(yàn)材料進(jìn)一步分別進(jìn)行4、8、12 h (撤水處理在淹水36 h 后立即進(jìn)行,時(shí)間上具有延續(xù)性,故分別以40、44、48 h 表示,如48 h 即為36 h 淹水及12 h 撤水的總時(shí)長(zhǎng)) 撤水處理。 以未被淹水材料作為對(duì)照(CK),每處理均設(shè)3 次重復(fù)[21]。

分別于淹水處理前和淹水4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48 h 取材,從植株頂端展開葉開始,自上而下依次取第1 片全展葉、第2 片全展葉。 其中,用于酶液測(cè)定的芝麻葉片為第1 片全展葉,各稱取0.5 g為1 個(gè)重復(fù),用于滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和MDA 含量測(cè)定的芝麻葉片為第2 片全展葉,各稱取0.1 g 為1 個(gè)重復(fù),均設(shè)3 次重復(fù)。

1.3 生理生化指標(biāo)測(cè)定方法

游離脯氨酸含量測(cè)定采用酸性茚三酮比色法[23];可溶性糖(soluble sugar,SS)含量測(cè)定采用蒽酮比色法[24];可溶性蛋白(soluble protein,SP)含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)染色法[25];MDA 含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸法[25]; 抗壞血酸過氧化物酶( ascorbate peroxidase,APX)活性測(cè)定采用ASA 氧化法[26],以每分鐘內(nèi)氧化1 μmol 還原型抗壞血酸(reduced asccbate, ASA)的酶量作為1 個(gè)酶活性單位(U);超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性測(cè)定采用氮藍(lán)四唑(NBT)光化還原法[26],以SOD 活性單位抑制NBT 光還原的50%為1 個(gè)酶活性單位(U);過氧化物酶(peroxidase, POD)活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚顯色法[27],以每分鐘內(nèi)A470nm增加0.01 的酶量為1 個(gè)活性單位(U);過氧化氫酶(catalase, CAT)活性測(cè)定采用紫外吸收法[26],以每分鐘內(nèi)240 nm 處吸光值減少0.1的酶量為1 個(gè)酶活單位(U)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010 進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同基因型芝麻滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)濕害脅迫的響應(yīng)

由圖1-A 可知,淹水開始的8 h 內(nèi),2 種材料的脯氨酸相對(duì)含量變化趨勢(shì)相反;淹水8 h 后至撤水12 h,湖北竹山白和鄂芝2 號(hào)的脯氨酸相對(duì)含量變化趨勢(shì)基本一致。 整個(gè)處理過程中(除淹水8 h 外),鄂芝2 號(hào)的脯氨酸相對(duì)含量明顯高于湖北竹山白,且在28、32、40、44 h 均差異顯著,其中在28 h 和32 h 2 品種脯氨酸相對(duì)含量達(dá)極顯著差異。

由圖1-B 可知,在淹水開始至撤去水的總48 h,湖北竹山白和鄂芝2 號(hào)的可溶性蛋白相對(duì)含量變化趨勢(shì)基本一致;湖北竹山白的可溶性蛋白相對(duì)含量在濕害24 h 內(nèi)始終高于鄂芝2 號(hào),且在12 h 差異顯著(P＜0.05),表明鄂芝2 號(hào)在淹水初期對(duì)濕害脅迫較為敏感。 而后至撤水12 h,湖北竹山白和鄂芝2 號(hào)的可溶性蛋白相對(duì)含量變化逐漸一致。

由圖1-C 可知,從淹水開始至撤去水的總48 h,湖北竹山白和鄂芝2 號(hào)芝麻葉片的可溶性糖相對(duì)含量均呈現(xiàn)“W 型”變化趨勢(shì),且二者可溶性糖相對(duì)含量變化趨勢(shì)基本持平,各時(shí)間點(diǎn)差異均不顯著。

圖1 濕害脅迫對(duì)不同基因型芝麻滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)相對(duì)含量的影響Fig.1 Effect of waterlogging stress on relative content of osmotic adjustment substances in different genotypes of sesame

2.2 不同基因型芝麻保護(hù)酶活性對(duì)濕害脅迫的響應(yīng)

由圖2-A 可知,在淹水開始至撤去水的總48 h,湖北竹山白和鄂芝2 號(hào)的APX 相對(duì)活性均呈反復(fù)下降-上升的變化趨勢(shì);除淹水8 h 外,湖北竹山白的APX相對(duì)活性始終明顯高于鄂芝2 號(hào),且其變化幅度較大,而鄂芝2 號(hào)的波動(dòng)則不明顯;在撤水恢復(fù)期,湖北竹山白的APX 相對(duì)活性呈先上升后下降再上升的趨勢(shì),而鄂芝2 號(hào)則呈逐漸下降趨勢(shì);整個(gè)處理過程中,2 種材料的APX 相對(duì)活性差異在20、32、48 h 均達(dá)到極顯著差異(P＜0.01),在40 h 時(shí)達(dá)到顯著水平(P＜0.05)。

由圖2-B 可知,在淹水開始至撤去水的總48 h,湖北竹山白和鄂芝2 號(hào)芝麻葉片的CAT 相對(duì)活性均呈上升-下降-上升-下降-上升的變化趨勢(shì);整個(gè)處理過程中(除4 h),二者的CAT 相對(duì)活性差異均不顯著,湖北竹山白的CAT 相對(duì)活性總體上高于鄂芝2 號(hào)。

由圖2-C 可知,在淹水開始至撤去水的總48 h,湖北竹山白和鄂芝2 號(hào)的POD 相對(duì)活性變化趨勢(shì)基本一致,且均無明顯規(guī)律;湖北竹山白在整個(gè)處理中(除淹水16、24 h 外)的POD 相對(duì)活性均低于鄂芝2 號(hào),此現(xiàn)象在淹水開始的8 h 內(nèi)較為明顯,淹水4 h 時(shí)差異達(dá)到顯著水平(P＜0.05)。

由圖2-D 可知,在淹水開始至撤去水的總48 h,湖北竹山白和鄂芝2 號(hào)葉片的SOD 相對(duì)活性均呈現(xiàn)“M型”變化趨勢(shì),且二者的SOD 相對(duì)活性各處理時(shí)間差異均不顯著。

圖2 濕害脅迫對(duì)不同基因型芝麻保護(hù)酶相對(duì)活性的影響Fig.2 Effect of waterlogging stress on relative activity of protective enzymes in different genotypes of sesame

圖3 濕害脅迫對(duì)不同基因型芝麻MDA 相對(duì)含量的影響Fig.3 Effect of waterlogging stress on relative content of malondialdehyde in different genotypes of sesame

2.3 不同基因型芝麻MDA 含量對(duì)濕害脅迫的響應(yīng)

由圖3 可知,在淹水開始至撤去水的總48 h,湖北竹山白和鄂芝2 號(hào)的MDA 相對(duì)含量變化趨勢(shì)存在差異。 隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng),敏感材料鄂芝2 號(hào)的變化幅度明顯增大,而耐濕材料湖北竹山白則相對(duì)較穩(wěn)定;整個(gè)處理過程中,鄂芝2 號(hào)的相對(duì)MDA 含量始終明顯高于耐濕材料,且在12 h 和48 h 差異顯著(P＜0.05)在20 h 和28 h 差異極顯著(P＜0.01)。

3 討論

植物受到逆境脅迫時(shí),通常會(huì)在短時(shí)間內(nèi)合成和積累如脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖等滲透調(diào)節(jié)物,以增強(qiáng)其對(duì)滲透脅迫的抵抗力[28]。 本研究發(fā)現(xiàn)耐濕材料湖北竹山白和敏感材料鄂芝2 號(hào)的可溶性糖相對(duì)含量在盛花期持續(xù)濕害脅迫下的差異不明顯,說明二者均利用可溶性糖對(duì)自身細(xì)胞進(jìn)行保護(hù);湖北竹山白在脅迫初期的可溶性蛋白相對(duì)含量高于鄂芝2 號(hào),后期二者趨于一致,說明敏感型芝麻在脅迫初期對(duì)濕害脅迫較耐濕型芝麻敏感。 這與汪妮[29]的研究結(jié)果基本一致。 本研究中,持續(xù)濕害脅迫下,湖北竹山白脯氨酸相對(duì)含量始終明顯低于鄂芝2 號(hào),這與汪妮[29]的研究結(jié)果不同,可能與濕害脅迫下湖北竹山白和鄂芝2號(hào)中參與脯氨酸合成的關(guān)鍵基因表達(dá)水平不同有關(guān)。研究表明,脯氨酸的合成主要通過2 條途徑即谷氨酸(Glu)途徑和鳥氨酸(Orn)途徑完成,而在滲透脅迫下,主要通過Glu 途徑進(jìn)行,其中P5SC 是編碼此途徑關(guān)鍵酶的基因[28]。 為了簡(jiǎn)單驗(yàn)證這種可能性是否存在,本研究從中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所芝麻資源課題組同時(shí)期在濕害脅迫下所測(cè)上述2 種材料的轉(zhuǎn)錄組結(jié)果中找出P5SC 同源基因SIN_1012216,分析其在這2 種材料中的表達(dá),結(jié)果表明,SIN_1012216 在鄂芝2 號(hào)中的表達(dá)量高于湖北竹山白,這與上述脯氨酸變化趨勢(shì)基本一致(圖4),由此推測(cè)敏感材料的脯氨酸積累量高于耐濕材料與Glu 途徑中編碼關(guān)鍵酶的基因表達(dá)受到脅迫的強(qiáng)烈誘導(dǎo)有關(guān)。 目前,關(guān)于脅迫下游離脯氨酸含量變化與植物抗性間關(guān)系的研究結(jié)論不一。 有些研究發(fā)現(xiàn)逆境下抗性品種較敏感品種積累了更多脯氨酸,因此可將脯氨酸積累量的高低作為植物抗逆性強(qiáng)弱的參考[30-31];也有許多學(xué)者持不同意見,如Garcia 等[32]認(rèn)為脯氨酸積累是脅迫對(duì)植物傷害的結(jié)果;Liu 等[33]研究發(fā)現(xiàn)鹽脅迫下擬南芥鹽敏感突變體比野生型擬南芥積累更多脯氨酸;劉娥娥等[34]通過對(duì)干早、鹽和低溫脅迫下抗性和敏感水稻積累脯氨酸情況進(jìn)行研究,認(rèn)為逆境下脯氨酸積累量更適合作為一種脅迫敏感性指標(biāo)。 上述研究說明逆境下脯氨酸積累量并不宜作為抗性篩選指標(biāo),因此鄂芝2 號(hào)在濕害中因其所受滲透脅迫傷害影響較大,需積累更多脯氨酸來修復(fù)其所受損傷,具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究,今后應(yīng)通過多組學(xué)聯(lián)合分析進(jìn)行明晰。

圖4 濕害脅迫對(duì)不同基因型芝麻SIN_1012216相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.4 Effect of waterlogging on relative expressionlevels of SIN_1012216 in different genotypes of sesame

逆境中,植物細(xì)胞通過多途徑、多部位產(chǎn)生活性氧,直接或間接啟動(dòng)膜脂過氧化反應(yīng)破壞膜結(jié)構(gòu)。 植物在長(zhǎng)期進(jìn)化中,形成了自身的一套逆境適應(yīng)機(jī)制,如形成防御活性氧毒害的保護(hù)酶系統(tǒng)(包括SOD、CAT、APX 和POD 等),此系統(tǒng)在清除超氧自由基、過氧化氫等方面起著重要的作用[35-36]。 研究發(fā)現(xiàn)SOD 在清除活性氧中發(fā)揮關(guān)鍵作用,其可將O2-轉(zhuǎn)化為H2O2;CAT、APX 和 POD 等則負(fù)責(zé)清除其所轉(zhuǎn)化的。 本研究中,2 種不同耐濕基因型芝麻材料的相對(duì)SOD 活性在濕害下基本保持在同等水平,說明二者利用SOD 轉(zhuǎn)化的H2O2的增量基本一致,但耐濕基因型湖北竹山白的相對(duì)APX、CAT 和POD 活性均高于敏感基因型鄂芝2 號(hào),說明耐濕材料對(duì)H2O2的清除能力較強(qiáng)。 研究發(fā)現(xiàn)APX、CAT 和POD 中,APX 是H2O2清除系統(tǒng)中的關(guān)鍵酶,對(duì)H2O2親和力也最強(qiáng)[38-39]。 本研究發(fā)現(xiàn)自淹水脅迫開始至撤水恢復(fù)期結(jié)束,湖北竹山白的相對(duì)APX 活性始終高于鄂芝2號(hào),此結(jié)果也間接說明了在濕害脅迫下湖北竹山白可能利用APX 清除了多余H2O2,保護(hù)細(xì)胞質(zhì)膜不被破壞,維持其正常生理功能方面明顯強(qiáng)于鄂芝2 號(hào)。 此外,濕害脅迫下湖北竹山白葉片中的相對(duì)MDA 積累量明顯低于鄂芝2 號(hào),表明前者膜系統(tǒng)的受損傷程度低于后者,也間接說明了耐濕材料在逆境下對(duì)自身細(xì)胞膜的保護(hù)力更強(qiáng)。

4 結(jié)論

耐濕基因型(湖北竹山白)和濕害敏感基因型(鄂芝2 號(hào))材料均能對(duì)濕害脅迫做出相應(yīng)的抵御反應(yīng),相比之下,湖北竹山白在積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、形成防御活性氧毒害的保護(hù)酶系統(tǒng)以及降低細(xì)胞膜脂過氧化程度等大部分生理生化指標(biāo)方面的能力均強(qiáng)于鄂芝2號(hào),但其耐濕調(diào)控通路等機(jī)制還有待進(jìn)一步探究。