4 個(gè)鮮食葡萄品種組培快繁體系的建立

蔡文博 段 虹 王 軍 朱元娣

(1中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院,北京 100193;2中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)學(xué)院,北京 100083)

中國(guó)是世界葡萄(Vitis vinifera L.)生產(chǎn)大國(guó),自2011年起鮮食葡萄產(chǎn)量已位居世界首位,2014年起葡萄栽培面積躍居世界第2 位[1],截至2015年底,栽培面積達(dá)79.9 萬(wàn)hm2,產(chǎn)量達(dá)1 366.9 萬(wàn)t。 我國(guó)葡萄生產(chǎn)以鮮食葡萄為主,占80%左右,葡萄苗木標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)是產(chǎn)業(yè)發(fā)展的基礎(chǔ)[2-3]。 葡萄可以通過(guò)扦插或嫁接等方法進(jìn)行無(wú)性繁殖,但周期長(zhǎng)且易積累病害。 植物組織培養(yǎng)技術(shù)能夠不受季節(jié)的限制,快速繁殖優(yōu)質(zhì)的葡萄苗木,同時(shí)降低成本[4-6]。 因此,建立有效的鮮食葡萄品種組培快繁體系,不僅可以滿足優(yōu)質(zhì)苗木的商業(yè)化生產(chǎn)需求,還能為優(yōu)質(zhì)葡萄市場(chǎng)提供技術(shù)參考。

常規(guī)的組培快繁體系包括無(wú)菌外植體的建立、啟動(dòng)培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)和馴化移栽四個(gè)環(huán)節(jié)[7]。 外植體的選擇是葡萄組培快繁的第一步。 選取長(zhǎng)新梢(10 cm)作為外植體,有利于誘導(dǎo)不定芽的發(fā)生[8-9]。 培養(yǎng)基成分與配比能夠影響外植體的啟動(dòng)培養(yǎng)和繁殖體的增殖效率[10]。 研究表明,添加2 mg·L-16-芐氨基腺嘌呤(6-benzylamino purine,6-BA)和0.2 mg·L-1萘乙酸(1-naphthlcetic acid, NAA)的MS 培養(yǎng)基作為巨峰的初代培養(yǎng)基,2.0 ～5.0 cm 新梢為外植體,萌芽率達(dá)到71.1%[11];MS 培養(yǎng)基添加0.2 mg·L-13-吲哚丁酸(3-indolebutyric acid, IBA)、1.0 mg·L-16-BA 和0.5 mg·L-16-糠氨基嘌呤(kinetin, KT)啟動(dòng)培養(yǎng)釀酒葡萄莖段外植體,萌芽率達(dá)73%以上,側(cè)芽萌發(fā)生長(zhǎng)狀況良好[12]。 繼代過(guò)程中,繁殖體在不同培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況不同,1/2 MS 培養(yǎng)基有利于Dixie 和Fry 葡萄莖段的增殖增長(zhǎng)[8-9,13];木本植物培養(yǎng)基(woody plant medium,WPM)促使葡萄砧木3309 和SO4 生長(zhǎng)良好,生根率近100%[14],但圓葉葡萄品種如Carlos 和Fry在WPM 培養(yǎng)基上長(zhǎng)勢(shì)較差,表現(xiàn)出嚴(yán)重的玻璃化現(xiàn)象[15-16]。 培養(yǎng)基中附加的激素如3 - 吲哚乙酸(3-indoleacetic acid, IAA)、IBA、6-BA、苯基噻二唑基脲(thidiazuron, TDZ)和KT 等影響葡萄組培苗的增殖和生根[10,16]。 利用添加0.2 mg·L-1IBA 的改良B5培養(yǎng)基作為無(wú)核白和弗萊姆的繼代培養(yǎng)基,增殖與生根培養(yǎng)可同時(shí)進(jìn)行,減少了操作[10,17]。 組培苗馴化移栽是最終的重要環(huán)節(jié),不同煉苗方式影響組培苗移栽成活率。 光培法是馴化葡萄組培苗的常規(guī)方法,但成活率不高,為60%以上,這主要是由于在煉苗過(guò)程中,易產(chǎn)生大量霉菌,組培苗的根系易受傷害[6,12,18]。 但光培煉苗后進(jìn)行沙培煉苗,成活率可達(dá)到90%以上[10]。利用水培煉苗的方法馴化蘋(píng)果組培苗,將組培苗放入改良的霍格蘭德半營(yíng)養(yǎng)液中,能夠極大提高蘋(píng)果組培苗移栽成活率[19-20]。

目前,已建立的多個(gè)葡萄品種的組培快速繁殖體系間存在差異,但可用于不同葡萄品種的組培快繁體系較少,不利于將組培快繁技術(shù)轉(zhuǎn)化制葡萄苗木繁殖的商業(yè)化生產(chǎn)中。 本研究以4 個(gè)鮮食品種夏黑、紅地球、巨峰和玫瑰香為試驗(yàn)材料,通過(guò)探索無(wú)菌外植體接種、啟動(dòng)培養(yǎng)、增殖生根培養(yǎng)和馴化移栽環(huán)節(jié)的關(guān)鍵技術(shù),建立適用于不同鮮食葡萄品種的組培快繁體系,以期為鮮食葡萄苗木繁育和商品化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

于2015年11月在中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)上莊實(shí)驗(yàn)站采集夏黑、紅地球、巨峰和玫瑰香4 個(gè)鮮食葡萄品種的冬季休眠枝條作為建立鮮食葡萄快繁體系的試驗(yàn)材料。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

1.2.1 外植體消毒及啟動(dòng)培養(yǎng) 冬季采集葡萄休眠枝條,45℃恒溫水浴處理不同時(shí)間(1.5、3 和4 h),每種處理包含40 個(gè)枝條;然后在室溫下(21±2℃),水培促進(jìn)冬芽萌發(fā),每隔3～4 d 換一次水,待新梢生長(zhǎng)至長(zhǎng)度為10～15 cm 時(shí)采樣,剪切約10 cm 莖段作為外植體,進(jìn)行表面消毒;用加入洗滌靈的水充分清洗后,于超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行表面消毒。 分別進(jìn)行2 個(gè)消毒處理過(guò)程:1)高濃度(3%)次氯酸鈉處理:用70%酒精消毒10～30 s(幼嫩外植體消毒時(shí)間短),無(wú)菌水沖洗2～3 次,3%次氯酸鈉消毒10 min,無(wú)菌水沖洗4～5 遍,最后用滅菌的濾紙吸去莖段表面多余水分,為接種備用;2)低濃度(0.3%～0.5%)氯酸鈉處理:用70%酒精消毒10～30 s(幼嫩外植體消毒時(shí)間短),無(wú)菌水沖洗2～3 次,0.3%～0.5%次氯酸鈉消毒15 min,無(wú)菌水沖洗4～5 遍,最后用滅菌的濾紙吸去莖段表面多余水分,為接種備用。

每個(gè)葡萄品種選擇13 個(gè)莖段,分別經(jīng)過(guò)上述2 個(gè)消毒處理過(guò)程。 消毒后的莖段,分別剪去新梢頂端和切口部位,以避免消毒劑對(duì)莖段的剪切口的影響。 以幼嫩的和半木質(zhì)化的莖段為外植體,接種于MS+0.2 mg·L-1IBA +1.0 mg·L-16-BA +0.5 mg·L-1KT +4.0 mg·L-1腺嘌呤+30 g·L-1蔗糖+ 8.2 g·L-1瓊脂培養(yǎng)基上。 培養(yǎng)環(huán)境如下:光照強(qiáng)度為30～40 μmol·m-2·s-1,光照時(shí)間為14 h·d-1,培養(yǎng)溫度為25±2℃,15 d 后觀察莖段生長(zhǎng)狀況,并統(tǒng)計(jì)萌芽率。

1.2.2 增殖與生根培養(yǎng) 單芽長(zhǎng)度為5～6 cm 時(shí),進(jìn)行繼代培養(yǎng)。 剪成單芽莖段(長(zhǎng)10 ～15 mm),每瓶接種3～4 個(gè)莖段。 設(shè)置不同成分配比的培養(yǎng)基(分別記作T1、T2、T3),以篩選適用于4 個(gè)鮮食葡萄品種增殖生根的培養(yǎng)基,培養(yǎng)基成分如下:T1 ∶1/2MS + 0.1 mg·L-1IBA +1.0 mg·L-1KT +30 g·L-1蔗糖+8.2 g·L-1瓊脂,pH 值5.8;T2 ∶1/2MS +0.2 mg·L-1IBA + 1.0 mg·L-1KT+30 g·L-1蔗糖+8.2 g·L-1瓊脂,pH 值5.8;T3:WPM +0.2 mg·L-1IBA+30 g·L-1蔗糖+8.2 g·L-1瓊脂,pH 值5.8。 每個(gè)葡萄品種選擇經(jīng)過(guò)啟動(dòng)培養(yǎng)萌發(fā)的新芽(梢)≥10 個(gè),接種在上述3 種培養(yǎng)基上,記為第1 代。 每45 d 繼代一次,記錄前3 代的繁殖體增殖系數(shù)和生根率。 繼代增殖系數(shù)是以每個(gè)莖段作為一個(gè)繁殖體,繼代一次可獲得多個(gè)用于繁殖下一代的莖段(繁殖體),上下兩代之間繁殖體數(shù)量之比值,取平均值。 生根率是統(tǒng)計(jì)每個(gè)繁殖體是否發(fā)生不定根,每代發(fā)生不定根的繁殖體數(shù)與總繁殖體數(shù)之比值,按百分率計(jì)算,取平均值。 培養(yǎng)環(huán)境:光照強(qiáng)度為30 ～40 μmol·m-2·s-1,光照時(shí)間為14 h·d-1,培養(yǎng)溫度為25±2℃。

1.2.3 馴化移栽 選擇繼代培養(yǎng)45 d 生長(zhǎng)健壯的組培苗,水清洗根部殘留的培養(yǎng)基,放入裝有改良的霍格蘭德半營(yíng)養(yǎng)液(霍格蘭德?tīng)I(yíng)養(yǎng)液的大量元素用量減半)的廣口瓶中,室內(nèi)自然光下覆膜培養(yǎng)2 周,再用全霍格蘭德?tīng)I(yíng)養(yǎng)液練苗(去膜)1～2 周(去膜時(shí)注意觀察組培苗是否萎蔫,若2h 后仍不萎蔫則去膜培養(yǎng)),每周更換營(yíng)養(yǎng)液。

水培煉苗結(jié)束后,移栽至營(yíng)養(yǎng)缽(直徑6.5 cm)中,營(yíng)養(yǎng)土和蛭石按1 ∶1(v ∶v)混合。 搭建小拱棚,保溫(25± 2℃)保濕(相對(duì)濕度100%),注意通風(fēng)換氣。移栽后第4 周即可去掉覆蓋物[12]。 統(tǒng)計(jì)移栽后組培苗的成活率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2013 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 恒溫水浴處理時(shí)間對(duì)葡萄休眠枝條萌發(fā)的影響

45℃恒溫水浴處理葡萄休眠枝條,在約2 周開(kāi)始萌發(fā)新芽,3 周后新芽長(zhǎng)至10 ～15 cm 長(zhǎng)度,可以作為無(wú)菌接種的外植體。 不同水浴處理時(shí)間,休眠枝條的萌芽率不同,其中以處理1.5 h 的萌芽率最高(97.62%),處理3 h 的萌芽率次之(95.12%),處理4 h 的萌芽率最低(86.21%)。 結(jié)果表明,45℃恒溫水浴處理1.5 h 可以有效打破葡萄枝條休眠。

2.2 不同濃度次氯酸鈉溶液消毒對(duì)葡萄外植體成活的影響

高濃度(3%)次氯酸鈉表面消毒處理,外植體在消毒后逐步出現(xiàn)紅褐化現(xiàn)象,有時(shí)褐化延展至新萌芽的腋芽,使莖段上的腋芽不能正常萌發(fā)(圖1-A);而減少消毒時(shí)間,外植體褐化程度有所降低,但污染率高,接種成活率低。 低濃度(0.3%～0.5%)次氯酸鈉進(jìn)行較長(zhǎng)時(shí)間消毒,外植體能夠保持正常綠色,幼嫩的莖段不出現(xiàn)褐化,外植體污染率低,且萌發(fā)的芽體生長(zhǎng)良好(圖1-B)。 夏黑葡萄外植體在高濃度和低濃度次氯酸鈉消毒處理的接種成活率分別60.0%和100.0%,紅地球分別為50.0%和88.7%,巨峰分別為57.1%和87.5%,玫瑰香分別為52.0%和93.9%。 結(jié)果表明,低濃度次氯酸鈉消毒效果好。

2.3 不同培養(yǎng)基對(duì)葡萄莖段增殖生根培養(yǎng)的影響

圖1 不同濃度次氯酸鈉消毒處理對(duì)夏黑葡萄外植體接種成活的影響Fig.1 Effect of different concentrations of sodium hypochlorite on survival of Summer Black grape explants

圖2 4 個(gè)葡萄品種在不同培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀態(tài)(40 d)Fig.2 Growth status of plantlets of four table grape cultivars on different mediums for 40 days

增殖生根培養(yǎng)過(guò)程中,3 種培養(yǎng)基均能促進(jìn)葡萄莖段腋芽萌發(fā)和生長(zhǎng),但長(zhǎng)勢(shì)存在差異。 由圖2、圖3可知,T1 和T2 培養(yǎng)基中,葡萄莖段上的腋芽萌發(fā)率低、新梢生長(zhǎng)瘦弱、葉片皺縮下垂、培養(yǎng)后期易出現(xiàn)玻璃化和褐化現(xiàn)象,不定根發(fā)生量少,且生長(zhǎng)不良,不利于葡萄組培苗的擴(kuò)繁;T3 培養(yǎng)基中的莖段腋芽萌發(fā)率高、新梢生長(zhǎng)健壯、繼代增殖系數(shù)相對(duì)較高,根系生長(zhǎng)正常,不定根生長(zhǎng)良好,側(cè)根數(shù)量多。 繼代40 d 后,隨機(jī)選取T3 培養(yǎng)基上培養(yǎng)的9 株生長(zhǎng)健壯、生根良好的組培苗,統(tǒng)計(jì)葉片數(shù)、平均株高、主根數(shù)量及平均根長(zhǎng)。由表1 可知,夏黑和巨峰生根情況相對(duì)較好,紅地球和玫瑰香植株長(zhǎng)勢(shì)相對(duì)良好,紅地球的生根率相對(duì)較低。結(jié)果表明,T3 培養(yǎng)基為最佳培養(yǎng)基。

圖3 4 個(gè)葡萄品種在不同培養(yǎng)基上的不定根生長(zhǎng)狀態(tài)(40 d)Fig.3 Growth status of adventitious roots of four table grape cultivars on different mediums for 40 days

表1 4 個(gè)葡萄品種在T3 培養(yǎng)基上的繼代培養(yǎng)Table 1 Subculture of plantlets of four grape cultivars on T3 medium

2.4 4 個(gè)鮮食葡萄馴化移栽情況

選取繼代45 d 后的組培苗,水清洗根部殘留的培養(yǎng)基,半營(yíng)養(yǎng)液水培煉苗2 周后,生長(zhǎng)健壯,根系生長(zhǎng)良好(圖4)。 利用全營(yíng)養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)1 周后移栽至溫室內(nèi),4 周后統(tǒng)計(jì)移栽成活率,4 個(gè)品種的成活率均達(dá)100%(表2)。 結(jié)果表明,水培馴化適用于4 個(gè)鮮食葡萄品種,能有效的提高移栽成活率。

3 討論

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)無(wú)菌外植體建立、啟動(dòng)培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)和馴化移栽4 個(gè)關(guān)鍵技術(shù)的研究,建立了鮮食葡萄組培快繁體系。 將田間采集的冬季休眠葡萄枝條放入45℃恒溫水浴處理1.5 h,可有效打破枝條休眠,低于1.5 h 處理效果還有待進(jìn)一步探究。 選用葡萄長(zhǎng)新梢(10 cm)、半木質(zhì)化莖段為外植體,低濃度(0.3%～0.5%)次氯酸鈉溶液長(zhǎng)時(shí)間消毒,接種培養(yǎng)污染率較低,外植體萌芽率較高,盡管以升汞作消毒劑的污染率和褐化率均較低,但升汞具有毒性,對(duì)研究人員的身體健康有一定影響,而次氯酸鈉溶液無(wú)毒,是葡萄組培的理想消毒方式[21-22]。 長(zhǎng)新梢作為外植體消毒,傷口面少,消毒后再剪短莖段接種,可以減少褐化,有利于誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)[9]。

培養(yǎng)基的成分對(duì)葡萄組培苗增殖和生根影響顯著。 本研究中,添加0.2 mg·L-1IBA 的WPM 培養(yǎng)基中4 個(gè)葡萄品種的莖段增殖和生根效果均較好,而在1/2MS 培養(yǎng)基中,組培苗長(zhǎng)勢(shì)弱、生根較困難,這與前人研究[15-16,23]結(jié)果不同,可能與培養(yǎng)基中物質(zhì)成分的種類(lèi)(如鹽離子、有機(jī)成分、激素等)、含量不同或品種基因型有關(guān)。 與1/2MS 培養(yǎng)基相比,WPM 培養(yǎng)基中不含銨態(tài)氮、硝態(tài)氮含量降低、鈣離子含量增加,更適合葡萄組培苗的擴(kuò)增。 植物組織培養(yǎng)繼代過(guò)程中,可以通過(guò)腋芽產(chǎn)生不定芽(叢生芽)和腋芽萌發(fā)成新梢2種方式擴(kuò)繁,生長(zhǎng)素類(lèi)物質(zhì)在2 種方式中均是必需的,而細(xì)胞分裂素類(lèi)物質(zhì)在促發(fā)叢生芽的方式中是必需的[24-25],但在腋芽萌發(fā)成新梢的中不是必需的[8-9];生長(zhǎng)素類(lèi)物質(zhì)與細(xì)胞分類(lèi)素類(lèi)物質(zhì)濃度比例高,可以促進(jìn)生根[26]。 本研究中,4 個(gè)鮮食葡萄品種以腋芽萌發(fā)成新梢的方式進(jìn)行擴(kuò)繁,不產(chǎn)生叢生芽,繼代增殖系數(shù)相對(duì)較低[27-28],但新梢生長(zhǎng)與生根同時(shí)進(jìn)行,組培苗生長(zhǎng)健壯,多次繼代培養(yǎng)后無(wú)玻璃、褐化現(xiàn)象,同時(shí)簡(jiǎn)化了操作步驟。 紅地球生根率相對(duì)較低,盡管隨著繼代次數(shù)的增多,生根率有所提高,但仍不及其他3 個(gè)品種,這可能與培養(yǎng)基成分、激素種類(lèi)和比例不同有關(guān)[29],可通過(guò)調(diào)整生長(zhǎng)素類(lèi)物質(zhì)和細(xì)胞分裂素類(lèi)物質(zhì)的種類(lèi)及比例做進(jìn)一步優(yōu)化。

馴化移栽過(guò)程中,選擇長(zhǎng)勢(shì)良好、根系發(fā)達(dá)的組培苗,水培煉苗3 周后移栽在適宜的環(huán)境條件中,4 個(gè)品種組培苗的移栽成活率均達(dá)到100%,較傳統(tǒng)方法有明顯提高[6,10]。 水培馴化使用的營(yíng)養(yǎng)液中含有大量元素和微量元素,有利于組培苗的生長(zhǎng),提高組培苗的光合能力、根系吸水能力和環(huán)境適應(yīng)能力,進(jìn)而提高移栽成活率[20]。 該方法應(yīng)用于葡萄苗木生產(chǎn)中可有效提高苗木生產(chǎn)速率。 葡萄組培苗水培馴化期間可能存在葉片長(zhǎng)霉菌的現(xiàn)象,當(dāng)發(fā)生此現(xiàn)象時(shí)應(yīng)及時(shí)剪掉帶菌葉片,以免影響該植株及其周?chē)仓甑纳L(zhǎng);馴化時(shí)間可以根據(jù)組培苗的生長(zhǎng)狀態(tài)進(jìn)行調(diào)整,植株根系發(fā)達(dá)且在去膜條件下也可正常生長(zhǎng),即可進(jìn)行移栽。

4 結(jié)論

本研究建立了4 個(gè)鮮食葡萄品種組培快繁體系。以冬眠枝條恒溫水浴1.5 h 促發(fā)萌芽效果最好;最佳消毒方式為0.3%～0.5%次氯酸鈉消毒15 min;適宜的啟動(dòng)培養(yǎng)基為MS+0.2 mg·L-1IBA + 1.0 mg·L-16-BA +0.5 mg·L-1KT +4.0 mg·L-1腺嘌呤+30 g·L-1蔗糖+8.2 g·L-1瓊脂;采用只添加0.2 mg·L-1IBA 的WPM培養(yǎng)基作為繼代增殖兼生根培養(yǎng)基,有利于莖段上腋芽的萌發(fā)與根系的生長(zhǎng),但增殖系數(shù)相對(duì)較低,且紅地球生根率較低;水培馴化為有效的馴化方式,有利于大規(guī)模生產(chǎn)。 整個(gè)組培繁殖體系基本適用于4 個(gè)鮮食葡萄品種的繁育,為其商業(yè)化生產(chǎn)提供了理論參考。