嗜黏蛋白阿克曼菌
——一種潛在的益生菌

賓蕾，鄧仲良，畢玉晶，楊瑞馥

1.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院微生物流行病研究所，北京100071；2.南華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，湖南衡陽417000

腸道微生物群是指定植在人體消化道內(nèi)的微生物，它的數(shù)量多、種類復(fù)雜，由細(xì)菌、真菌、病毒和原生生物構(gòu)成。由于其中的細(xì)菌研究最為廣泛，因此，腸道微生物群又習(xí)慣地被稱為腸道菌群。正常成人的腸道菌群總重量為1～2 kg，數(shù)量至少達(dá)1014個(gè)，是人體細(xì)胞的1～10 倍，包含的基因數(shù)量是人類基因數(shù)量的150 倍[1]。眾所周知，腸道菌群不僅協(xié)助宿主消化食物及提供營(yíng)養(yǎng)成分，還對(duì)宿主的健康有著深遠(yuǎn)的影響。正常腸道菌群對(duì)宿主很多重要生理功能的維護(hù)和發(fā)揮起著非常重要的作用，一旦腸道菌群的正常穩(wěn)態(tài)遭到破壞，即生態(tài)失調(diào)，就會(huì)引發(fā)多種疾病。許多研究表明，腸道菌群在我們的生長(zhǎng)、發(fā)育、代謝等各個(gè)方面都發(fā)揮著重要作用[2-6]。因此，可以通過調(diào)節(jié)腸道菌群的結(jié)構(gòu)來實(shí)現(xiàn)改善人體健康狀態(tài)的目標(biāo)。

近年來發(fā)現(xiàn)許多疾病的發(fā)生與腸道菌群紊亂有著密不可分的關(guān)系，例如，腸道炎癥、肥胖、糖尿病等代謝綜合征往往伴隨著腸道菌群生態(tài)失調(diào)[7]，研究表明腸道微生物在宿主代謝和低度炎癥的調(diào)節(jié)中起重要作用[8-10]。以腸道原籍菌為基礎(chǔ)研發(fā)而成的益生菌有望成為許多疾病的治療新方式。但目前市場(chǎng)上銷售的大多數(shù)益生菌主要包括乳桿菌和雙歧桿菌[11]，它們分別來自厚壁菌門和放線菌門，是至今研發(fā)最為成熟的腸道益生菌。除此之外，研究發(fā)現(xiàn)在已鑒定的下一代有益微生物中，人類腸道菌群中的嗜黏蛋白阿克曼菌（Akkermansia muciniphila，AKK）是一種非常有前景的候選細(xì)菌[12]。AKK 是從人體糞便中分離培養(yǎng)的一株嚴(yán)格厭氧的腸道菌，與機(jī)體能量代謝、免疫應(yīng)答以及腸道黏蛋白的分泌密切相關(guān)，其代謝特性以及影響宿主健康的調(diào)控機(jī)制是近年來的一大研究熱點(diǎn)。

1 嗜黏蛋白阿克曼菌

AKK 的研究歷史并不長(zhǎng)，它于2004 年被荷蘭瓦赫寧根大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室的科研工作者通過厭氧培養(yǎng)從人體糞便中分離、鑒定并命名，是一種革蘭陰性嚴(yán)格厭氧的腸道細(xì)菌[13]。

AKK 隸屬疣微菌門（Verrucomicrobia），阿克曼菌科（Akkermansiaceae），阿克曼菌屬（Akkermansia）。這個(gè)屬是該科的惟一成員，是疣微菌門中的優(yōu)勢(shì)菌群，約占83%。阿克曼菌屬也是在人腸道中發(fā)現(xiàn)疣微菌門中的惟一屬。與該屬16S rRNA 基因高度相關(guān)的序列廣泛存在于脊椎動(dòng)物（如人、兔、小鼠和蟒蛇等）的腸道內(nèi)。對(duì)人糞便或活組織樣品測(cè)序發(fā)現(xiàn)，有8 條16S rRNA 基因序列與阿克曼菌屬序列相似性水平≥98%，有3 條序列與AKK 的16S rRNA 基因序列相似性＜98%，提示它們可能代表阿克曼菌屬的其他種，稱為AKK 樣菌[14]。但目前阿克曼菌屬僅有從人糞便分離的AKK 和從網(wǎng)狀蟒蛇糞便中分離的嗜多糖阿克曼菌（A.glycaniphila）2 種[15]，且AKK 是疣微菌門中第一個(gè)被成功分離和鑒定的腸道菌種[16]。

2 AKK 在人體中的定植情況

2.1 AKK 主要定植部位

AKK 樣菌存在于母乳中和消化道的不同解剖部位如口腔、胰腺、膽系統(tǒng)、小腸、闌尾和大腸中[17]。此外，在敗血癥和肝硬化患者血液中也檢測(cè)到AKK 樣菌的序列，并從敗血癥患者血液中分離得到了AKK[18-20]。但定植在這些部位的AKK，其功能可能與定植在結(jié)腸黏液層的AKK 不同。整個(gè)消化道都存在AKK 樣菌，表明該菌可能具有更多的功能尚未發(fā)現(xiàn)。在此，我們主要關(guān)注AKK定植最為豐富的腸道部位。

腸上皮細(xì)胞覆蓋著黏液層，該黏液層一方面能吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，為微生物提供生長(zhǎng)能源；另一方面還可保護(hù)腸上皮細(xì)胞抵御有毒物質(zhì)和病原菌的侵襲，是機(jī)體重要的保護(hù)屏障[21-25]。黏液層中黏液的主要成分為黏蛋白，AKK 有著降解黏蛋白的特性，因此它主要定植在黏液層，豐度通常占腸道微生物群的1%～3%。

2.2 AKK 在健康人群的定植差異

AKK 存在于人體腸道中，人類整個(gè)生命的不同階段都有AKK[26-27]。2007 年，Collado 等根據(jù)AKK 的16S rRNA 基因序列可變區(qū)設(shè)計(jì)了特異性引物AM1 和AM2，并驗(yàn)證了該引物對(duì)在60℃復(fù)性時(shí)是AKK 特異的，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為327 bp。研究人員通過16S rRNA 熒光原位雜交（FISH）和實(shí)時(shí)定量PCR（qPCR）對(duì)歐洲不同年齡段的健康受試者糞便樣本進(jìn)行分析，證明AKK 廣泛存在于人腸道中，平均定植率約為74.70%。在兒童早期AKK就在腸道內(nèi)定植（檢測(cè)到糞便中AKK 濃度為102～104CFU/g），并在一年內(nèi)就接近健康成人（AKK 濃度為105～108CFU/g）水平，而老年受試者糞便中的AKK 含量比成人低[26]。在芬蘭、德國(guó)和馬拉維等國(guó)家[28-30]，嬰兒腸道中存在AKK 或疣微菌門細(xì)菌。因此，嬰兒腸道中AKK 的存在被認(rèn)為是腸道微生物群發(fā)育和多樣性的標(biāo)志。但上述研究結(jié)果并不完全適用于不同國(guó)家的人群，如中國(guó)南方人群中AKK 定植率約為51.74%，遠(yuǎn)低于歐洲人群，而老年人糞便中AKK 數(shù)量卻比年輕人高[31]。此外，Kong 等通過對(duì)16S rRNA 基因V4-V5 區(qū)測(cè)序，研究168 位來自中國(guó)四川都江堰和雅安的人（67 位長(zhǎng)壽老人，54 位老年人，47 位年輕人）的糞便菌群，發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)壽老人菌群的多樣性更高，健康的衰老狀態(tài)與腸道菌群有關(guān)，尤其是在長(zhǎng)壽老人糞便中梭菌屬XIVa、瘤胃菌科、AKK 及Christensenellaceae 科的相對(duì)豐度均較高[32]；另一項(xiàng)研究也發(fā)現(xiàn)百歲老人或人瑞（年齡為105 歲以上）的糞便中AKK 具有更高的濃度，因此，該細(xì)菌被認(rèn)為在長(zhǎng)壽人群的免疫和代謝健康中發(fā)揮重要作用，也可能成為健康衰老的生物標(biāo)志物之一[33-34]?？紤]到地域不同、人群居住環(huán)境和飲食結(jié)構(gòu)差異對(duì)菌群定植的影響，還需要進(jìn)一步對(duì)年齡與AKK的相關(guān)性進(jìn)行分析。

2.3 AKK 的定植與疾病的關(guān)系

許多研究表明AKK 的存在與人體健康相關(guān)。多數(shù)疾病狀態(tài)下，AKK 的豐度明顯低于健康人群，呈負(fù)相關(guān)。例如，與健康人群相比，AKK 在炎癥性腸病（IBD）患者中的豐度降低[35-36]；急性闌尾炎患者體內(nèi)AKK 數(shù)量減少，且其豐度與闌尾炎的嚴(yán)重程度成反比[37]。此外，AKK 的豐度也與盲腸炎、青少年自閉癥[35,38]等疾病呈負(fù)相關(guān)性。

目前關(guān)于AKK 與代謝疾病關(guān)系的研究頗多。肥胖兒童中AKK 數(shù)量顯著減少[39]，且有研究證實(shí)通過AKK 的定植可以減少體內(nèi)脂肪堆積，有利于降低體重[40]。因此，AKK 可作為潛在的肥胖判定指標(biāo)。此外，在糖尿病前期和Ⅱ型糖尿病期間，疣微菌綱的豐度顯著降低[41]。AKK 與Ⅱ型糖尿病的幾項(xiàng)生化指標(biāo)也顯示出負(fù)相關(guān)[42]。最近，H?nninen 等發(fā)現(xiàn)[43]，在發(fā)病率較高的Ⅰ型糖尿病小鼠模型中，腸道菌群中缺少AKK。這與其他研究是一致的，即在人體及小鼠中，腸道菌群中AKK 的豐度與Ⅰ型糖尿病呈負(fù)相關(guān)，提示AKK 在Ⅰ型糖尿病中起保護(hù)作用。研究者提出AKK 的保護(hù)機(jī)制可能是促進(jìn)黏液產(chǎn)生以使黏液層增厚，通過促進(jìn)Foxp3+Treg 細(xì)胞、IL-10、TGF-β的增加以減少胰島炎癥[43-44]。早期研究證明通過給小鼠灌胃AKK 可以防止肥胖和相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生[40,45]。高脂飲食小鼠中AKK 在體內(nèi)定植是降低的，而在飲食中添加AKK 可使體重、空腹血糖、胰島素抵抗及內(nèi)毒血癥恢復(fù)正常。值得注意的是這些疾病常伴有腸道功能紊亂和腸道屏障完整性受損，因此，腸道黏液減少進(jìn)而導(dǎo)致AKK 的定植減少；而腸道通透性增加導(dǎo)致腸道的內(nèi)毒素進(jìn)入機(jī)體，血漿脂多糖水平升高或細(xì)菌移位，從而引起炎癥和代謝紊亂等病理狀況。因此，后續(xù)研究須進(jìn)一步考慮微生物群與黏液層完整性的關(guān)系。

酒精性肝炎（ASH）患者糞便中的AKK 豐度同樣低于健康人，間接表明AKK 與肝臟疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)。同樣地，通過酒精灌胃野生型小鼠可顯著降低AKK 的豐度，而口服AKK 可恢復(fù)酒精導(dǎo)致該菌的減少。研究表明，AKK 可預(yù)防性減少肝損傷、脂肪肝和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，防止酒精誘導(dǎo)的腸漏，增加腸道黏液層厚度和緊密連接蛋白的表達(dá)，還可治療性改善酒精性肝?。ˋLD）患者的肝損傷和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)[46]。

2017 年Science發(fā)表的一篇關(guān)于AKK 的報(bào)道使其受到更多的關(guān)注，來自法國(guó)Gustave Roussy癌癥研究所的Zitvogel 教授帶領(lǐng)她的團(tuán)隊(duì)給出了非常轟動(dòng)的結(jié)果：AKK 在增加癌癥免疫治療效果方面有非常顯著的作用。研究人員對(duì)249 名接受免疫抑制劑治療的癌癥患者進(jìn)行觀察，其中69 名在使用免疫抑制劑的同時(shí)還接受了廣譜抗生素治療。經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)，在接受抗生素治療的患者群體中，癌癥復(fù)發(fā)概率更高，并且接受治療后存活時(shí)間短，平均總生存期為11.5 個(gè)月，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于未接受抗生素治療患者的20.6 個(gè)月。而在研究過程中，發(fā)現(xiàn)免疫治療效果好的患者體內(nèi)，其腸道菌群更豐富，尤其是AKK 的存在使患者免疫治療效果更好。為驗(yàn)證這種相關(guān)性，研究人員將具有良好免疫治療效果患者的糞便移植到無菌小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)免疫效果高于那些未經(jīng)移植的小鼠；對(duì)無免疫反應(yīng)的無菌小鼠給予口服AKK，再用免疫抑制劑來治療，發(fā)現(xiàn)免疫得到恢復(fù)，小鼠體內(nèi)的腫瘤幾乎完全消失[47-48]。這一研究首次證明了AKK 在免疫反應(yīng)中的作用，說明腸道微生物在免疫治療中同樣發(fā)揮重要作用。

上述研究均表明AKK 與健康狀態(tài)密切相關(guān)，AKK 可能作為某些疾病的生物標(biāo)志物，也可能成為一種極具前景的益生菌，尤其是在糖尿病、肥胖、代謝紊亂等相關(guān)疾病的預(yù)防和治療方面具有極大的潛力，對(duì)未來研究和開發(fā)具有重要意義。

3 AKK 的生物學(xué)特性及其在宿主中的代謝

AKK 最初由Derrien 等描述[13]，是一種橢圓形、非運(yùn)動(dòng)型、不產(chǎn)芽孢的厭氧革蘭陰性細(xì)菌，可單獨(dú)或成對(duì)生長(zhǎng)，在含有黏蛋白的培養(yǎng)基中還可抱團(tuán)生長(zhǎng)。該細(xì)菌在黏蛋白培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)，在透射電鏡下可見存在由莢膜聚合物構(gòu)成的絲狀結(jié)構(gòu)。AKK 基因組中存在許多編碼黏蛋白降解酶的基因，共78 個(gè)基因（占總基因的14%）被注釋為可參與黏液降解，編碼糖苷酶、唾液酸苷酶、蛋白酶和硫酸酯酶等[14,49-50]。而AKK 降解黏蛋白這一特性恰恰決定了它定植于黏蛋白豐富的腸道黏液層中的偏好。

腸黏液是由杯狀細(xì)胞合成并分泌的，覆蓋腸細(xì)胞，形成松散而堅(jiān)固的黏液層，分為2 層：一層是沒有細(xì)菌的內(nèi)黏液層，一層是較厚的含有共生細(xì)菌的多層外黏液層[51-52]。黏液的主要成分為黏蛋白，黏蛋白是AKK 的營(yíng)養(yǎng)源，它由大量O-連接聚糖修飾的肽骨架組成，肽骨架富含蘇氨酸、絲氨酸、半胱氨酸和脯氨酸，聚糖由多糖或糖基團(tuán)，含有甘露糖、半乳糖、巖藻糖和N-乙?；禾前?，如N-乙酰-葡萄糖胺（Glc-NAc）或N-乙酰-半乳糖胺（Gal-NAc）[53]。AKK 存在于該黏液層中并代謝黏液，同時(shí)產(chǎn)生乙酸鹽和丙酸鹽，由黏蛋白酶釋放的糖也促進(jìn)其他細(xì)菌產(chǎn)生丁酸鹽[54]。

像許多厭氧菌一樣，AKK 被描述為產(chǎn)生短鏈脂肪酸（SCFAs）的發(fā)酵細(xì)菌。AKK 能夠發(fā)酵的糖類包括半乳糖、巖藻糖、葡萄糖、Glc-NAc 和Gal-NAc，但這些糖僅在黏蛋白或大量胰蛋白酶消化物或酪蛋白存在下才有可能降解[55]。由于黏液降解，AKK 產(chǎn)生寡糖和SCFAs，這些產(chǎn)物可以刺激微生物群的相互作用和宿主反應(yīng)。寡糖和乙酸鹽可以刺激靠近黏液層定植細(xì)菌的生長(zhǎng)和代謝活動(dòng)，同時(shí)抵抗那些必須穿過黏液層才能到達(dá)腸細(xì)胞的致病菌。由AKK 產(chǎn)生的丙酸鹽可以通過短鏈脂肪酸受體43（Gpr43）作用于腸道組織，而其他SCFAs 也可以通過Gpr41 向宿主發(fā)出信號(hào)[56-57]，從而觸發(fā)宿主表達(dá)機(jī)制的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，并與其他信號(hào)通路一起，在僅有AKK 定植的無菌小鼠中產(chǎn)生免疫刺激和代謝信號(hào)達(dá)到免疫調(diào)節(jié)作用[58]。

最近的研究表明，盡管AKK 用黏蛋白作為營(yíng)養(yǎng)源，但其與人類和動(dòng)物的黏液厚度和腸屏障完整性呈正相關(guān)[26,40,59-60]，例如，AKK 的補(bǔ)充增加了小鼠產(chǎn)生黏液杯狀細(xì)胞的數(shù)量[61]。AKK 促進(jìn)黏液厚度的機(jī)制尚未完全清楚，很可能是一方面降解黏液蛋白生成許多短鏈脂肪酸，而短鏈脂肪酸是宿主上皮細(xì)胞合成和分泌黏液蛋白較好的能量來源；另一方面，黏液蛋白的降解可刺激杯狀細(xì)胞產(chǎn)生更多新的黏蛋白，以降低宿主蛋白的沉積，而新生黏蛋白又刺激AKK 的生長(zhǎng)，二者形成正反饋回路，這種良性循環(huán)使腸道黏液層不斷更新，對(duì)腸上皮細(xì)胞也可起到良好的保護(hù)作用。

4 AKK 的分離培養(yǎng)

4.1 AKK 分離的概況

最近，研究人員從網(wǎng)狀蟒蛇糞便中分離出與AKK 基因序列有95%相似度的細(xì)菌，命名為嗜多糖阿克曼菌[13,15]。2016 年，我國(guó)學(xué)者從172 份中國(guó)南方成人糞便樣本中分離得到22 株AKK，并將它們分為12 個(gè)基因型，不同受試者體內(nèi)的基因型別不同，其中3 個(gè)受試者中呈現(xiàn)多種基因型[31]。隨后，該團(tuán)隊(duì)測(cè)序分析了來自人和小鼠糞便的39 株AKK，共鑒定出5644 個(gè)獨(dú)特蛋白，遺傳發(fā)育分析可將它們分為3 個(gè)譜系類群，分別表現(xiàn)出不同的代謝及功能特征[62]。

從人糞便中首次分離AKK 已有10 余年，在最初的5 年里，每年僅有1 篇關(guān)于AKK 的報(bào)道。自2010 年后AKK 逐漸受到關(guān)注，關(guān)于它與人體健康和疾病間關(guān)系的研究開始明顯增多，但其分離培養(yǎng)方法的優(yōu)化還處于停滯狀態(tài)，如何快速分離和分型一直是研究瓶頸。現(xiàn)階段的研究重點(diǎn)應(yīng)關(guān)注從更多不同宿主體內(nèi)分離大量AKK 菌株，并分析其基因和生理功能差異，尋找其中的特異菌株，為后續(xù)探索其與人體健康關(guān)系的研究提供新的支撐。因此，需要加大AKK 分離培養(yǎng)規(guī)模，并應(yīng)著眼于AKK 培養(yǎng)條件的優(yōu)化，為建立快速、準(zhǔn)確的分離、純化和鑒定技術(shù)奠定基礎(chǔ)。

4.2 分離AKK 的樣本選擇

如何順利準(zhǔn)確地從人體中分離出AKK，樣本的選擇尤其重要，需要先確保所選對(duì)象中含有豐富的AKK，才能為后續(xù)分離培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的開展提供保障。在小鼠模型中，Derrien 等將AKK 定植于無菌小鼠體內(nèi)，由于大部分的黏蛋白都在盲腸中產(chǎn)生[58]，因此該菌在盲腸中的定植數(shù)量最高。在倉鼠禁食實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)禁食后的倉鼠體內(nèi)AKK 豐度顯著升高[63]。還有使用萬古霉素處理糖尿病小鼠模型，發(fā)現(xiàn)該抗生素的處理可使小鼠體內(nèi)疣微菌門的相對(duì)豐度由10%左右升高至87%[64]。用二甲雙胍（常用的治療Ⅱ型糖尿病藥物）處理小鼠后，其體內(nèi)的AKK 豐度也顯著升高[61]。此外，增加AKK 豐度的方法還包括攝入雙歧桿菌、低聚果糖、短鏈碳水化合物（FODMAP）、大黃提取物或特定抗生素等[65]。因此，欲從不同物種體內(nèi)分離出AKK，可考慮使用上述刺激條件以提高動(dòng)物體內(nèi)AKK 豐度，利于順利分離得到該細(xì)菌。

上述所提到的提高體內(nèi)AKK 豐度的方式皆基于動(dòng)物模型，為分離該菌對(duì)人群實(shí)施干預(yù)是不可行的。但AKK 在人體的定植狀態(tài)較為穩(wěn)定，在健康人群腸道中其豐度通常占1%～3%，而在腸炎病患者、超重肥胖人群及Ⅱ型糖尿病患者體內(nèi)AKK 的數(shù)量和豐度均較正常人低[39]。但通過膳食控制或服用益生元，可改善健康狀況使得AKK 豐度得到恢復(fù)甚至升高，同時(shí)避免高脂飲食和大量飲酒導(dǎo)致的腸道內(nèi)AKK 豐度的降低[40,66-67]。合理飲食、健康作息、適當(dāng)運(yùn)動(dòng)對(duì)維持人腸道內(nèi)較高AKK 豐度是有幫助的。故在選擇研究對(duì)象時(shí)要綜合考慮上述因素，選擇合適人群收集糞便作為樣本，更有利于實(shí)驗(yàn)的順利開展。

4.3 AKK 培養(yǎng)條件的選擇及改進(jìn)

AKK 在20～40℃和pH5.5～8.0 時(shí)都能夠生長(zhǎng)，最佳溫度為37℃，最佳pH 值為6.5，孵育時(shí)間為3～7 d[13]。AKK 在最初的文獻(xiàn)報(bào)道中被描述為嚴(yán)格厭氧生長(zhǎng)，所需生長(zhǎng)條件為：182 kPa、80%N2、20% CO2[13]；或90% N2、10% CO2[68]；或85% N2、10% CO2、5% H2[69]；或100% N（2ATCC 推薦）。在這些條件下均能順利培養(yǎng)出AKK，并達(dá)到實(shí)驗(yàn)所需的菌濃度。但近期研究發(fā)現(xiàn)，與人類腸道微生物群的許多其他成員相比，AKK 是一種耐氧厭氧菌而不是嚴(yán)格的厭氧菌。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明[70]，AKK在厭氧和有氧環(huán)境下的生長(zhǎng)無差別，將其放置在大氣常氧水平條件下1 h，80%的AKK 仍保持細(xì)胞活性，表明該細(xì)菌能夠在環(huán)境空氣中存活，也說明該細(xì)菌不是對(duì)氧高度敏感的嚴(yán)格厭氧菌，而是具備一定的耐氧能力。

自首次成功分離AKK 后，用于其分離的培養(yǎng)基——黏蛋白基礎(chǔ)培養(yǎng)基一直沿用至今。AKK可利用胃腸道黏蛋白作為惟一的碳源和氮源進(jìn)行生長(zhǎng)，黏蛋白培養(yǎng)基也是目前惟一的選擇性培養(yǎng)基。2016 年，我國(guó)研究者用該黏蛋白基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行選擇增菌，并在篩選過程中進(jìn)行改進(jìn)，挑取在平板上生長(zhǎng)的單克隆接種至添加了萬古霉素的還原性巧克力培養(yǎng)基中進(jìn)行純化，最終順利分離得到AKK。在培養(yǎng)基中添加適量的萬古霉素（5 μg/mL），可在抑制革蘭陽性菌生長(zhǎng)的同時(shí)刺激AKK 生長(zhǎng)，更利于該細(xì)菌的分離篩選。但黏蛋白基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配制過程十分復(fù)雜，須添加多種微量元素，在日常實(shí)驗(yàn)工作中培養(yǎng)基的配制極其耗時(shí)。之后的許多研究中，發(fā)現(xiàn)在腦心浸液肉湯（BHI）或哥倫比亞肉湯（CBA）培養(yǎng)基中添加一定的黏蛋白來培養(yǎng)AKK，均能滿足其生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)要求[15,59,61,71-73]。

目前，已知的適合培養(yǎng)AKK 的培養(yǎng)基均含有動(dòng)物成分，而來源于動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)成分可能含有病毒、朊病毒、過敏原或細(xì)菌污染物，今后若將AKK的培養(yǎng)物用于人類食品或藥品會(huì)受到質(zhì)疑。2016 年，Belzer 等對(duì)培養(yǎng)AKK 的培養(yǎng)基進(jìn)行了改造，并申請(qǐng)了專利[74]。他們用16 g/L 大豆蛋白胨加上25 mmol/L 混合糖（葡萄糖和N-乙酰葡萄糖胺）代替動(dòng)物源的黏蛋白，觀察到AKK 生長(zhǎng)良好。此外，還發(fā)現(xiàn)通過添加一定量的蘇氨酸或酵母提取物等也可刺激其生長(zhǎng)。在該化學(xué)限定培養(yǎng)基上可獲得高產(chǎn)量，有利于AKK 的大規(guī)模生產(chǎn)，滿足了在食品、飼料或藥物等方面的應(yīng)用。同年，Plovier 等[75]在實(shí)驗(yàn)中重復(fù)了該培養(yǎng)基的使用方案，結(jié)果發(fā)現(xiàn)能夠達(dá)到與傳統(tǒng)黏蛋白基礎(chǔ)培養(yǎng)基相近的培養(yǎng)效果。2017 年，我國(guó)學(xué)者改良了黏蛋白基礎(chǔ)培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)條件[76]，通過添加篩選到的生長(zhǎng)刺激因子來提高AKK 的生長(zhǎng)速度和菌液濃度。研究發(fā)現(xiàn)，AKK 在添加了低聚木糖、低聚半乳糖、環(huán)糊精和索萊寶蛋白酶酶解雞蛋清這4 種生長(zhǎng)刺激因子的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速度快。其中10 g/L 索萊寶蛋白酶酶解雞蛋清、5 g/L 環(huán)糊精、5 g/L 低聚半乳糖的組合物對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)促進(jìn)效果最好，可使AKK 的生長(zhǎng)時(shí)間由原來的5～6 d 縮短為24～36 h，且菌液D600nm值也由0.0697 升至0.7197，極大地促進(jìn)了AKK 的生長(zhǎng)。

5 結(jié)語

下一代益生菌產(chǎn)品包括擬桿菌屬、梭菌屬、阿克曼菌、糞桿菌屬等[77]，其中AKK 作為一種潛在的腸道益生菌已成為研究熱點(diǎn)。AKK 可以降低肥胖、糖尿病患者的炎癥反應(yīng)，改善腸道的屏障功能，還可以調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫應(yīng)答，維持體內(nèi)代謝平衡，在癌癥免疫治療中也發(fā)揮著顯著增效作用。這些都表明AKK 在腸道中的定植狀態(tài)與宿主的健康息息相關(guān)。基于AKK 如此強(qiáng)大的益生作用，需要對(duì)其深入研究，為后續(xù)益生菌微生態(tài)制劑的研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。而這些研究與開發(fā)，都離不開AKK 菌株的培養(yǎng)與篩選。

作為腸道潛在的益生菌，AKK 也可能具有潛在致病性，其安全性有待研究。下一代益生菌產(chǎn)品是“雙刃劍”，所以對(duì)菌株的安全性評(píng)價(jià)是首要問題，與傳統(tǒng)益生菌產(chǎn)品（乳酸菌、雙歧桿菌）相比，下一代益生菌產(chǎn)品在使用上須嚴(yán)格限定適用人群，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)施用。同時(shí)，還應(yīng)重視下一代益生菌菌株抗生素耐藥性基因在食物鏈中播散的評(píng)估，保證菌株對(duì)抗生素的藥物敏感性。而針對(duì)AKK，目前研究者還聚焦在早期的安全性研究和菌株適宜性研究[78]。雖然阿克曼屬是宿主腸道中廣泛定植菌屬，目前還沒有表現(xiàn)出任何致病性[79]，但AKK 在不同物種體內(nèi)定植表達(dá)和功能調(diào)控具有一定的差異，發(fā)揮的作用也不盡相同。同一種益生菌的不同菌株之間對(duì)宿主健康的影響也是存在差異的[80]，因此，為研究菌株和疾病間的因果關(guān)系，研究者不能只把培養(yǎng)目標(biāo)定在種水平上，而應(yīng)盡可能地建立菌株水平的菌種庫以供篩選和鑒定，同時(shí)研究其分子作用機(jī)制，為人類健康助力。