整合高分辨熔解曲線和Sanger測序的MTHFR基因C677T多態(tài)性檢測新方法及其應(yīng)用

王 榕，白慧麗，程 偉，張玉洪△

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院：1.檢驗(yàn)科；2.臨床分子醫(yī)學(xué)檢測中心 400016)

亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)是人體葉酸代謝的關(guān)鍵酶，C677T是MTHFR基因最常見的多態(tài)性，會導(dǎo)致酶活性差異，影響機(jī)體葉酸代謝[1]。與野生型比較，雜合突變型與純合突變型表達(dá)的酶活性分別下降30%和70%[2]。C677T多態(tài)性與高同型半胱氨酸血癥[3]、高血壓[4]、心腦血管意外[5]、習(xí)慣性流產(chǎn)[6]、胎兒出生缺陷如神經(jīng)管缺陷[7]、先天性心臟病[8]等明顯相關(guān)。我國《高血壓合理用藥指南》(第二版)[9]和《圍受孕期增補(bǔ)葉酸預(yù)防神經(jīng)管缺陷指南(2017)》[10]均明確指出應(yīng)基于MTHFR基因C677T檢測結(jié)果進(jìn)行個體化干預(yù)，合理補(bǔ)充葉酸，防止高血壓并發(fā)癥和出生缺陷。

目前，針對MTHFR基因C677T檢測，臨床應(yīng)用較多的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)分析過程繁瑣，周期較長，易造成污染；Sanger測序是基因檢測金標(biāo)準(zhǔn)，但成本高昂，通量不足，不適于臨床大規(guī)模分析。高分辨熔解曲線(high resolution melting curve，HRM)分析技術(shù)是一種基于高分辨檢測不同基因型擴(kuò)增產(chǎn)物熔解溫度(Tm)差異的基因多態(tài)性分析新方法[11]，該方法具有快速簡便、經(jīng)濟(jì)和高通量的優(yōu)點(diǎn)，適用于臨床批量檢測。然而，傳統(tǒng)的HRM分析技術(shù)在臨床實(shí)際應(yīng)用過程中仍需突破以下固有缺陷：對部分野生型及純合突變型辨識能力不足，且對各標(biāo)本擴(kuò)增效率的一致性要求嚴(yán)苛。因此，本研究建立了一種基于整合優(yōu)化的HRM和Sanger測序的分子診斷新方法，并探索其MTHFR基因C677T基因多態(tài)性檢測臨床應(yīng)用，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1材料 收集2016年6月至2017年10月本院體檢中心1 030份乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-2K)抗凝外周血標(biāo)本；CC、CT和TT基因型DNA各10份(自備，均經(jīng)Sanger測序確認(rèn))。主要儀器與試劑：實(shí)時熒光定量PCR儀、LightCycler 480 High Resolution Melting Master(瑞士羅氏公司)；3500Dx測序儀(美國賽默飛公司)。

1.2方法

1.2.1DNA提取 提取基因組DNA，測定其純度和濃度并將濃度調(diào)至4 ng/μL。

1.2.2引物設(shè)計與驗(yàn)證 用Primer Premier5.0軟件設(shè)計針對MTHFR基因C677T多態(tài)性特異性引物，并引入正向(F)、反向(R)M13接頭。MTHFR-F：5′-M13F-GAA GCA CTT GAA GGA GAA-3′;MTHFR-R：5′-M13R-TCA CAA AGC GGA AGA AGT-3′。M13F：5′-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3′;M13R：5′-CAG GAA ACA GCT ATG ACC-3′。通過PCR產(chǎn)物電泳及Sanger測序驗(yàn)證引物特異性。

1.2.3優(yōu)化HRM分析技術(shù) 反應(yīng)體系：4 ng/μL標(biāo)本DNA 5.00 μL，4 μmol/L正、反向引物各0.50 μL，25 mmol/L MgCl22.00 μL，PCR MIX 10.00 μL，在此基礎(chǔ)上加入4 ng/μL CC基因型DNA 0.83 μL(相當(dāng)于DNA總量1/7)，余用ddH2O補(bǔ)足至20.00 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，65 ℃至50 ℃退火10 s，72 ℃ 10 s，45個循環(huán)；95 ℃ 1 min，40 ℃ 1 min，65 ℃ 1 s，收集65 ℃至95 ℃熒光信號(升溫速度0.02 ℃/s)；40 ℃ 30 s。

1.2.4Sanger測序直接檢測HRM產(chǎn)物 以M13R為測序引物直對1.2.3中“灰區(qū)”標(biāo)本HRM產(chǎn)物進(jìn)行Sanger測序。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS21.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以頻數(shù)或百分率表示。

2 結(jié) 果

2.1引物特異性驗(yàn)證 PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果為預(yù)期條帶，經(jīng)Sanger測序驗(yàn)證為目標(biāo)序列，見圖1。

M:DL 2000 DNA Marker;1～6:標(biāo)本PCR產(chǎn)物

2.2優(yōu)化的HRM反應(yīng)體系 傳統(tǒng)HRM方法無法區(qū)分野生型和純合突變型DNA。本研究加入相當(dāng)于DNA總量1/7的野生型DNA優(yōu)化后能夠顯著區(qū)分3種基因型，且結(jié)果與Sanger測序結(jié)果一致，見圖2。

圖2 加入1/7野生型DNA前后的熔解曲線

2.3MTHFR基因C677T多態(tài)性檢測結(jié)果 基于優(yōu)化的HRM聯(lián)合Sanger測序成功檢測1 030份未知標(biāo)本：其中1 024份(99.42%)由優(yōu)化的HRM有效分型；余6份(0.58%)經(jīng)HRM無法分型，其HRM產(chǎn)物經(jīng)Sanger測序?yàn)?份野生型、3份雜合突變型和1份純合突變型，見圖3。本研究中1 030份DNA的MTHFR基因C677T野生(CC)基因型為403份(39.13%)，雜合突變(CT)基因型為496份(48.16%)，純合突變(TT)基因型為131份(12.71%)；等位基因(C)的頻率為1 302份(63.20%)，等位基因(T)的頻率為758份(36.80%)。

3 討 論

HRM是一種基于單核苷酸Tm值差異的高靈敏基因分析技術(shù)。它通過實(shí)時監(jiān)測DNA雙鏈溝槽中飽和熒光染料信號值的變化，從而將單個堿基差異通過不同形態(tài)的熔解曲線直觀地展示出來。但是，在使用HRM技術(shù)檢測單核苷酸多態(tài)性時往往會出現(xiàn)部分純合突變型和野生型標(biāo)本無法辨識的問題[12-13]。本研究在實(shí)驗(yàn)初始階段使用傳統(tǒng)HRM方法時結(jié)果亦是如此。隨后，基于PALAIS等[14]研究，通過加入1/7野生型DNA并在擴(kuò)增結(jié)束后變性雜交(95 ℃ 1 min，40 ℃ 1 min)使純合突變型標(biāo)本產(chǎn)生部分異源雜化雙鏈DNA，造成其Tm值下降，從而準(zhǔn)確區(qū)分于野生型標(biāo)本。

筆者使用上述優(yōu)化HRM反應(yīng)體系能夠有效甄別絕大多數(shù)(99.42%)標(biāo)本MTHFR基因C677T多態(tài)性，但仍有6份(0.58%)標(biāo)本使用優(yōu)化HRM無法辨別基因型。由于HRM對于各標(biāo)本擴(kuò)增效率的一致性要求嚴(yán)苛，筆者推測這6份標(biāo)本可能是因其DNA自身存在抑制劑等原因造成擴(kuò)增效率不足，導(dǎo)致上述優(yōu)化方案也無法檢測。因此，筆者通過Sanger測序檢測這6份“灰區(qū)”標(biāo)本的MTHFR基因C677T多態(tài)性。如圖3C所示，本研究優(yōu)化時加入1/7野生型DNA造成測序時純合突變型紅色T峰下有低小的藍(lán)色C峰，隨后筆者利用Chromas分析軟件將其選作“背景干擾”進(jìn)行校正后堿基讀取結(jié)果并未改變，說明本文所構(gòu)建的優(yōu)化方案對下游測序分析無干擾。本研究設(shè)計的引物專門修飾了M13接頭，可直接對6份標(biāo)本HRM產(chǎn)物進(jìn)行Sanger測序驗(yàn)證，無需重新擴(kuò)增標(biāo)本，且得到了準(zhǔn)確可靠的測序結(jié)果。

如前所述，MTHFR基因C677T多態(tài)性與許多疾病顯著相關(guān)。本研究中TT基因型頻率高達(dá)12.71%，與其他已報道數(shù)據(jù)大體一致[15]。隨著MTHFR基因C677T檢測被逐漸納入相關(guān)診療指南，建立適用于臨床大規(guī)模篩查的基因檢測新方法十分必要。本研究針對MTHFR基因C677T多態(tài)性，建立了一種基于有機(jī)整合優(yōu)化的HRM和Sanger測序的新方法，在保留傳統(tǒng)HRM法無需特異性探針、閉管操作無污染、靈敏度高、特異度高、經(jīng)濟(jì)簡便、快速和高通量等優(yōu)勢的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步提高了傳統(tǒng)HRM的基因分型能力和準(zhǔn)確性。因此，本課題組所設(shè)計的整合優(yōu)化的HRM和Sanger測序的分子診斷新方法能夠有機(jī)結(jié)合HRM和Sanger測序的優(yōu)勢，適用于大規(guī)模臨床標(biāo)本檢測。此外，本研究所構(gòu)建的新方法不僅可用于MTHFR基因C677T多態(tài)性的臨床批量檢測，也可推廣應(yīng)用于其他基因多態(tài)性檢測，具有重要的臨床應(yīng)用推廣價值。