基于生物信息學(xué)技術(shù)探討宮頸癌腫瘤組織中p53突變、共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)及臨床轉(zhuǎn)歸分析

趙子騫，梁新苗，張飛躍，趙培慶

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基于生物信息學(xué)技術(shù)探討宮頸癌腫瘤組織中p53突變、共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)及臨床轉(zhuǎn)歸分析

趙子騫，梁新苗，張飛躍，趙培慶

255036 山東，淄博實驗中學(xué)（趙子騫、梁新苗）；255036 山東，淄博市中心醫(yī)院婦科（張飛躍），轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心（趙培慶）

利用生物信息學(xué)技術(shù)探討 p53 在宮頸癌的突變、共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)及在疾病預(yù)后中的預(yù)測能力，為宮頸癌的診斷與預(yù)后判斷提供一定的理論基礎(chǔ)。

利用癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)庫對靶標(biāo)分子 p53 進(jìn)行檢索，發(fā)現(xiàn)其突變及可能的作用分子與網(wǎng)絡(luò)。

p53 基因在宮頸癌中的突變率約為 9%，通過 STRING 在線數(shù)據(jù)庫找到在宮頸癌中與 p53 互作分子 Bcl2，p53 的表達(dá)水平與宮頸癌預(yù)后呈正相關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)了與 p53 共同發(fā)揮生物學(xué)功能的相關(guān)分子 Bcl2，為宮頸癌的早期診斷、靶向治療及預(yù)后判斷提供了一定理論基礎(chǔ)。

宮頸癌； p53； Bcl2； TCGA數(shù)據(jù)庫； 生存期

宮頸癌雖然可以早期預(yù)防，但仍然是癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一，也是位于女性發(fā)病率第二的惡性腫瘤。它占全球女性腫瘤相關(guān)死亡人數(shù)的10% ~ 15%，每年約有 527 600 例新發(fā)病例及265 700 例死亡病例[1-2]。雖然超過 90% 的早期階段宮頸癌可接受標(biāo)準(zhǔn)化治療從而達(dá)到臨床治愈標(biāo)準(zhǔn)，但對于晚期宮頸癌患者，特別是已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移的病人預(yù)后較差[3-4]。因此，早期準(zhǔn)確診斷宮頸癌，發(fā)現(xiàn)新的治療靶點，可大大提高宮頸癌患者生存率及預(yù)后水平。

近年來基因芯片技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于篩選表達(dá)基因組中變化較大的基因分子，通過該技術(shù)可找到與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的基因分子、基因表達(dá)與通路乃至臨床轉(zhuǎn)歸情況。p53 基因是目前已知與腫瘤發(fā)生相關(guān)性最高的基因，有趣的是，大部分腫瘤組織中表達(dá)突變型 p53，而在宮頸癌中 p53 主要是野生型[5]。眾所周知野生型 p53 一般起抑癌基因功能，而突變型p53 主要起癌基因功能。因此本研究中，課題組在癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫中利用生物信息學(xué)技術(shù)，對 297 例宮頸癌病人基因表達(dá)譜及 p53 突變情況進(jìn)行深入分析，同時利用KM plotter 網(wǎng)上分析工具分析 p53 表達(dá)與疾病預(yù)后生存期的關(guān)系，以獲取宮頸癌組織中 p53 突變及與p53 相關(guān)的差異表達(dá)基因，從而為宮頸癌的早期診斷和靶向治療提供候選生物學(xué)標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 基因芯片數(shù)據(jù)來源

TCGA 數(shù)據(jù)庫（http://cancergenome.nih.gov/）是一個具有公共功能的基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫，由美國國立癌癥研究院（NCI）和國立人類基因組研究院（NHGRI）于 2006 年聯(lián)合成立[6]。該數(shù)據(jù)庫利用大規(guī)模測序為主的基因組分析技術(shù)，通過廣泛合作，深入探討腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，提高人們對腫瘤發(fā)病的認(rèn)識水平。本研究中，我們利用 cBioportal 網(wǎng)站對來源于 TCGA 數(shù)據(jù)庫的 297 例宮頸癌臨床標(biāo)本進(jìn)行在線分析，cBioportal 網(wǎng)站為腫瘤基因組研究提供了一個網(wǎng)頁頁面，可用來瀏覽、可視化和多維度分析腫瘤基因組數(shù)據(jù)，為讀者提供便于理解和學(xué)習(xí)的基因組學(xué)、流行病學(xué)、基因表達(dá)和蛋白組學(xué)事件[7]，是用更簡易手段獲取腫瘤研究相關(guān)數(shù)據(jù)的理想工具。

1.2 方法

1.2.1 宮頸癌臨床標(biāo)本的一般資料分析 首先利用 cBioportal 網(wǎng)站提供的在線分析工具分析297 例宮頸癌病人的一般資料，主要包括病例種族、年齡、腫瘤亞型、腫瘤類型、病理分期、突變基因數(shù)目等基本信息，以期獲得本研究中所涉及的 297 例病例的基本情況。

1.2.2 p53基因在宮頸癌中的突變分析 利用 cBioportal 網(wǎng)站提供的在線分析工具分析 297 例宮頸癌病人標(biāo)本中抑癌基因 p53 的突變情況。

1.2.3 p53 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)、互相作用分子分析 利用 cBioportal 網(wǎng)站提供的在線分析工具分析 p53 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分子。分析功能蛋白質(zhì)之間的相互作用可以提供觀察疾病的發(fā)生或發(fā)展機(jī)制，因此我們利用 STRING 在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測可能與 p53 互作基因的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)圖（STRING，http://string-db.org），經(jīng)過與 p53共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分子交集，找出可能在宮頸癌中與 p53 互作的分子。

1.2.4 生存期分析 利用 KM plotter 網(wǎng)上分析工具（http://kmplot.com/analysis/）分析 p53 表達(dá)與宮頸癌病人生存期的關(guān)系，以期發(fā)現(xiàn) p53 對疾病預(yù)后的預(yù)測能力。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌病人一般資料分析

結(jié)果如圖 1 所示，該數(shù)據(jù)庫病例主要為白色人種，占總數(shù)的 68.4%（圖 1A）；疾病確診時的年齡以 40 ~ 50 歲數(shù)量最多，可達(dá) 80 人，占比約 27%（圖 1B）；腫瘤類型中，宮頸鱗狀細(xì)胞癌占絕大多數(shù)（圖 1C、D）；腫瘤分級，以 G2 和 G3 期占比最多，分別達(dá)到 44.1% 和 39.1%；基因突變數(shù)量方面，同時突變有 30 ~ 60 個基因的病例最多，人數(shù)可達(dá) 70 人。

圖 1 宮頸癌病例一般情況分析（A：種族分類；B：診斷年齡分組；C：腫瘤病理亞型分類；D：腫瘤類型占比；E：腫瘤免疫組化分級；F：突變數(shù)量占比）

Figure 1 General analysis of patients with cervical cancer(A: Racial classification; B: Diagnosis age grouping; C: Tumor pathology subtype classification; D: Tumor type ratio; E: Tumor immunohistochemical grade; F: Proportion of mutations)

圖 2 p53 在宮頸癌腫瘤組織中的突變分析（A：TP53基因突變率；B：TP53基因突變熱點；C：TP53基因突變類型）

Figure 2 Mutation analysis of p53 in cervical cancer tumor tissues (A: TP53 gene mutation rate; B: TP53 gene mutation hotspot; C: TP53 gene mutation types)

2.2 p53 基因在宮頸癌中的突變分析

盡管文獻(xiàn)[8]已報道宮頸癌中 p53 突變比例較低，為進(jìn)一步明確，我們在線分析了 p53在本研究群體中的突變情況，結(jié)果如圖 2 所示，p53 整體突變率為8.3%（圖 2A），突變位點以 E285K 處最常見（圖 2B）；拷貝數(shù)量突變主要以二倍體及微缺失為主（圖 2C）。

2.3 p53 互相作用網(wǎng)絡(luò)分析

利用 cBioportal 共表達(dá)分析可得到 p53 共表達(dá)基因示意圖（圖 3A），圖 3B 為在線分析的 p53 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)圖，我們又利用 STRING 在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測可能與 p53 互作的基因（圖 3C），然后在 p53 共表達(dá)基因庫中找到可能與 p53 互作基因的重疊基因，進(jìn)而找到目標(biāo)基因 Bcl2，該基因表達(dá)如表 1 所示，其與 p53 共表達(dá)相關(guān)性達(dá) 0.206（< 0.001），表明在宮頸癌中 p53 可能通過與 Bcl2 相互作用起到生物學(xué)功能。

2.4 p53 表達(dá)與生存期分析

利用 KM plotter 網(wǎng)上分析工具分析 p53 表達(dá)與宮頸癌生存期的關(guān)系，繪制 p53 基因表達(dá)的生存曲線，cutoff 值設(shè)為 median，結(jié)果如圖 4 所示，p53 表達(dá)水平與宮頸癌預(yù)后呈正相關(guān)關(guān)系（= 0.021），結(jié)果有顯著統(tǒng)計學(xué)差異，表明 p53 在宮頸癌中以野生型形式主要起抑癌基因功能。

3 討論

宮頸癌是全球女性中發(fā)病率處于第四位的惡性腫瘤[9]。超過 95% 的惡性宮頸癌患者有人乳頭瘤病毒（HPV）感染，約 85% 的死亡發(fā)生在不發(fā)達(dá)國家或發(fā)展中國家[10]。眾所周知，腫瘤抑制基因 p53 主要負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，修復(fù)受損 DNA 并促使細(xì)胞在應(yīng)激環(huán)境下發(fā)生細(xì)胞凋亡[11]。然而，p53基因大約在 50% 的人類惡性腫瘤中發(fā)生突變。有趣的是，大多數(shù)宮頸癌患者表達(dá)野生型 p53（WT p53）[12]，但小部分患者也表達(dá)突變型，由于野生型 p53 與突變型 p53 生物學(xué)功能完全不同，因此探明宮頸癌中 p53 突變情況及探討其可能的作用機(jī)制，對宮頸癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制的闡明及疾病預(yù)后都有較大的臨床意義。

圖 3 p53 在宮頸癌腫瘤組織中的共表達(dá)及互作網(wǎng)絡(luò)分析（A：p53共表達(dá)基因；B：p53 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)；C：p53 互作基因預(yù)測）

Figure 3 Co-expression and interaction network analysis of p53 in cervical cancer tumor tissues (A: p53 co-expression genes; B: p53 co-expression network; C: p53 interaction gene prediction)

表 1 p53 互作分子與 p53 的共表達(dá)情況

圖 4 p53 表達(dá)水平預(yù)測宮頸癌病人生存期的能力分析

Figure 4 The ability of p53 expression levels to predict survival in patients with cervical cancer

本研究中，首先對來源于 TCGA 數(shù)據(jù)庫的 297 例宮頸癌病人 p53 突變情況進(jìn)行分析，結(jié)果顯示 p53 整體突變率約為 9%，與文獻(xiàn)報道的數(shù)據(jù)大致相符，這也說明宮頸癌中主要以野生型 p53 為主，也進(jìn)一步提示 p53 在宮頸癌中可能與和其他腫瘤類型不同的方式行使生物學(xué)功能。宮頸癌中 p53 的突變主要以錯意突變?yōu)橹?，突變位點則以 E285K 處最為常見；拷貝數(shù)量突變主要以二倍體及微缺失為主。

為進(jìn)一步探明宮頸癌中 p53 的作用分子與通路，我們利用 cBioportal 共表達(dá)分析得到了一系列與 p53 共表達(dá)的基因，然后在線分析了 p53 的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)圖譜；同時我們又利用STRING 在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測可能與 p53 互作的基因，然后在可能與 p53 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)基因圖譜中找到與 p53 互作基因的重疊基因。結(jié)果提示 Bcl2 基因不但與 p53 可以互作，而且兩者之間存在共表達(dá)現(xiàn)象，Bcl2 與 p53 共表達(dá)相關(guān)性達(dá) 0.206，結(jié)果有顯著統(tǒng)計學(xué)意義，表明在宮頸癌中 p53 可能通過與 Bcl2 相互作用起到生物學(xué)功能。Bcl2 是細(xì)胞死亡的重要負(fù)調(diào)控因子，在細(xì)胞受到外界刺激時能保護(hù)細(xì)胞免于凋亡，但在腫瘤發(fā)生發(fā)展中，腫瘤細(xì)胞不可控的增殖增多與凋亡減少，Bcl2 主要起到癌基因的功能[13]。已有文獻(xiàn)報道 Bcl2 與 p53 相互影響在腫瘤凋亡中起重要生物學(xué)作用[14-15]。因此，p53 可能在宮頸癌中抑制Bcl2 生物學(xué)功能，從而發(fā)揮抑癌基因功能，但對兩者關(guān)系還有待進(jìn)一步闡明。

最后我們利用 KM plotter 網(wǎng)上分析工具分析了 p53 表達(dá)與宮頸癌生存期的關(guān)系，結(jié)果表明 p53 表達(dá)水平與宮頸癌預(yù)后呈明顯正相關(guān)關(guān)系，進(jìn)一步提示 p53 在宮頸癌中作為野生型主要起抑癌基因功能。

總之，通過生物信息學(xué)分析，我們確鑿了 p53 在宮頸癌中的突變及可能的生物學(xué)功能；同時構(gòu)建與 p53 的互作分子作用網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)了與 p53 共同發(fā)揮生物學(xué)功能的相關(guān)分子Bcl2，為宮頸癌的早期診斷、靶向治療及預(yù)后判斷提供了一定的理論基礎(chǔ)。

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Analysis of p53 mutation, co-expression network and clinical outcome in cervical cancer tumor tissues based on bioinformatics technology

ZHAO Zi-qian, LIANG Xin-miao, ZHANG Fei-yue, ZHAO Pei-qing

Shandong Zibo Experimental High School, Shandong 255036, China (ZHAO Zi-qian, LIANG Xin-miao); Department of Gynaecology (ZHANG Fei-yue), Center of Translational Medicine (ZHAO Pei-qing), Zibo Central Hospital, Shandong 255036, China

To explore the role of p53 for its mutation, co-expression network and its prognostic ability in cervical cancer, and to provide a theoretical basis for the diagnosis and prognosis of cervical cancer.

The target molecule p53 was searched using The Cancer Genome Atlas (TCGA) database to identify its mutations, possible molecules and networks.

The mutation rate of p53 gene in cervical cancer was about 9%. The expression level of p53 interacting molecule Bcl2 and p53 in cervical cancer is positively correlated with the prognosis of cervical cancer in STRING database.

This study showes that Bcl2 may play an important biological role together with p53 in cervical cancer, by which to provide a theoretical basis for early diagnosis, targeted therapy and prognosis of cervical cancer.

Cervical cancer; p53; Bcl2; TCGA database; Survival time

ZHAO Pei-qing, Email: bzjzzpq@163.com

山東省自然科學(xué)基金面上項目（ZR2015HM031、ZR2014HM 042）；山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計劃(2016WSA03022)

趙培慶，Email：bzjzzpq@163.com

2018-12-07

10.3969/j.issn.1673-713X.2019.01.006