多重PCR 檢測耐除草劑轉(zhuǎn)基因作物

邢珍娟 董立明 劉 娜 夏 蔚 李蔥蔥 謝彥博 李飛武

(吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所,吉林 長春 130033)

自1983年第一例轉(zhuǎn)基因作物問世以來,全球轉(zhuǎn)基因作物發(fā)展迅猛,根據(jù)國際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織(International Service for the Acquisition of Agribiotech Applications,ISAAA)統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示,2016年全球26 個國家共種植1.851 億hm2的轉(zhuǎn)基因作物,較2015年增長約3%,較1996年增加110 倍[1]。 除草劑對農(nóng)田雜草具有良好的防治效果,在農(nóng)事管理操作中發(fā)揮重要作用,隨著各類除草劑抗性基因的挖掘及遺傳改良技術(shù)的發(fā)展,耐除草劑轉(zhuǎn)基因作物研發(fā)取得了顯著進(jìn)展,已成為全球范圍內(nèi)推廣應(yīng)用面積最大的轉(zhuǎn)基因作物類型[1]。 2016年全球種植的耐除草劑轉(zhuǎn)基因作物(包括抗蟲和耐除草劑復(fù)合性狀)約1.62 億hm2,占轉(zhuǎn)基因作物種植總面積的87.5%,較2015年增長約5%[2]。 目前,除草劑抗性基因在轉(zhuǎn)基因大豆、玉米、油菜、棉花、甜菜等作物中均有報道[3]。

轉(zhuǎn)基因技術(shù)作為一項新型高新技術(shù),其產(chǎn)品的食用安全性和環(huán)境安全性受到了廣泛關(guān)注[4],因此,很多國家和地區(qū)對轉(zhuǎn)基因技術(shù)及其產(chǎn)品建立了相應(yīng)的管理法規(guī),如安全評價制度、標(biāo)識監(jiān)管制度等[5]。 為確保這些監(jiān)管制度的實施,國內(nèi)外學(xué)者圍繞轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品精準(zhǔn)、快速檢測技術(shù)等開展了大量研究,其中PCR 是最常應(yīng)用的轉(zhuǎn)基因分子檢測技術(shù),已建立了一系列以外源調(diào)控元件、標(biāo)記和報告基因、目的基因、轉(zhuǎn)化體成分等為靶標(biāo)的單一PCR 檢測方法[6-7]。

在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品分子檢測時,一般先對幾種常見轉(zhuǎn)基因成分,如外源調(diào)控元件、目的基因等進(jìn)行篩查,確認(rèn)樣品中是否存在轉(zhuǎn)基因成分,然后再進(jìn)行轉(zhuǎn)基因身份鑒定[8-9]。 隨著轉(zhuǎn)基因成分篩選元件種類的增多,采用單一PCR 方法存在操作繁瑣、耗時低效、成本較高等不足,而多重PCR(multiplex PCR,MPCR)技術(shù)可在同一個檢測體系中加入多種檢測引物,實現(xiàn)對多種靶標(biāo)DNA 的同時檢測,顯著提高了檢測效率[10]。 由于MPCR 體系較以單個基因為檢測對象的普通PCR更復(fù)雜,且技術(shù)難度大,因此在建立MPCR 方法時需對不同靶標(biāo)的引物用量及反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化測試,確保建立的MPCR 方法有足夠的特異性和靈敏度[11-12]。近年來,大量的研究學(xué)者運(yùn)用MPCR 技術(shù)對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行分子檢測,如張耀川等[13]利用MPCR 技術(shù)建立了7 種轉(zhuǎn)基因油菜籽轉(zhuǎn)化體的檢測方法;董立明等[14]采用MPCR 技術(shù)建立了轉(zhuǎn)基因大豆品系的高通量檢測方法;李飛武等[15]建立了能同時檢測8 種Bt 基因的多重簡并PCR 方法;Xu 等[16]利用MPCR 技術(shù)結(jié)合PAGE 電泳建立了9 種外源基因和6 種內(nèi)源基因的15重PCR 方法;傅凱等[17]建立了13 個轉(zhuǎn)基因玉米品系的MPCR-芯片檢測方法;Heide 等[18]將MPCR 與毛細(xì)管電泳結(jié)合建立了8 種轉(zhuǎn)基因玉米品系的高通量檢測方法。 但已報道的方法多見于對篩選元件、抗蟲基因及轉(zhuǎn)基因玉米、油菜等品系特異性的研究,對轉(zhuǎn)基因耐除草劑作物的MPCR 檢測方法尚鮮見報道。

針對耐除草劑轉(zhuǎn)基因作物,以除草劑抗性基因為靶標(biāo)對象的特異性檢測方法是轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品日常監(jiān)管和篩選檢測的重要技術(shù)手段之一,而建立快速高效的檢測方法已成為轉(zhuǎn)基因分子檢測技術(shù)研究的重點[5]。CP4EPSPS、bar、pat、aad1、dmo 5 個基因是當(dāng)前應(yīng)用最廣泛的除草劑抗性基因。 本研究以含有dmo、pat、CP4EPSPS、bar 和aad1 5 個耐除草劑基因的轉(zhuǎn)基因作物為試驗材料,通過引物設(shè)計與篩選、MPCR 反應(yīng)體系、反應(yīng)條件優(yōu)化、特異性檢測、靈敏度測試、適用性驗證等,以期建立能同時檢測轉(zhuǎn)基因作物中5 種除草劑抗性基因的MPCR 方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 轉(zhuǎn)基因玉米( Bt11、 T25、MON88017、NK603、Bt176、DAS40278-9),轉(zhuǎn)基因大豆(MON87708、MON89788、GTS40-3-2、A2704-12、A5547-127),轉(zhuǎn)基因棉花(MON1445、MON88913、LLCOTTON25),轉(zhuǎn)基因油菜(GT73、Topas19/2、RF1),轉(zhuǎn)基因甜菜(H7-1)及非轉(zhuǎn)基因作物樣品均由吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院轉(zhuǎn)基因檢測實驗室收集并保存。 每種轉(zhuǎn)化體及適用性測試樣品中含有的除草劑抗性基因信息詳見表1。

表1(續(xù))

1.1.2 主要試劑 植物基因組提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司;HS-Taq DNA 聚合酶、dNTPs等購自大連寶生物有限公司;GeneFinder 核酸染料、瓊脂糖等購自北京鼎國生物有限公司。 所有引物均由上海生工生物有限公司合成和純化。

1.2 方法

1.2.1 樣品基因組DNA 的提取 取100 ～200 mg 樣品粉末,利用DNA 提取試劑盒提取樣品的基因組DNA,用ND1000 微量紫外/可見分光光度計(美國NanoDrop 公司)測定DNA 樣品的純度和濃度,并根據(jù)濃度測定值稀釋至25 mg·L-1,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 陽性對照DNA 樣品的制備 將轉(zhuǎn)基因玉米NK603、Bt176、 Bt11、 DAS40278 - 9 及 轉(zhuǎn) 基 因 大 豆MON87708 的基因組DNA 等體積混合制成陽性對照DNA 樣品,其中每個轉(zhuǎn)化體DNA 成分的質(zhì)量濃度為5 mg·L-1(相當(dāng)于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%)。

1.2.3 引物的設(shè)計及篩選 以常見除草劑抗性基因dmo、pat、CP4EPSPS、bar、aad1 的核苷酸序列為模板[19-20],按照MPCR 引物設(shè)計原則,應(yīng)用引物設(shè)計軟件Primer Premier 5.0 設(shè)計上述5 個靶標(biāo)基因的引物,其序列、預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物大小等信息詳見表2。 用ddH2O 將引物干粉溶解并稀釋至10 μmol·L-1。

1.2.4 單重PCR 擴(kuò)增體系 擴(kuò)增體系為25 μL,包含10×PCR 緩沖液2.5 μL, dNTPs 混合液2 μL(每種dNTP 終濃度為0.2 mmol·L-1),上、下游引物各1 μL,熱啟動Taq DNA 聚合酶0.25 μL(5 U·μL-1),DNA 樣品2 μL,加ddH2O 補(bǔ)充至25 μL。 每個樣品設(shè)3 次重復(fù)。

1.2.5 MPCR 擴(kuò)增體系 擴(kuò)增體系為25 μL,包含10×PCR 緩沖液2.5 μL, dNTPs 混合液2 μL,dmo、pat、aad1 基因的上下游引物各0.5 μL,CP4EPS 基因的上下游引物各0.75 μL,bar 基因的上下游引物各1.0 μL,熱啟動Taq DNA 聚合酶0.25 μL(5 U·μL-1),DNA 樣品2 μL,加ddH2O 補(bǔ)充至25 μL。 每個樣品設(shè)3 次重復(fù)。

1.2.6 擴(kuò)增程序及產(chǎn)物檢測 單一和五重PCR 采用相同的擴(kuò)增程序:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,63℃退火30 s,72℃延伸60 s,35 個循環(huán);72℃延伸7 min。 取7.5 μL PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物,用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選

本研究中,CP4EPSPS 基因的檢測引物直接采用國家標(biāo)準(zhǔn)中的簡并引物,而dmo、pat、bar 和aad1 基因則在系統(tǒng)分析各個檢測靶標(biāo)的序列信息及現(xiàn)有方法基礎(chǔ)上,重新設(shè)計了適用于建立MPCR 的引物,并對新引物的特異性進(jìn)行測試。 擴(kuò)增結(jié)果顯示,新設(shè)計的4對引物可從aad1、bar、 pat 和dmo 4 種靶基因的陽性對照樣品中分別擴(kuò)增出130、220、461 和627 bp 的預(yù)期產(chǎn)物(圖1)。 為保證所設(shè)計引物序列的特異性,將設(shè)計的引物序列提交NCBI 數(shù)據(jù)庫(http:/ /blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行核苷酸序列檢索比對,結(jié)果顯示所有引物序列與主要農(nóng)作物基因組DNA 均不具有同源性,從理論上驗證了引物在轉(zhuǎn)基因作物檢測中的特異性。

2.2 MPCR 引物適用性

為驗證aad1、bar、CP4-epsps、 pat 和dmo 5 種靶基因的檢測引物在MPCR 體系中的適用性,以陽性對照DNA 樣品及相應(yīng)的單一轉(zhuǎn)化體DNA 為模板,進(jìn)行五重PCR 擴(kuò)增。 測試結(jié)果顯示,應(yīng)用此MPCR 體系在陽性對照樣品中可獲得5 個靶基因的預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物,而在單一轉(zhuǎn)化體樣品中僅獲得與預(yù)期片段大小一致的單一目標(biāo)產(chǎn)物,表明用這5 對引物建立MPCR 檢測體系是可行的(圖2)。

圖1 新設(shè)計的4 個基因檢測引物的測試結(jié)果Fig.1 Testing results of new designed primers for four herbicide-tolerant genes

圖2 多重PCR 體系的適用性測試Fig.2 Applicability of the multiplex PCR

2.3 MPCR 反應(yīng)體系及反應(yīng)程序的優(yōu)化結(jié)果

為確定MPCR 檢測體系的最適引物配比和反應(yīng)程序,設(shè)置3 個引物配比方案(反應(yīng)體系中dmo、pat、CP4EPSPS、bar、aad1 的引物終濃度分別為0.2、0.2、0.2、0.4、 0.2 μmol·L-1, 0.2、 0.2、 0.3、 0.4、 0.2 μmol·L-1,0.2、0.2、0.4、0.4、0.2 μmol·L-1),4 種退火溫度(60、61、62、63℃),以陽性對照DNA 樣品及其5倍稀釋液為測試樣(標(biāo)記為1×和0.2×陽性DNA 樣品),進(jìn)行引物濃度和退火溫度的二因素MPCR 正交試驗。 結(jié)果表明,當(dāng)dmo、pat、CP4EPSPS、bar、aad1 基因的檢測引物濃度分別為0.2、0.2、0.3、0.4、0.2 μmol·L-1,退火溫度為63℃時,利用五重PCR 方法在2 個測試樣品中均能得到5 種靶標(biāo)基因的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物,且條帶清晰均一。

2.4 MPCR 方法的靈敏度分析

將陽性對照DNA 樣品用0.1×TE 進(jìn)行梯度稀釋,制備了8 份靈敏度測試樣,測試樣品中含每種靶標(biāo)基因的樣品DNA 質(zhì)量濃度分別相當(dāng)于1.25、0.5、0.25、0.125、0.05、0.025、0.012 5、0.002 5 mg·L-1,利用優(yōu)化好的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序進(jìn)行五重PCR 擴(kuò)增。 由圖3 可知,當(dāng)DNA 樣品濃度≥0.025 mg·L-1時,可獲得全部5 種靶標(biāo)基因成分的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物,而當(dāng)DNA 樣品濃度≤0.012 5 mg·L-1時僅能獲得部分預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物,表明該五重PCR 方法對每種靶標(biāo)基因的檢出限為0.025 mg·L-1。 按每個體系中加入2 μL 模板計算,本研究建立的五重PCR 方法對每種靶標(biāo)基因的檢出限均可達(dá)50 pg;按初始DNA 濃度25 mg·L-1測算,相對檢出限為0.1%,可滿足轉(zhuǎn)基因作物中相應(yīng)除草劑抗性基因成分的精確檢測需求。

圖3 MPCR 方法的靈敏度測試Fig.3 Sensitivity of the MPCR assay

2.5 MPCR 檢測方法對不同組分樣品的適用性

將耐除草劑轉(zhuǎn)基因作物進(jìn)行混合,制成含2 ～5 種靶標(biāo)基因的適用性測試樣品(表1),每個樣品中每種靶標(biāo)基因的DNA 質(zhì)量濃度為0.25 mg·L-1(相當(dāng)于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%),進(jìn)行MPCR 檢測體系的適用性測試。由圖4 可知,應(yīng)用五重PCR 方法能夠從11 個適用性測試樣品中分別擴(kuò)增到2～5 個特異性產(chǎn)物,在空白對照和陰性對照樣品中均無擴(kuò)增,且未出現(xiàn)假陽性或假陰性情況,與表1 所列的預(yù)期結(jié)果一致,表明本研究建立的五重PCR 方法適用于各種復(fù)雜樣品中5 種除草劑抗性基因的精準(zhǔn)檢測。

3 討論

圖4 多重PCR 方法的適用性驗證Fig.4 Applicability of the multiplex PCR assay

MPCR 技術(shù)作為一種經(jīng)濟(jì)高效、準(zhǔn)確可靠的高通量檢測手段,廣泛運(yùn)用于轉(zhuǎn)基因成分檢測,檢測對象既有常見的調(diào)控元件、標(biāo)記基因和目的基因[15,22-23],也有轉(zhuǎn)基因玉米[24]、大豆[25-26]、油菜[13]、棉花[27-28]、番木瓜[29]等轉(zhuǎn)化體成分,前者可實現(xiàn)篩查目的,后者可對轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行身份鑒定。 由于cp4-epsps、bar 和pat 基因在轉(zhuǎn)基因作物中已被廣泛長期應(yīng)用,前人對CP4EPSPS、bar 和pat 基因的PCR 或ELISA 檢測方法[30-31]進(jìn)行了研究并形成了相應(yīng)的國家標(biāo)準(zhǔn)[32,21],如龍麗坤等[33]建立了aad1 和dmo 雙重PCR 檢測方法。但尚未有基于高通量技術(shù)同時篩查上述5 種除草劑抗性基因的報道。 本研究針對國內(nèi)外廣泛應(yīng)用的5 種除草劑抗性基因建立了五重PCR 檢測方法,為基于外源目的基因的轉(zhuǎn)基因成分篩選檢測提供了一種新的技術(shù)手段。

一種可靠的高通量檢測方法不僅需要有嚴(yán)格的特異性和靈敏度,還需具有在復(fù)雜樣品中正確檢出預(yù)期靶標(biāo)成分的適應(yīng)性。 本研究通過一系列試驗建立的五重PCR 檢測方法可對含CP4EPSPS、bar 等5 種靶標(biāo)基因成分的單個轉(zhuǎn)化體或多個轉(zhuǎn)化體的混合物進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定,對每個靶標(biāo)的檢測靈敏度可達(dá)0.1%,與前人報道的多重PCR 方法的技術(shù)指標(biāo)一致[10,30],表明本研究新建的五重PCR 方法可作為耐除草劑轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品的篩查手段。

據(jù)統(tǒng)計,目前我國已批準(zhǔn)進(jìn)口的49 個轉(zhuǎn)基因作物轉(zhuǎn)化體中有34 個含有除草劑耐受性,其中30 個含有本研究中使用的除草劑抗性基因。 根據(jù)已有的試驗結(jié)果及檢測引物與靶標(biāo)核苷酸序列的比對,本研究建立的五重PCR 方法可以對這30 個含有CP4EPSPS、bar、pat、aad1 或dmo 基因的耐除草劑作物進(jìn)行篩選檢測,分別占已批準(zhǔn)進(jìn)口的全部轉(zhuǎn)化體和耐除草劑轉(zhuǎn)化體的61.2%和88.2%。 本研究結(jié)果表明,MPCR 檢測方法具有較好的檢測覆蓋度,是一種高效的檢測手段,可為我國轉(zhuǎn)基因作物監(jiān)管和檢測提供一定的技術(shù)支撐。

4 結(jié)論

本研究建立了以CP4EPSPS、bar、pat、aad1、dmo 5 個常見除草劑抗性基因為靶標(biāo)的MPCR 檢測方法,該方法具有良好的特異性,對每種靶標(biāo)的檢測靈敏度可達(dá)到0.1%,適用于各種復(fù)雜樣品中相應(yīng)轉(zhuǎn)基因成分的快速高效篩查。 與現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中的常規(guī)PCR 方法相比,本研究建立的MPCR 方法有效提高了檢測效率,降低了檢測成本,進(jìn)一步完善了轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品成分檢測技術(shù)手段,在玉米、大豆、棉花、油菜、甜菜等農(nóng)作物及其產(chǎn)品的轉(zhuǎn)基因成分篩選檢測工作中具有較好的應(yīng)用前景。