功能性納米材料免疫層析技術(shù)在獸藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用

胡高爽，高山

（河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊050018）

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人民生活水平的提高，動(dòng)物源性食品安全逐漸成為當(dāng)今世界人們所關(guān)注的焦點(diǎn)問(wèn)題，獸藥殘留作為影響動(dòng)物性食品安全的最主要因素之一[1]，近年來(lái)受到了廣泛關(guān)注。由于獸藥殘留在食品基質(zhì)中的痕量性存在和復(fù)雜多樣性，針對(duì)其開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)單快速、靈敏可靠的檢測(cè)方法，具有重要的研究?jī)r(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義，是實(shí)行食品安全有效監(jiān)管、保證食品安全的重要途徑。

目前，針對(duì)獸藥殘留檢測(cè)的方法有微生物法[2-3]、薄層色譜法[4]、毛細(xì)管電泳[5]、氣相色譜[6]、液相色譜[7]、色譜—質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)[8]等，盡管上述的這些方法，可以被應(yīng)用于獸藥殘留的有效檢測(cè)，但是他們存在一定的局限性。如儀器分析法，樣品預(yù)處理步驟繁瑣，需要萃取、分離、凈化、衍生化等，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，且需要專業(yè)人員的操作和維護(hù)，不適合用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，無(wú)法滿足食品安全監(jiān)管過(guò)程中的快速、高效的要求。

免疫分析技術(shù)（immunoassay，IA），是一種基于抗原（或抗體）作為選擇性化學(xué)試劑特異性測(cè)定分析抗體（或抗原）的技術(shù)，具有專一性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)[9-11]。其中免疫層析技術(shù)（如圖1所示）是建立在免疫分析技術(shù)和色譜層析技術(shù)基礎(chǔ)上的一項(xiàng)即時(shí)檢測(cè)技術(shù)，具有操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)快速、價(jià)格低廉且環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于食品安全檢測(cè)領(lǐng)域。近年來(lái)，面對(duì)我國(guó)食品安全中獸藥殘留多樣性和痕量性存在的特點(diǎn)，以及其在食品中持續(xù)動(dòng)態(tài)變化的問(wèn)題，出現(xiàn)了一些新型的基于功能性納米粒子的免疫層析技術(shù)，他們突破了傳統(tǒng)免疫層析技術(shù)在檢測(cè)速度和靈敏度上的技術(shù)瓶頸，為獸藥殘留快速、高靈敏檢測(cè)提供了新方法，也為食品危害因子的有效控制提供了新思路。

圖1 免疫層析試紙條示意圖Fig.1 Schematic illustration of the immunochromatographic strips

1 基于可視化納米材料的免疫層析技術(shù)

1.1 膠體金免疫層析技術(shù)

膠體金免疫層析技術(shù)主要是采用膠體金對(duì)相關(guān)抗體進(jìn)行標(biāo)記，當(dāng)金標(biāo)抗體聚集到一定密度時(shí)（一般要達(dá)到107個(gè)/mm2），就會(huì)形成肉眼可見(jiàn)的紫紅色，從而可對(duì)反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行直觀測(cè)定的一種技術(shù)。膠體金免疫層析技術(shù)是目前針對(duì)獸藥殘留檢測(cè)中應(yīng)用最為廣泛的一種免疫層析技術(shù)。

王碩等[12-16]以硝基呋喃類獸藥代謝物、四環(huán)素類獸藥、慶大霉素、喹諾酮類獸藥以及磺胺類獸藥等為研究對(duì)象，建立了一系列針對(duì)其檢測(cè)膠體金免疫層析試紙條，并應(yīng)用于動(dòng)物源性食品中獸藥殘留的可視化檢測(cè)。Wu songsong等[17]建立了基于膠體金的競(jìng)爭(zhēng)免疫層析方法，實(shí)現(xiàn)了雞肉肌肉組織中金剛烷胺的快速靈敏檢測(cè)，檢測(cè)限能夠達(dá)到1.80 ng/mL。Byzoua等[18]利用膠體金免疫層析技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了牛奶中氯霉素的快速檢測(cè)。然而，膠體金免疫層析技術(shù)使用膠體金作為抗體標(biāo)記物，該方法的穩(wěn)定性和靈敏度受到了一定的限制。

1.2 乳膠微球免疫層析技術(shù)

乳膠微球具有分散性好，粒徑均一，色彩鮮艷等特性。Wang chen等[19]利用乳膠微球建立了針對(duì)牛奶中喹諾酮類、磺胺類和四環(huán)素類抗生素同時(shí)檢測(cè)的免疫層析方法，并與傳統(tǒng)的膠體金免疫層析技術(shù)進(jìn)行了對(duì)比，所得的檢出限顯著小于歐盟所規(guī)定的最大殘留限量（maximum residue limit，MRL），可以作為抗生素類獸藥檢測(cè)的方法。管笛等[20]建立了以彩色乳膠微球?yàn)闃?biāo)記物的免疫層析技術(shù)檢測(cè)豬尿液中的鹽酸克倫特羅，所建立方法的檢出限為0.013 ng/mL，回收率范圍為97.8%～106.0%之間。

1.3 其他新型可視化納米材料的免疫層析技術(shù)

納米碳是一種具有局部石墨化結(jié)構(gòu)的無(wú)定形碳，外觀為黑色粉末狀固體，其基本粒子尺寸在10 nm～100 nm之間，具有穩(wěn)定性好、易制備、無(wú)毒、不需要活化、靈敏度高及價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)[21-22]。另外一種新型的納米標(biāo)記材料為納米金-聚苯胺-納米金微球（nanogold-polyanilinenanogold microspheres，GPGs），它是一種在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中合成的納米材料。其基本反應(yīng)原理[23]為：在酸性介質(zhì)中，采用氯金酸水溶液氧化苯胺，使苯胺單體發(fā)生氧化聚合，氯金酸被還原成膠體金，包埋在聚苯胺中，形成納米金-聚苯胺復(fù)合物。再向聚合物中添加粒徑為20 nm左右的膠體金溶液，通過(guò)物理吸附形成納米金-聚苯胺-納米金微球（GPGs），得到的納米材料溶液穩(wěn)定性良好，呈黑色。LIU等[24]利用膠體碳和納米金-聚苯胺-納米金微球構(gòu)建了兩種新型的納米材料標(biāo)記的免疫層析方法（如圖2所示），并用于動(dòng)物源性食品中沙丁胺醇類獸藥殘留的檢測(cè)，由于其黑色信號(hào)與白色背景層析膜可形成強(qiáng)烈對(duì)比，因而具有較高的靈敏度，為新型納米標(biāo)記物在免疫層析技術(shù)中的應(yīng)用提供了新思路。然而，其檢測(cè)水平仍然只能達(dá)到定性或半定量級(jí)別，因此還需進(jìn)一步開(kāi)發(fā)可準(zhǔn)確定量的其他配套檢測(cè)手段。

圖2 試紙條檢測(cè)不同濃度沙丁胺醇的結(jié)果Fig.2 Typical strip tests of standard solutions with different SAL concentration after assay procedure

2 基于熒光納米材料的免疫層析技術(shù)

2.1 熒光微球免疫層析技術(shù)

熒光微球是指將熒光染料通過(guò)物理吸附法、自組裝法、化學(xué)鍵合法、共聚法、包埋法等吸附或包埋到粒子內(nèi)而形成的直徑在納米至微米級(jí)（0.01 μm～1 μm），受激發(fā)光源激發(fā)能發(fā)出熒光的固體微粒。通過(guò)表面修飾技術(shù)使微球表面攜帶親水性基團(tuán)，使最終制備的熒光微球具有粒度均一、單分散性好、穩(wěn)定性好、發(fā)光效率高、重復(fù)性好等特點(diǎn)，且具有較好的生物相容性[25-27]。因此，將其作為信號(hào)標(biāo)記物應(yīng)用于免疫層析技術(shù)，與膠體金免疫層析試紙條的原理相同，在質(zhì)控線熒光強(qiáng)度一致的條件下，通過(guò)觀察檢測(cè)限熒光強(qiáng)度的消失，作為目標(biāo)物的檢出限。但由于其使用熒光材料作為標(biāo)記物，能夠顯著增強(qiáng)方法的靈敏度。

朱海等[28]將熒光微球與呋喃唑酮代謝物單克隆抗體共價(jià)耦聯(lián)在一起，以競(jìng)爭(zhēng)法作為反應(yīng)模式來(lái)制備出呋喃唑酮代謝物免疫層析試紙條，其靈敏度達(dá)1.0ng/mL，可滿足相關(guān)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)要求，通過(guò)肉眼觀察檢測(cè)限和質(zhì)控線之間的亮度，還可進(jìn)行半定量檢測(cè)。宋春美[29]選擇具有優(yōu)良發(fā)光性能的稀土配合物BHHCT-Eu3+為熒光材料，在反相微乳法合成SiO2的基礎(chǔ)上，制備了共價(jià)型稀土熒光納米顆粒，通過(guò)與鹽酸克倫特羅單克隆抗體偶聯(lián)，建立了基于熒光納米顆粒標(biāo)記的鹽酸克倫特羅熒光免疫層析試紙。Bian等[30]利用熒光微球建立針對(duì)牛奶、血清和動(dòng)物組織中頭孢氨芐類抗生素檢測(cè)的免疫層析方法，方法檢測(cè)限＜0.1 μg/L。Chen 等[31]利用200 nm熒光微球建立了牛奶中磺胺甲嘧啶殘留檢測(cè)的免疫層析法，在樣品中的檢出限能夠達(dá)到0.11 μg/L。Zhou等[32]同樣采用熒光微球免疫層析法（如圖3所示），建立了牛奶、蜂蜜、牛肉和豬尿中潔霉素快速檢測(cè)的方法。

近來(lái)，熒光猝滅的現(xiàn)象引起了科研工作者的注意[33-35]，由于相互靠近的供體與受體通過(guò)偶極子-偶極子相互作用而產(chǎn)生的非輻射性的過(guò)程，進(jìn)而發(fā)生能量共振轉(zhuǎn)移出現(xiàn)熒光猝滅的現(xiàn)象，被廣泛的應(yīng)用于生物檢測(cè)領(lǐng)域[36]，Shi等[35]利用熒光微球與膠體金之間發(fā)生熒光猝滅的現(xiàn)象，構(gòu)建了新型免疫層析技術(shù)用于萊克多巴胺的檢測(cè)，方法相較于傳統(tǒng)免疫層析技術(shù)，檢測(cè)模式由信號(hào)turn-off轉(zhuǎn)變?yōu)閠urn-on型，使方法的靈敏度有了較大的提高，為針對(duì)獸藥殘留檢測(cè)的免疫層析技術(shù)向著高靈敏的發(fā)展提供新方向。

圖3 熒光微球免疫層析法測(cè)定潔霉素的結(jié)果Fig.3 Microsphere-based fluorescence immunochromatographic assay for monitoring lincomycin

2.2 量子點(diǎn)免疫層析技術(shù)

量子點(diǎn)（Quantum dots，QDs），是一種由 II-VI或者III-V族元素組成的準(zhǔn)零維納米材料，通常它們的直徑為1 nm～10 nm之間[37-38]。由于量子限域效應(yīng)，QDs具有很多特殊的光物理性質(zhì)。（1）光穩(wěn)定性好，可被重復(fù)激發(fā)，能保持?jǐn)?shù)小時(shí)較強(qiáng)的熒光強(qiáng)度且不易漂白；（2）具有較寬的激發(fā)光譜。有一個(gè)比較廣泛的激發(fā)波長(zhǎng)范圍；（3）尺寸依賴性的光學(xué)性能，同一激發(fā)不同發(fā)射，有利于同步檢測(cè)的應(yīng)用[39]；（4）發(fā)射光譜窄，減少不同粒徑QDs發(fā)射光譜的重疊，有助于多標(biāo)記檢測(cè)[40-41]。因此，QDs可以作為一種優(yōu)越的熒光材料用于生物標(biāo)記分析。

Berlina等[42]建立了基于量子點(diǎn)的新型熒光免疫層析方法用于牛奶中氯霉素的檢測(cè)，該方法針對(duì)氯霉素的檢出限能夠達(dá)到0.2 ng/mL，檢測(cè)時(shí)間不超過(guò)20 min。Taranova等[43]利用量子點(diǎn)尺寸效應(yīng)，建立了基于不同發(fā)射波長(zhǎng)量子點(diǎn)的牛奶中多種抗生素類獸藥殘留同時(shí)檢測(cè)的“交通燈”熒光免疫層析技術(shù)。

此外，在先前研究的基礎(chǔ)上[34，44-47]，根據(jù)熒光能量共振轉(zhuǎn)移的原理，利用發(fā)射波長(zhǎng)為532 nm的量子點(diǎn)作為能量供體，吸收波長(zhǎng)為520 nm的膠體金作為能量受測(cè)提供了新思路[49]。

圖4 磺胺類和喹諾酮類獸藥多殘留量子點(diǎn)熒光猝滅免疫層析檢測(cè)方法示意圖Fig.4 Schematic of QDs-based FQICS for the detection of SAs and FQs

2.3 上轉(zhuǎn)換免疫層析技術(shù)

上轉(zhuǎn)換納米粒子（Upconversion nanoparticles，UCNPs）是指受到光激發(fā)時(shí)，通過(guò)多光子機(jī)制發(fā)射比激發(fā)波長(zhǎng)短的熒光的納米材料[50-51]，其基本組成包括基質(zhì)材料、激活劑和敏化劑。由于UCNPs獨(dú)特的發(fā)光機(jī)制，長(zhǎng)波長(zhǎng)激發(fā)短波長(zhǎng)發(fā)射，相較于傳統(tǒng)的有機(jī)染料作為生物標(biāo)記材料，具有如下諸多優(yōu)點(diǎn)[52-57]。（1）不易被光漂白，光化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定性高；（2）發(fā)光性能穩(wěn)定，不受外界干擾，特別適合復(fù)雜生物樣本中的熒光標(biāo)記；（3）長(zhǎng)波長(zhǎng)激發(fā)短波長(zhǎng)發(fā)射，不遵循Stokes定律，可以大大降低背景的干擾，提高檢測(cè)靈敏度；（4）可通過(guò)控制摻雜元素的種類和比例，獲得不同發(fā)射波長(zhǎng)，實(shí)現(xiàn)生物體系多組分同時(shí)檢測(cè)。

王金鵬[58]和張揚(yáng)[59]利用性能優(yōu)良的上轉(zhuǎn)換納米粒子，構(gòu)建了上轉(zhuǎn)換免疫層析方法，并用于動(dòng)物源性食品中喹諾酮類、磺胺類和沙丁胺醇等獸藥殘留的檢體，借助于免疫層析檢測(cè)的平臺(tái)，設(shè)計(jì)了一種新型信號(hào)turn-on模式的量子點(diǎn)熒光猝滅免疫層析檢測(cè)方法，并用于動(dòng)物源性食品中磺胺喹惡啉獸藥殘留的快速檢測(cè)，相較于傳統(tǒng)膠體金免疫層析檢測(cè)方法，提高了免疫層析檢測(cè)技術(shù)的靈敏度[48]。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行進(jìn)一步研究，針對(duì)食品多種潛在有害物共同存在的現(xiàn)狀，構(gòu)建了基于量子點(diǎn)的多殘留熒光猝滅免疫層析方法（如圖4所示），用于動(dòng)物源性食品中磺胺類和喹諾酮類獸藥的檢測(cè)，為免疫層析技術(shù)用于獸藥多殘留檢測(cè)。利用上轉(zhuǎn)換納米粒子與膠體金之間的能量共振轉(zhuǎn)移的原理，建立了基于上轉(zhuǎn)換的熒光猝滅免疫層析方法，并成功應(yīng)用于磺胺喹惡啉獸藥的檢測(cè)[48]。然而，目前的研究缺乏相應(yīng)的精準(zhǔn)的檢測(cè)儀器，還沒(méi)有實(shí)現(xiàn)真正意義上的全定量分析。后續(xù)工作將致力于便攜式檢測(cè)儀器的制造或完善，實(shí)現(xiàn)全定量分析，并把可靠新穎的檢測(cè)方法帶出實(shí)驗(yàn)室，真正應(yīng)用于實(shí)際樣品的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

3 基于磁性納米粒子的免疫層析技術(shù)

磁性納米粒子是新近發(fā)展起來(lái)的標(biāo)記物，它是一種內(nèi)部含有磁性金屬氧化物，表面覆蓋高分子有機(jī)材料的具有一定磁性和特殊性質(zhì)的微球[60]。其作為標(biāo)記物具有以下優(yōu)勢(shì)：第一，免疫磁珠經(jīng)過(guò)功能修飾之后，抗體是通過(guò)化學(xué)鍵結(jié)合到磁珠表面的，與之前膠體金、乳膠顆粒等的物理吸附不同，這種結(jié)合相對(duì)牢固，不易受到溫度濕度的影響，所以試劑的穩(wěn)定性要遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于膠體金、乳膠顆粒等顆粒標(biāo)記物；第二，磁性納米粒子具有的超順磁性，在磁場(chǎng)中行為一致，響應(yīng)性相同，呈現(xiàn)良好的單分散性，易于控制；第三，磁性材料只有在磁場(chǎng)中才會(huì)有磁性，而一般的生物樣品幾乎不表現(xiàn)出任何磁性。因此，檢測(cè)時(shí)背景值比較低，對(duì)于一些復(fù)雜的體系，樣品無(wú)需經(jīng)過(guò)特殊處理即可得到較高的靈敏度，這一點(diǎn)非常適用于免疫層析技術(shù)的要求。目前，基于超順磁性磁珠的免疫層析技術(shù)作為新興的標(biāo)記層析技術(shù)已經(jīng)引起了研究者們的廣泛關(guān)注。

吳科盛[61]建立了磁分散固相萃取結(jié)合膠體金免疫層析試紙條定量檢測(cè)豬肉中克倫特羅的方法。結(jié)果顯示，基于磁分散固相萃取的膠體金免疫層析試紙條定量檢測(cè)法最低檢測(cè)限為0.10 ng/mL，定量限為0.24 ng/mL，該檢測(cè)方法應(yīng)用于經(jīng)LC/MS/MS確證為CLE陽(yáng)性的9個(gè)實(shí)際豬肉樣本檢測(cè)，比對(duì)結(jié)果顯示，本研究所建檢測(cè)方法與確證方法的檢測(cè)結(jié)果具有較好的相關(guān)性。胡寅[62]以磁性Fe3O4納米粒子為材料，鹽酸克倫特羅為檢測(cè)對(duì)象，通過(guò)優(yōu)化試驗(yàn)反應(yīng)條件，研究建立了基于Fe3O4磁性納米粒子的半定量膠體金免疫層析試紙條。結(jié)果表明，在優(yōu)化條件下，該方法的檢測(cè)靈敏度與傳統(tǒng)的膠體金免疫層析試紙條相似，具有成本低、制作簡(jiǎn)單、使用方便、能半定量檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)。黃薇[63]建立了一種將免疫磁分離與免疫磁層析相結(jié)合的磁性免疫層析快速檢測(cè)新方法，并將其用于氯霉素殘留的快速檢測(cè)。該方法以超順磁性微球代替?zhèn)鹘y(tǒng)的膠體金作為信號(hào)標(biāo)記物，即可以通過(guò)肉眼觀察或光學(xué)比色法實(shí)現(xiàn)快速定性分析，又可以進(jìn)一步利用超順磁材料特殊的磁信號(hào)實(shí)現(xiàn)免疫層析技術(shù)的定量化檢測(cè)。

此外，近來(lái)Razo等有科研工作者[64]將磁性納米顆粒與膠體金通過(guò)生物素-鏈霉親和素相結(jié)合作為雙重信號(hào)放大系統(tǒng)（如圖5所示），應(yīng)用于免疫層析技術(shù)中檢測(cè)馬鈴薯X病毒，克服了傳統(tǒng)免疫分析技術(shù)前處理復(fù)雜、檢測(cè)信號(hào)弱的缺點(diǎn)。然而，其在獸藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用還沒(méi)有開(kāi)展，因此，將其應(yīng)用于獸藥殘留的檢測(cè)具有潛在的研究?jī)r(jià)值。

圖5 所建立的雙重信號(hào)放大的免疫層析示意圖Fig.5 Proposed lateral flow immunoassay（LFIA）scheme with double amplification

4 展望

免疫層析技術(shù)作為快速檢測(cè)領(lǐng)軍先鋒發(fā)展迅猛，功能性納米材料具有更大的比表面積或者特定的功能，將其應(yīng)用于免疫層析技術(shù)中，對(duì)于提高方法的性能有很重要的作用。本文綜述了近年來(lái)利用新型標(biāo)記材料，如量子點(diǎn)、稀土發(fā)光材料、上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料、熒光素等作為信號(hào)標(biāo)記物在免疫層析技術(shù)應(yīng)用的研究進(jìn)展，這些新型研究技術(shù)突破了傳統(tǒng)膠體金免疫層析方法在靈敏度和穩(wěn)定性等方面的不足，此外，配合新型信號(hào)讀數(shù)設(shè)備，克服了膠體金免疫層析技術(shù)只能實(shí)現(xiàn)定性半定量的缺點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)物的全定量分析檢測(cè)。

此外，近年來(lái)互補(bǔ)的核酸鏈之間的特異性結(jié)合，也被研究者應(yīng)用于層析方法中。其中應(yīng)用較為廣泛的為核酸適配體（Aptamer），它是一種對(duì)特定靶標(biāo)物如小分子、金屬離子、生物大分子、細(xì)胞以及生物組織等具有選擇性識(shí)別功能的單鏈DNA或RNA序列。閆嬌[65]開(kāi)發(fā)了一種基于適配體技術(shù)的快速檢測(cè)氯霉素的熒光試紙條的方法，檢測(cè)限可以達(dá)到1 nmol/L。該方法簡(jiǎn)單快速，無(wú)需特殊和復(fù)雜的儀器，為開(kāi)發(fā)基于適配體技術(shù)的抗生素及其他污染物快速現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)方法提供了一種新的思路，具有良好的應(yīng)用前景。且與抗體相比，核酸適配體顯示出設(shè)計(jì)靈活、容易化學(xué)合成和修飾、成本低廉、生化穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。

隨著生物技術(shù)、納米技術(shù)、光電技術(shù)的發(fā)展及各學(xué)科的交叉融合，會(huì)有越來(lái)越多的新型標(biāo)記材料、新型目標(biāo)捕獲元件、新型檢測(cè)模式以及新型便攜化、微型化、自動(dòng)化的定量檢測(cè)儀器出現(xiàn)，用于改善現(xiàn)有層析技術(shù)的各項(xiàng)性能，為食品安全監(jiān)控提供直接、有效的方法，實(shí)現(xiàn)科學(xué)、合理地監(jiān)測(cè)動(dòng)物源性食品中獸藥殘留，為食品公司提升食品生產(chǎn)單位的運(yùn)行管理水平，減少事故的發(fā)生，為相關(guān)監(jiān)察部門節(jié)省巨大的檢測(cè)成本，從而創(chuàng)造巨大的間接經(jīng)濟(jì)效益，同時(shí)也為食品安全事業(yè)做出更大的貢獻(xiàn)。