柴胡地上部分成分分析及其解熱鎮(zhèn)痛活性研究

袁小晶 程雪丹 余 馬 索志榮 葉 平 秦海燕

(1. 西南科技大學生命科學與工程學院 四川綿陽 621010； 2. 西南科技大學分析測試中心 四川綿陽 621010)

柴胡(BupleurumchinenseD C)屬傘形科柴胡屬,多年生草本植物,其干燥根為傳統(tǒng)中藥,具有鎮(zhèn)靜、止痛、抗菌消炎、保肝利膽、抗病毒等功效。一直以來人們對于柴胡的研究多集中于根部皂苷類成分，但近年不斷有實驗研究發(fā)現(xiàn)柴胡地上部分(柴胡莖、葉)也含有多種有效成分[1]?！爸胁?號”為四川德培源中藥科技開發(fā)有限公司、中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所、西南科技大學等單位通過多年努力，選育出通過專業(yè)主管權(quán)威機構(gòu)鑒定認證、符合 2015 版 《中國藥典》要求的北柴胡品種，并在四川省廣元市進行了大面積栽培，該公司生產(chǎn)的柴胡根用以入藥，地上部分莖葉棄之不用,造成“中柴2號”柴胡資源大量浪費。

近年來，將中草藥添加于動物飼料以預防疾病或改善畜禽生產(chǎn)性能成為養(yǎng)殖業(yè)的研究熱點。宣清良等[2]使用柴胡蒸餾液治療妊娠母豬的持續(xù)高熱，取得了良好效果。彭國海[3]使用柴胡細辛煎汁治療豬的感冒，可以有效緩解感冒癥狀，降低體溫，提高攝食量。目前柴胡地上部分應用于畜牧生產(chǎn)的研究不多，從其藥用和營養(yǎng)的雙重作用來看，其應用于緩解畜禽熱應激和提高機體免疫力有著廣泛的應用前景[4]。本論文對“中柴2 號”柴胡地上部分的化學成分進行定性和定量分析，并測試其解熱鎮(zhèn)痛活性，以期為柴胡地上部分應用于動物飼料或動物疾病治療提供理論依據(jù)，也為擴大柴胡的藥用部位提供理論支持。

1 實驗

1.1 材料與方法

雌雄小白鼠(SPFKM品系)各80只，質(zhì)量(20±2 g)，由成都達碩實驗動物有限公司提供。

“中柴2號”柴胡購自四川德培源中藥科技開發(fā)有限公司，產(chǎn)地綿陽安縣花荄鎮(zhèn)、廣元青川縣竹園鎮(zhèn)、馬鹿鄉(xiāng)。

蘆丁、槲皮素、山奈素、異鼠李鼠，購自中國藥品生物制品檢定所；柴胡皂苷a、柴胡皂苷b1、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d，購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司；乙腈、甲醇，購自Fisher公司；LPS購自上海依赫生物科技有限公司。

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(R-301)，購自于上海申順生物科技有限公司；液相色譜儀(ULtiMate 3000 DGLG)，購自中國賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 色譜條件

HypesiL GOLD色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相為乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)；梯度洗脫程序(0～5 min，10%～30%A；5～25 min，70%A)；流速為0.8 mL·min-1；柱溫檢測為30 ℃，進樣量10 μL，運行時間25 min，檢測波長210 nm。

1.3 供試品溶液的制備

精密稱取柴胡細粉1.0 g，加入甲醇溶液50 mL，密塞，超聲處理(功率200 W，頻率40 kHz)30 min，過濾，用甲醇20 mL分兩次洗滌容器和藥渣，洗液與濾液合并，減壓旋蒸，加甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

1.4 線性關系考察

吸取制備的混合標準品儲備溶液，稀釋，制得濃度分別為初始濃度的1/250，1/50，1/20，1/5，1/1的混合對照品溶液，各取10 μL注入色譜儀中測定，按上述色譜條件依次進樣測定峰面積，以進樣量X(μg)為橫坐標，峰面積Y為縱坐標，得到線性回歸方程。

1.5 解熱實驗(內(nèi)毒素致熱)

取實驗用小鼠30只，于實驗前置于恒溫的適應環(huán)境中。實驗前測定小鼠的肛溫，并挑選出18只體溫在38 ℃以下且體溫體重接近的小鼠，并將其平均分為3組，分別為柴胡組、模型組、空白對照組。

柴胡組和模型組小鼠分別腹腔注射LPS溶液0.2 mL，使其發(fā)熱，空白對照組小鼠腹腔注射0.2 mL蒸餾水；柴胡組小鼠灌胃15 mg·mL-1柴胡煎煮液0.2 mL，剩余兩組灌胃等量蒸餾水，每隔0.5 h測一次肛溫，持續(xù)測量180 min，以基礎體溫為基數(shù)，計算各測定時間點小鼠體溫變化ΔT(℃)。以時間為橫坐標，ΔT為縱坐標繪制體溫變化曲線，計算各個實驗組在體溫達到峰值后的下降幅度[5]。

1.6 鎮(zhèn)痛實驗(熱板法)

選取24只舔足時間在40 s以下的雌鼠，平均分為3組，分別為低劑量(10 mg·mL-1)、中劑量(15 mg·mL-1)和高劑量(20 mg·mL-1)組，記錄基礎舔足時間，并給其進行腹腔注射對應濃度的柴胡煎煮液0.2 mL。于10,30,60 min后測量痛閾值，計算痛閾抑制率。痛閾抑制率(%)=(給藥后痛閾值-給藥前痛閾值)/給藥前痛閾值×100%[5]。

2 結(jié)果與討論

2.1 柴胡地上部分含量測定結(jié)果

柴胡中黃酮與皂苷標準品及供試品HPLC色譜圖如圖1所示。

圖1 混合對照品和樣品的色譜圖

根據(jù)柴胡皂苷a、柴胡皂苷b1、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d、蘆丁、槲皮素、異鼠李素、山柰素的回歸方程，計算發(fā)現(xiàn)“中柴2號”柴胡地上部分含有較高的黃酮類成分和少量的皂苷類成分，黃酮類成分含量范圍為2.01～8.75 mg·g-1，其皂苷類成分含量0.103～0.459 mg·g-1。其中黃酮類化合物對人體腫瘤、衰老、心血管等疾病的治療和預防有重要意義[6]，由此可知，“中柴2號”柴胡地上部分亦有顯著的藥用價值。

2.2 解熱作用

如圖2，表1、表2所示，各組小鼠腹腔注射LPS后，1.5～2.5 h達到峰值，與基礎體溫比較，除空白對照組外，各組小鼠體溫變化均大于0.6 ℃，表明造模成功。計算給藥組小鼠體溫變化ΔT(T1.5 h與T3.0 h體溫差值)、T1.5 h(T1.5 h與基礎體溫差值)。計算體溫下降幅度(%)=ΔT/ΔT1.5 h×100%，模型組和柴胡組體溫下降與對照組相比均有顯著性差異(P<0.05),表明柴胡地上部分煎煮液有顯著的解熱作用。張云波等[7]研究表明，柴胡黃酮部分和其他物質(zhì)在解熱效應中發(fā)揮重要作用，能協(xié)同增強解熱效果。說明“中柴2號”柴胡地上部分黃酮類成分在發(fā)熱動物的解熱中發(fā)揮了作用。

圖2 各組小鼠不同時間的體溫變化趨勢

表1 各組小鼠不同時間的體溫

表2 各組小鼠體溫的下降幅度(n=6)

2.3 鎮(zhèn)痛作用

表3表明，不同濃度的柴胡地上部分煎煮液的鎮(zhèn)痛效果不同。后續(xù)試驗選擇濃度為15 mg·mL-1的柴胡地上部分煎煮液。

表3 不同濃度煎煮液在不同給藥時間后的鎮(zhèn)痛作用

表4表明，與空白組對照，柴胡地上部分煎煮液鎮(zhèn)痛作用顯著，且隨著注射時間的增長，柴胡地上部分的鎮(zhèn)痛效果在一定范圍內(nèi)呈遞增趨勢，其中給藥30 min后鎮(zhèn)痛效果最好,0～1 h內(nèi)達到峰值。這是因為柴胡地上部分含有柴胡皂苷等水溶性成分，對神經(jīng)系統(tǒng)有明顯的抑制作用，從而發(fā)揮良好的鎮(zhèn)痛作用[8]。

表4 熱板法試驗結(jié)果(n=6)

3 結(jié)論

“中柴2號”柴胡地上部分含有較高的黃酮類成分，含量范圍2.01～8.75 mg·g-1，皂苷類成分含量達0.103～0.459 mg·g-1，而且其鎮(zhèn)痛效果在一定范圍內(nèi)呈遞增趨勢， 0～1 h內(nèi)達到峰值，說明柴胡地上部分可以作為藥用植物資源加以充分利用。中草藥飼料添加劑毒副作用小、不易產(chǎn)生抗藥性，是一種具有營養(yǎng)作用和抗病作用的綠色飼料添加劑。柴胡地上部分產(chǎn)量大，取材方便，地上部分用于動物飼料添加劑或獸醫(yī)臨床應用可以在一定程度上減少化學藥品出現(xiàn)的耐藥性或者器官毒性等問題。廣元市已推廣“中柴2號”約667 hm2，深入研究如何正確合理地使用柴胡地上部分作為中草藥飼料添加劑，不僅對動物疾病預防與控制發(fā)揮十分明顯的積極作用，也極大提高了中藥柴胡的經(jīng)濟效益。