1,25(OH)2D3聯(lián)合鉑類對(duì)原代培養(yǎng)肺癌細(xì)胞的殺傷作用*

劉洪梅，王希柱，劉 靜，邱 斌,韓素桂，陳艷梅

(河北省唐山市人民醫(yī)院：1.核醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科;2.心內(nèi)科;3.體檢中心;4.胸外科 063000)

晚期非小細(xì)胞肺癌(nonsmall-cell lung cancer,NSCLC)患者無(wú)法行根治性手術(shù)，可選擇鉑類為基礎(chǔ)的兩藥聯(lián)合治療手段。以鉑類為基礎(chǔ)的化療藥能夠控制癥狀，改善生活質(zhì)量，是現(xiàn)在晚期NSCLC標(biāo)準(zhǔn)的治療方案，臨床治療時(shí)產(chǎn)生的不良反應(yīng)及部分患者對(duì)化療的耐受性差等問(wèn)題限制了鉑類足量使用。近年醫(yī)學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)1,25-二羥基維生素D3[1,25(OH)2D3]參與調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，減少多種炎性因子表達(dá)，發(fā)揮多種生物學(xué)功能[1-2]，還可通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞分化、促進(jìn)細(xì)胞凋亡等方式來(lái)發(fā)揮抗腫瘤作用[3-4]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察鉑類藥物與1,25(OH)2D3聯(lián)合作用對(duì)原代肺癌細(xì)胞的殺傷作用，探討1,25(OH)2D3對(duì)鉑類抗癌藥物的增敏作用，為肺癌的綜合治療提供依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞與試劑 選取2017年1-5月本院胸外科收治的伴有惡性胸腔積液患者5例，經(jīng)病理學(xué)或細(xì)胞學(xué)證實(shí)為NSCLC，其中腺癌4例，鱗癌1例。試劑：1,25(OH)2D3購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，溶于無(wú)水乙醇并配成儲(chǔ)備液，-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?；CCK-8購(gòu)自同仁化學(xué)研究所；細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；順鉑(DDP)注射液、卡鉑(CBP)注射液、奈達(dá)鉑(NDP)購(gòu)自山東齊魯制藥有限公司。

1.2方法

1.2.1原代肺癌細(xì)胞培養(yǎng) 無(wú)菌常規(guī)胸腔穿刺留取胸腔積液，1 000 r/min離心10 min，棄去上清液，磷酸鹽緩沖溶液(PBS)洗滌2次，用無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)液重懸，按細(xì)胞懸液∶Ficoll液體積比2∶1，將細(xì)胞懸液緩慢貼壁加入含F(xiàn)icoll液的離心管中，水平離心機(jī)2 000 r/min離心15 min，離心后吸取Ficoll液面上方乳白色液體，加入無(wú)菌離心管中，加適量PBS洗滌2次，每次1 000 r/min離心5 min。將洗滌后的細(xì)胞用含10%血清RPMI-1640培養(yǎng)液重懸，37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h，棄去上清液，加入含10%血清RPMI-1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)待細(xì)胞貼壁80%時(shí)，傳代用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞抑制率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肺癌細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色活細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞濃度2×104個(gè)/孔接種于96孔培養(yǎng)板，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，細(xì)胞貼壁后棄去培養(yǎng)液，加入含不同濃度藥物的培養(yǎng)液200 μL。單純肺癌細(xì)胞培養(yǎng)作為對(duì)照組；實(shí)驗(yàn)藥物組分為7組：DDP組，濃度分別為1、2、4、8和16 μg/mL；CBP組，濃度分別為5、10、25、50和100 μg/mL；NDP組，濃度分別為1、2、4、8和16 μg/mL；1,25(OH)2D3組，濃度分別為10、20、40、160和320 ng/mL；聯(lián)合藥物組，為DDP(4 μg/mL)+1,25(OH)2D3(20 ng/mL)、CBP(50 μg/mL)+1,25(OH)2D3(20 ng/mL)、NDP(6 μg/mL)+1,25(OH)2D3(20 ng/mL)。每組均設(shè)5個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)至加藥后24、48、72 h每孔加入20 μL的CCK-8，繼續(xù)孵育2 h，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(Thermo公司)450 nm檢測(cè)各孔吸光度(OD)值，按以下公式計(jì)算：細(xì)胞增殖抑制率=(對(duì)照組OD-實(shí)驗(yàn)組OD)/對(duì)照組OD×100%，以濃度的對(duì)數(shù)與抑制率進(jìn)行直線相關(guān)分析。

1.2.3流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期的變化 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以1×105個(gè)/mL接種于直徑60 mm的培養(yǎng)皿中，24 h貼壁后棄去培養(yǎng)液，按實(shí)驗(yàn)分組加入含不同濃度藥物的培養(yǎng)液。加藥作用24 h后收集細(xì)胞，按照細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒(凱基生物)使用說(shuō)明進(jìn)行操作，PBS離心洗滌后加入預(yù)冷的70%乙醇4 ℃固定過(guò)夜。然后PBS離心洗滌并收集細(xì)胞，重懸于PBS，加入100 μL RNase-A于37 ℃水浴消化30 min后加入400 μL 碘化丙啶(PI)混勻，室溫避光染色30 min后流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)檢測(cè)并分析細(xì)胞周期，計(jì)算細(xì)胞增殖指數(shù)。增殖指數(shù)=(S期百分比+G2/M期百分比)/(G0/G1期百分比)。

1.2.4Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用無(wú)血清的培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，使細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/mL。加200 μL細(xì)胞懸液至鋪好Matrigel膠的Transwell小室中，將Transwell小室放入24孔板中，下室加入含15%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液600 μL，每組設(shè)置2個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去小室微孔膜上層細(xì)胞后PBS沖洗2遍，4%多聚甲醛室溫下固定20 min后PBS沖洗2遍，1%結(jié)晶紫染色30 min，蒸餾水沖洗。倒置顯微鏡下對(duì)穿至微孔膜下層的細(xì)胞計(jì)數(shù)。每份標(biāo)本選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)細(xì)胞個(gè)數(shù)，取平均值。

2 結(jié) 果

2.1藥物對(duì)肺癌細(xì)胞增殖抑制率的影響 各組單藥作用肺癌細(xì)胞，隨著給藥濃度的增加，時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用也逐漸增加，呈現(xiàn)明顯的時(shí)間劑量依賴效應(yīng)。選擇每個(gè)鉑類藥物最接近半數(shù)抑制濃度的藥物劑量(IC50)分別與低劑量(20 ng/mL)1,25(OH)2D3聯(lián)合作用于細(xì)胞，對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用增強(qiáng)，與對(duì)應(yīng)的鉑類單藥比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.2藥物對(duì)肺癌細(xì)胞周期的影響 與對(duì)照組比較，DDP組、CBP組、NDP組和1,25(OH)2D3組的G0/G1期的細(xì)胞比例都有增加；DDP組、CBP組、NDP組S期細(xì)胞比例降低；CBP組、NDP組G2/M期細(xì)胞比例增加。與對(duì)應(yīng)的鉑類單藥組比較，DDP+1,25(OH)2D3聯(lián)合組的G0/G1期的細(xì)胞比例升高,G2/M的細(xì)胞比例明顯降低(均P<0.05)；CBP+1,25(OH)2D3聯(lián)合組的G0/G1期的細(xì)胞比例升高,S期的細(xì)胞比例有所增加，G2/M的細(xì)胞比例明顯降低(均P<0.05)；NDP+1,25(OH)2D3聯(lián)合組的G0/G1期的細(xì)胞比例升高(P<0.05),S期的細(xì)胞比例明顯降低(P<0.05)，G2/M的細(xì)胞比例變化不明顯(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表1 各組藥物對(duì)肺癌細(xì)胞增殖的影響

a：P<0.05，與4 μg/mL DDP比較;b：P<0.05，與50 μg/mL CBP比較;c：P<0.05，與4 μg/mL NDP比較

表2 各組藥物對(duì)肺癌細(xì)胞周期的影響

續(xù)表2 各組藥物對(duì)肺癌細(xì)胞周期的影響

a:P<0.05，與對(duì)應(yīng)的鉑類藥物組比較

2.3藥物對(duì)肺癌細(xì)胞的侵襲影響 Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)應(yīng)的鉑類單藥組比較,肺癌細(xì)胞經(jīng)DDP、CBP、NDP與1,25(OH)2D3聯(lián)合作用處理24 h后，腫瘤細(xì)胞的侵襲能力呈現(xiàn)不同程度的下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

A:對(duì)照組；B:DDP組；C:CBP組；D:NDP組；E:1,25(OH)2D3組；F:DDP+1，25(OH)2D3組；G:CBP+1,25(OH)2D3組；H：NDP+1,25(OH)2D3組；a:P<0.05，與對(duì)應(yīng)鉑類單藥組比較

3 討 論

原發(fā)性肺癌是我國(guó)主要惡性腫瘤之一,大多數(shù)肺癌患者被發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)屬于中晚期，不能接受手術(shù)治療，采用化療的方式是目前治療NSCLC患者的主要治療方式。鉑類化療藥物聯(lián)合第3代化療藥物的雙藥化療方案可進(jìn)一步提高臨床療效，其總緩解率可達(dá)50%，中位生存時(shí)間達(dá)14.2個(gè)月，1年生存率提高到54%。DDP作為臨床常用的化療藥物之一，主要通過(guò)調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡達(dá)到抗腫瘤效果[5-6]，但其存在消化道反應(yīng)、腎毒性、骨髓抑制等不良反應(yīng)[7-8]。其療效與劑量呈正比，不良反應(yīng)也與劑量相關(guān)，故臨床工作中常因不良反應(yīng)而限制其用量。維生素D為固醇類衍生物,吸收的維生素D運(yùn)到肝臟中，在微粒體中經(jīng)單氧酶系統(tǒng)作用，將其25位羥基化形成[1α,25(OH)D3]，[1α,25(OH)D3]在腎線粒體單氧酶作用下經(jīng)羧基化，轉(zhuǎn)變?yōu)?,25(OH)2D3，其為維生素D的主要生物作用形式。近年來(lái)一些體內(nèi)外的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，維生素D具有抑制腫瘤增殖、促進(jìn)凋亡、抑制分化的作用，POURGHOLAMI等[9]在小鼠體外實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)Hep-3B、PLC/PRF/5、SKHEP-1細(xì)胞的增殖被1,25(OH)2D3明顯抑制，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中不同劑量1,25(OH)2D3能夠顯著抑制裸鼠的SKHEP-1腫瘤生長(zhǎng)。CAPUTO等[10]通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，1,25(OH)2D3對(duì)人肝癌細(xì)胞系HepG2的抑制作用是發(fā)生在細(xì)胞周期的G0/G1期，G0/G1細(xì)胞比例隨1,25(OH)2D3濃度的增加而增加，并伴有S期細(xì)胞數(shù)量的減少。余曉燕等[11]通過(guò)檢測(cè)患者血清中25羥維生素D[25(OH)D]和維生素D結(jié)合蛋白的濃度，分析其與患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，血清中維生素D和維生素D結(jié)合蛋白濃度高低在NSCLC的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中具有重要意義，兩者可作為NSCLC患者預(yù)后評(píng)估的輔助指標(biāo)。 SABZICHI等[12]用載有維生素D的納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)體(NLC)與多柔比星(Dox)同時(shí)給藥乳腺癌細(xì)胞MCF-7,結(jié)果細(xì)胞增殖百分比從(49.0±7.2)%降低至(37.0±5.1)%，細(xì)胞凋亡百分比增加兩倍(P<0.05)。 在本實(shí)驗(yàn)中，結(jié)果顯示DDP、CBP、NDP和1,25(OH)2D3單獨(dú)使用對(duì)惡性胸腔積液中分離的肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)具有抑制作用，各鉑類藥物與1,25(OH)2D3聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，抑制率明顯高于鉑類單藥，并且具有時(shí)間濃度依賴性的特點(diǎn)。通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)，3個(gè)鉑類藥物和1,25(OH)2D3聯(lián)合作用時(shí)G0/G1期細(xì)胞比例增加，抑制細(xì)胞進(jìn)入DNA合成期和有絲分裂期，兩者聯(lián)合應(yīng)用能夠抑制細(xì)胞增殖。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，聯(lián)合處理后，發(fā)生侵襲的肺癌細(xì)胞數(shù)量顯著減少。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)選擇NSCLC晚期患者的胸腔積液中原代細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤細(xì)胞，結(jié)果表明DDP、CBP、NDP聯(lián)合1,25(OH)2D3作用可抑制肺癌細(xì)胞的增殖、侵襲能力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，1,25(OH)2D3能夠增強(qiáng)鉑類藥物的化療敏感度，減少單獨(dú)大劑量使用鉑類藥物的不良反應(yīng)，為肺癌的綜合治療提供更多依據(jù)。