單鏈抗體在畢赤酵母中表達(dá)的研究進(jìn)展

林婷，黃義德

福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建福州350100

抗體經(jīng)歷了四代：一代抗體為異源多克隆抗體，特異性不好；二代抗體為鼠源單克隆抗體，可大量生產(chǎn)高純度的單抗，特異性高；三代抗體為基因工程產(chǎn)生的人源化單克隆抗體，減少了鼠源抗體帶來的免疫排斥問題；第四代抗體為全人源單克隆抗體。從鼠源抗體到人鼠嵌合抗體再到人源化抗體，以及發(fā)展到現(xiàn)在的全人源抗體，逐漸解決了人體的免疫排斥問題[1]。由于全尺寸的抗體通常是相對(duì)分子質(zhì)量約150×103的免疫球蛋白G1 形式，這種大分子存在2 個(gè)基本問題：一是它們對(duì)組織（如實(shí)體瘤）的滲透性差；二是與某些分子表面上的區(qū)域（如人類免疫缺陷病毒包膜糖蛋白）的結(jié)合不良或結(jié)合不上，而那些區(qū)域能夠被較小尺寸的分子結(jié)合[2]?？贵w作為治療性藥物并非每個(gè)部分都是必需的，有報(bào)道顯示若只有與抗原結(jié)合的可變區(qū)的存在，抗體依舊能夠發(fā)揮其作用。因此，科研人員研制出了多種形式的小分子抗體，如單域抗體、單鏈抗體和雙體抗體。片段抗體越小半衰期越短，單域抗體的半衰期只有幾分鐘[1]，單鏈抗體（single-chain variable fragment，scFv）的半衰期相對(duì)較長一些，在體內(nèi)降解較單域抗體慢。單鏈抗體是通過15～20 個(gè)氨基酸殘基的短肽（linker）將一條抗體重鏈可變區(qū)和一條輕鏈可變區(qū)連接起來的。缺乏恒定區(qū)的單鏈抗體依舊能夠穩(wěn)定地與抗原特異性結(jié)合并發(fā)揮作用[3]。單鏈抗體相對(duì)分子質(zhì)量只有25×103，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，可溶，并且易于采用微生物表達(dá)獲得。目前，單鏈抗體在醫(yī)學(xué)方面主要用于抗腫瘤、抗病原生物、自身免疫疾病研究、心血管疾病研究以及抗輻射損傷等；在食品安全方面主要用于食品毒素檢測、農(nóng)獸藥物殘留檢測以及食品中重金屬污染檢測。因此單鏈抗體的需求量日益增長，其大量獲得與制備一直是研究的焦點(diǎn)。

1 單鏈抗體的發(fā)展及應(yīng)用

1.1 單鏈抗體的發(fā)展

單鏈抗體最早是在駱駝科動(dòng)物的血清中發(fā)現(xiàn)的，之后于1988 年，首次被Bird 和Huston 研制獲得[4]。只由一條輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)組成的單鏈抗體稱作單價(jià)單鏈抗體。在單鏈抗體制備技術(shù)逐漸成熟的過程中，研究人員對(duì)單鏈抗體進(jìn)行了改進(jìn)，繼單價(jià)單鏈抗體之后出現(xiàn)了單鏈抗體多聚體。該抗體是經(jīng)過縮短其linker 的長度，使得多個(gè)單鏈抗體結(jié)合在一起，增加了針對(duì)抗原的特異性。1993 年，Holliger 等同時(shí)表達(dá)了2 種不同特異性的單鏈抗體，其能同時(shí)與不同的抗原結(jié)合，于是稱之為雙特異性單鏈抗體[5]。

迄今，單鏈抗體所運(yùn)用的展示系統(tǒng)有噬菌體展示系統(tǒng)、核糖體展示系統(tǒng)和酵母表面展示系統(tǒng)；其表達(dá)系統(tǒng)有原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲表達(dá)系統(tǒng)及植物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)；其運(yùn)用到的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)有磷酸鈣共沉淀技術(shù)、脂質(zhì)體技術(shù)和電穿孔技術(shù)[6]。

1.2 單鏈抗體的應(yīng)用

單鏈抗體屬于小分子抗體，穿透性好，靶向性好，副作用小，在醫(yī)學(xué)和食品安全方面都有廣泛的應(yīng)用。

在抗腫瘤中單鏈抗體用于靶向治療，治療形式主要有靶向性病毒載體、靶向脂質(zhì)體及單鏈抗體融合蛋白等。單鏈抗體還可用于腫瘤的影像分析，經(jīng)過放射性同位素標(biāo)記的單鏈抗體可輕易滲入腫瘤形成清晰的影像，從而達(dá)到特異性放射治療。例如，IFN-γ與碘標(biāo)記的scFv 使得腫瘤顯像效果極強(qiáng)[7]。

在抗病原微生物方面，單鏈抗體已經(jīng)用于丙肝病毒、乙肝病毒、狂犬病病毒和牛冠狀病毒等常見病毒。胡娟制備了抗狂犬病毒磷蛋白單鏈抗體-堿性磷酸酶融合蛋白，初步應(yīng)用獲得了很好的效果[8]。單鏈抗體也用于抗動(dòng)植物各種致病細(xì)菌的研究，鄭子欽制備了抗丁香假單胞菌HrpA單鏈抗體[9]。單鏈抗體也可用于抗寄生蟲，單超構(gòu)建了抗利什曼原蟲表面糖蛋白的單鏈抗體庫，為后續(xù)的該抗體應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)[10]。

單鏈抗體在抗自身免疫疾病、抗心血管疾病以及抗輻射損傷方面也都有研究。在艾滋病治療上已制備出單鏈抗體b12-scFv、ScAb2219 等[11]；在心血管疾病上已制備了抗膽固醇酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的scFv 等；抗Ras 單鏈抗體則能夠抗輻射損傷[12]。

單鏈抗體在食品安全方面主要用于食品毒素檢測、農(nóng)獸藥物殘留檢測以及食品中重金屬污染檢測[13]。

2 單鏈抗體在畢赤酵母中的重組表達(dá)

單鏈抗體的表達(dá)系統(tǒng)類型如上述，這些表達(dá)系統(tǒng)都有各自的優(yōu)點(diǎn)和不足。酵母表達(dá)系統(tǒng)包括畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)和釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)。畢赤酵母惟一的碳源為甲醇，屬于甲醇營養(yǎng)型酵母。相對(duì)于釀酒酵母，畢赤酵母含有一個(gè)強(qiáng)有力的受到嚴(yán)格調(diào)控的啟動(dòng)子醇氧化酶1（AOX1），可以進(jìn)行高密度發(fā)酵，且分泌效率比釀酒酵母高[14]。

與其他表達(dá)系統(tǒng)相比，畢赤酵母具有表達(dá)菌株穩(wěn)定、表達(dá)質(zhì)粒不易丟失、可高密度發(fā)酵、表達(dá)周期短、操作簡單、成本低、能對(duì)表達(dá)的外源蛋白進(jìn)行有限的翻譯后加工修飾，以及幾乎沒有人類致病病毒感染風(fēng)險(xiǎn)等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已成為重要的工業(yè)微生物。近年基因組測序的完成以及轉(zhuǎn)錄組和蛋白組數(shù)據(jù)的積累，為研究者提供了清晰的畢赤酵母遺傳背景[15]。人源化糖基化菌株的工程化，意味著除了酶和堿性蛋白質(zhì)之外，還可以產(chǎn)生更復(fù)雜的蛋白質(zhì)，使得抗體或抗體片段能夠擁有更高的生物活性。同時(shí)標(biāo)準(zhǔn)的分子遺傳操作方法和CRISPR-Cas9 技術(shù)的建立，已經(jīng)為畢赤酵母在合成生物學(xué)上的應(yīng)用鋪平了道路[16]。

雖然畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)在表達(dá)外源蛋白上有很大的優(yōu)勢，但不同來源的蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)量存在差異，已經(jīng)有許多外源蛋白的表達(dá)量達(dá)到克每升數(shù)量級(jí)，而目前單鏈抗體的表達(dá)量幾乎只能達(dá)到毫克每升數(shù)量級(jí)（表1）。因此，優(yōu)化畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)對(duì)于提高單鏈抗體表達(dá)量至關(guān)重要。

表1 單鏈抗體在畢赤酵母中的表達(dá)量

續(xù)表1 單鏈抗體在畢赤酵母中的表達(dá)量

3 提高單鏈抗體在畢赤酵母中的表達(dá)量可采取的策略

畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外源蛋白，其表達(dá)量在分子水平上的影響因素有外源基因的內(nèi)在特性、基因拷貝數(shù)、啟動(dòng)子、信號(hào)肽的選擇、糖基化修飾、分子伴侶及外源蛋白降解等；在工業(yè)化水平上，發(fā)酵條件和發(fā)酵工藝也影響了表達(dá)量。下文主要描述分子水平上的影響因素及其高表達(dá)策略。

3.1 外源基因的內(nèi)在特性

由于外源基因的內(nèi)在特性，其影響因素主要有3 個(gè)。①密碼子偏好性。不同物種的密碼子使用頻率是不一樣的，外源蛋白在畢赤酵母中表達(dá)，其中的稀有密碼子會(huì)阻礙翻譯的進(jìn)行甚至提前終止翻譯?？梢愿鶕?jù)同義密碼子的替換和畢赤酵母的密碼子使用頻率來優(yōu)化外源蛋白的基因序列，從而提高表達(dá)量[76]。有研究者將抗ErbB2 單鏈抗體進(jìn)行密碼子優(yōu)化，產(chǎn)量由1～2 mg/L 提高到6～10 mg/L[67]。②A+T 含量。畢赤酵母中轉(zhuǎn)錄提前終止信號(hào)為一段共有序列ATTATTTTA TAAA，A+T 含量高的基因容易出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄提前終止的情況，從而影響表達(dá)量?？蓪+T 含量高的序列重新設(shè)計(jì)，將A+T 的含量控制在30%～55%[77]。③mRNA 5′非翻譯區(qū)（5′UTR）。5′UTR 的長度和核苷酸成分影響了外源蛋白的表達(dá)，適當(dāng)?shù)拈L度可以使mRNA 順利進(jìn)行有效翻譯。5′UTR 的長度不合適會(huì)使核糖體40S 亞單位發(fā)生識(shí)別障礙。AOX1 基因的5′UTR 長度為114 bp 且A+U 含量高時(shí)，其編碼的醇氧化酶的表達(dá)量也非常高，因此保持外源蛋白5′UTR 與AOX1 的5′UTR 一致是必須的[78]。

3.2 基因拷貝數(shù)

外源蛋白的表達(dá)量受基因拷貝的影響，相比于單拷貝基因，多拷貝基因的表達(dá)量會(huì)高很多，可以將帶有卡那霉素抗性基因的表達(dá)載體導(dǎo)入畢赤酵母菌，使畢赤酵母獲得G418 抗性，便可通過轉(zhuǎn)化子對(duì)G418 的抗性快速篩選出拷貝數(shù)高的轉(zhuǎn)化子[79]。但并非拷貝數(shù)越多其表達(dá)量越大，當(dāng)拷貝數(shù)達(dá)到極限后無論拷貝數(shù)怎么增加，其表達(dá)量還是一樣的，甚至在有限的資源和能量的細(xì)胞內(nèi)，拷貝數(shù)過多可能會(huì)給轉(zhuǎn)錄和翻譯造成負(fù)擔(dān)，從而抑制蛋白的表達(dá)[80]。有研究者將甘露聚糖酶的拷貝數(shù)分別提高到2、4、6 倍，其表達(dá)量比單拷貝分別增加了1.7、2.2 和1.3 倍[81]。

3.3 啟動(dòng)子

一般在表達(dá)外源蛋白時(shí)選擇強(qiáng)啟動(dòng)子可以提高蛋白的表達(dá)量。然而強(qiáng)啟動(dòng)子對(duì)于有些外源蛋白來說并不能提高其表達(dá)量，因?yàn)檫^量表達(dá)有時(shí)會(huì)導(dǎo)致蛋白折疊與定位錯(cuò)誤，這些蛋白選擇弱啟動(dòng)子更具優(yōu)勢[82]。因此，啟動(dòng)子的合理選擇和使用也很關(guān)鍵。高源等構(gòu)建了AOX1 和FLD1的雙啟動(dòng)子質(zhì)粒，在畢赤酵母中表達(dá)重組FGF1蛋白，其產(chǎn)量為197 mg/L，大約是目前已知最高表達(dá)水平的2 倍[83]。

3.4 信號(hào)肽的選擇

畢赤酵母表達(dá)的外源蛋白大部分是胞外蛋白，這些蛋白分泌到胞外需要信號(hào)肽引導(dǎo)外源序列共轉(zhuǎn)錄到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，因此胞外蛋白的獲得量與信號(hào)肽的選擇息息相關(guān)。有報(bào)道，經(jīng)過改變信號(hào)肽的疏水性、改變序列、使用密碼子偏好性、進(jìn)行位點(diǎn)突變等，可以增加外源蛋白的分泌效率[80]。謝濤將畢赤酵母的信號(hào)肽序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化后，用于表達(dá)2 個(gè)突變的植酸酶phyA 基因的突變基因phyA～m 和phyA～（m-4），其酶活性較信號(hào)肽改造之前分別提高了3.95 和1.53 倍[84]。

3.5 糖基化修飾

真核生物蛋白基本上都需要糖基化修飾后才可正確折疊、分泌并具有活性。畢赤酵母中存在2 種糖基化形式，即O-糖基化與N-糖基化[79]。畢赤酵母的糖基化主要是指N-糖基化，盡管其程度比釀酒酵母要弱，但是和天然蛋白相比還是存在糖基化過度問題。研究表明，在不影響蛋白活性的情況下，對(duì)N-糖基化位點(diǎn)進(jìn)行突變、去除或引進(jìn)新的糖基化位點(diǎn)，可提高分泌蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)量及重組蛋白過度糖基化問題[82]。有研究者在疏水性角質(zhì)酶的N 端區(qū)域引入N-糖基化共有序列，分泌增加了5 倍[85]。

若表達(dá)的蛋白質(zhì)是抗體，其需要正確的糖基化模式以便抗體正確折疊。糖基化改造的人源化巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)可以產(chǎn)生具有與哺乳動(dòng)物系統(tǒng)類似的糖基化譜的糖蛋白。由人源化巴斯德畢赤酵母系統(tǒng)產(chǎn)生的治療性糖蛋白在臨床前模型中顯示出與由CHO 細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白有相當(dāng)?shù)恼郫B、穩(wěn)定性和體外體內(nèi)功效[86]。

3.6 分子伴侶

分子伴侶是具有協(xié)助細(xì)胞內(nèi)其他分子組裝及蛋白質(zhì)正確折疊功能的蛋白質(zhì)。畢赤酵母分泌的蛋白需要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上形成二硫鍵及正確折疊后運(yùn)輸至高爾基體。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，分子伴侶參與了這2 種蛋白質(zhì)修飾，分子伴侶還可以與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的新生肽相互作用保持其可溶形式[87]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的分子伴侶主要有蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶（PDI）、人免疫球蛋白結(jié)合蛋白（BIP）、鈣聯(lián)蛋白和鈣網(wǎng)蛋白。PDI 是硫氧還蛋白超家族成員，能夠催化二硫鍵的形成及幫助蛋白正確折疊；BIP能夠結(jié)合到疏水性氨基酸延伸端來穩(wěn)定未成熟的蛋白[88]。因此，分子伴侶對(duì)于畢赤酵母分泌蛋白起著重要的作用。許多研究表明，分子伴侶和外源基因一起表達(dá)，外源蛋白的表達(dá)量可以明顯提高，例如陳飛等將灰蓋鬼傘過氧化物酶與分子伴侶PDI 共表達(dá)，其酶活性較共表達(dá)之前提高了2.43 倍[89]。

3.7 外源蛋白降解

由于畢赤酵母中存在蛋白水解酶，所以外源蛋白無論是胞內(nèi)蛋白還是胞外蛋白，在表達(dá)和分泌過程中都存在被蛋白水解酶降解的風(fēng)險(xiǎn)，影響其表達(dá)量[90]，因此降低相關(guān)外源蛋白水解酶是非常必要的。有研究者敲除了畢赤酵母的相關(guān)蛋白酶基因，并證明蛋白酶基因的敲除可以提高外源蛋白的產(chǎn)量。目前已有商業(yè)化的蛋白酶缺陷畢赤酵母菌株可供選擇[91]。降低外源蛋白降解的策略還有：共表達(dá)目的蛋白和蛋白水解酶抑制劑，該策略目前還在探索階段；將目的蛋白與過氧化物酶體靶向信號(hào)連接，目的蛋白即可轉(zhuǎn)運(yùn)到過氧化物酶體中，免受蛋白酶降解；對(duì)外源蛋白序列進(jìn)行改造，去除蛋白酶作用位點(diǎn)且不改變原有蛋白性質(zhì)[80]。