風(fēng)干牦牛肉中敵百蟲殘留量的LLE-GC-MS檢測方法研究

黃伊嘉，唐善虎，李思寧

（西南民族大學(xué)生命與科學(xué)技術(shù)學(xué)院，四川成都610041）

風(fēng)干牦牛肉是我國民族地區(qū)特色產(chǎn)品，因其天然原味，深受消費(fèi)者喜愛。然而，由于制作工藝傳統(tǒng)、生產(chǎn)方法局限，我國大多數(shù)傳統(tǒng)的腌制肉類產(chǎn)品仍然處在緩慢發(fā)展的低層次階段。因而受經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)動(dòng)，部分用于防腐、除蟲和滅鼠的農(nóng)藥被投入到生產(chǎn)過程中[1-2]。敵百蟲（C4H8O4Cl3P）是一種在漁業(yè)和畜牧業(yè)的生產(chǎn)中應(yīng)用比較廣泛的重要?dú)⑾x劑，作為有機(jī)磷酯類化合物，它具備殘留低、毒性小和效率高等特點(diǎn)，對線蟲、吸蟲類等的殺滅收效良好[3-4]。但敵百蟲在哺乳動(dòng)物的繁殖及其腦干神經(jīng)細(xì)胞存在明顯的毒副作用，這在最近幾年就有確切的證據(jù)顯示[5]。若食品中添加敵百蟲進(jìn)入人體，會傷害器官功能，遺傳物質(zhì)會因此發(fā)生改變。衛(wèi)生部2011年發(fā)布了《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)名單》，明確規(guī)定在火腿、臘肉、咸魚等制品中禁止添加敵百蟲[6]。然而，我國現(xiàn)有食品安全標(biāo)準(zhǔn)并未針對風(fēng)干牦牛肉中敵百蟲的殘留量做出限量要求。因此，開展風(fēng)干牦牛肉中敵百蟲殘留量的檢測方法研究意義重大。

目前，檢測農(nóng)產(chǎn)品中敵百蟲殘留的方法有紅外光譜法[7]、分子印跡法[8-9]、電化學(xué)法[10-11]、生物傳感技術(shù)[12-14]和色譜法等。其中研究較多、應(yīng)用較廣泛的主要是色譜法，檢測樣本包括水樣、植物、水產(chǎn)品和動(dòng)物制品等[15]。動(dòng)物源性食品的國家標(biāo)準(zhǔn)中對敵百蟲的檢測提出了液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法[16]，該方法具有靈敏度高、適用性廣、選擇性好等優(yōu)點(diǎn)，但對儀器和操作人員的水平要求較高，不具有普遍推廣性。對于動(dòng)物源性樣品的凈化，主要是采用凝膠滲透色譜法（gel permeation chromatography、GPC）和液液萃取法（liquid-liquid extraction、LLE）兩種凈化方式[17]。雖然GPC技術(shù)先進(jìn)，但溶劑消耗量大，儀器昂貴且運(yùn)行成本高，一般試驗(yàn)室不具備配備條件。因此，本研究將參考已有相關(guān)方法，通過一系列試驗(yàn)篩選確定最佳前處理方法和儀器分析條件，建立一種使用液液萃取-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法測定風(fēng)干牦牛肉中敵百蟲殘留量的新檢測方法，達(dá)到準(zhǔn)確、便捷、高效的分析要求。

1 材料與方法

1.1 試劑

敵百蟲標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：純度＞98%，德國DR.E公司；無水硫酸鈉（分析純）：在650℃灼燒4 h后貯于干燥器備用，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；乙酸鋅（分析純）：西隴化工股份有限公司；乙酸乙酯（色譜純）：成都市科隆化學(xué)品有限公司；乙腈（色譜純）：美國TEDIA公司；試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器設(shè)備

7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國Agilent公司；FJ-200可調(diào)高速均質(zhì)機(jī)：常州市金壇大地自動(dòng)化儀器廠；R-215旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：瑞士BUCHI公司；5804高速離心機(jī)：德國Eppendorf公司；ML204電子分析天平：瑞士Mettler Toledo公司；50mL離心管：美國Thermo Fisher公司；250 mL分液漏斗、三角漏斗、濃縮瓶：天津市天科玻璃儀器制造有限公司；0.20 μm的有機(jī)相針頭濾膜：天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatographic-mass spectrometric，GC-MS）條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱采用HP-5MS毛細(xì)管柱 [30 m×0.25 mm×0.25μm（膜厚）]，載氣為高純氦氣，恒流（流速1mL/min），進(jìn)樣量為2 μL，進(jìn)樣口溫度在一定范圍內(nèi)（200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300 ℃） 逐漸升高，進(jìn)樣方式分別選擇不分流和脈沖不分流兩種，柱箱升溫程序采用8種不同保持時(shí)間組合（3個(gè)階段溫度分別為：50、170、200℃）。

1.3.2 質(zhì)譜條件

EI源，轟擊電壓70 eV；離子源溫度230℃，四極桿溫度150℃，輔助接口溫度260℃；采集模式：全掃描和選擇離子監(jiān)測（selected ion monitor，SIM）；掃描范圍：50 amu～550 amu；溶劑延遲：根據(jù)出峰時(shí)間確定。特征選擇離子見表1。

表1 特征選擇離子和定量離子Table 1 Feature selection ions and quantitative ions

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 樣品制備

取一定量（250 g左右）的風(fēng)干牦牛肉樣品切成小塊，取樣方法采用四分法。所取的樣品平均分成2份，1份用于試驗(yàn)測定，另1份放置于冰箱中保存，備用。在組織搗碎機(jī)中粉碎待測樣品成勻漿或均勻粉狀[18]。

1.4.2 樣品提取

稱取樣品5.0 g、乙酸鋅0.5 g，加入50 mL離心管中，再加入一定濃度（水+乙腈體積比：1+9、2+9和1+1）乙腈溶液20 mL，使用均質(zhì)機(jī)均質(zhì)2 min，將離心管置于高速離心機(jī)中以一定速率（4 000、5 000、6 000 r/min）離心一定時(shí)間（2、3、4、5 min），轉(zhuǎn)移上清液至250 mL分液漏斗中。再向離心管中的殘?jiān)尤?0 mL乙腈溶液，均質(zhì)機(jī)均質(zhì)2 min，離心機(jī)離心一定時(shí)間，合并上清液于同一分液漏斗中[19]。

1.4.3 樣品凈化

將80 mL 20 g/L的硫酸鈉水溶液加入上述分液漏斗中，振蕩混勻。再向分液漏斗中加入20 mL選定的萃取溶劑（三氯甲烷、二氯甲烷和飽和乙酸乙酯），劇烈振蕩2 min，靜置分層，重復(fù)萃取兩次后合并萃取液。將萃取液通過無水硫酸鈉，濾入干凈干燥的濃縮瓶中，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮至近干，定量加入2 mL選定的溶劑。溶液使用漩渦混勻器混勻后通過0.20 μm有機(jī)相濾膜，過濾后上機(jī)測定。同時(shí)做空白對照[19-20]。

2 結(jié)果與討論

2.1 定量方法的確定

使用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀對敵百蟲標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行分析，根據(jù)相關(guān)研究報(bào)道可知，敵百蟲受熱后極易發(fā)生分解，三氯乙醛、亞磷酸二甲酯和敵敵畏是3種主要分解產(chǎn)物，見圖1、圖2。

圖1 敵百蟲標(biāo)準(zhǔn)溶液3.5 min～4.5 min全掃描圖Fig.1 Full scan chromatogram of trichlorfon from 3.5 min to 4.5 min

圖2 敵百蟲標(biāo)準(zhǔn)溶液10.5 min～12.5 min全掃描圖Fig.2 Full scan chromatogram of trichlorfon from 10.5 min to 12.5 min

由于存在分解會使測量敵百蟲母體變得非常困難，結(jié)果準(zhǔn)確性無法保證，因此可以通過測定分解產(chǎn)物的含量對敵百蟲進(jìn)行定量。在食品的農(nóng)殘分析中，某些分析對象自身常會含有微量的三氯乙醛或敵敵畏[21]，而在自然條件下亞磷酸二甲酯易分解，是一種在環(huán)境中極少可能會存在的農(nóng)藥中間體[22]，所以本方法選擇以亞磷酸二甲酯的含量對敵百蟲進(jìn)行定量。根據(jù)圖2中亞磷酸二甲酯的出峰時(shí)間，確定溶劑延遲時(shí)間為3.6 min。亞磷酸二甲酯質(zhì)譜全掃描如圖3。

圖3 亞磷酸二甲酯質(zhì)譜全掃描圖Fig.3 Full scan MS-spectrum of dimethyl phosphite

2.2 進(jìn)樣口溫度的確定

隨著進(jìn)樣口溫度的升高，敵百蟲的量逐漸減少，而分解產(chǎn)物的量逐漸增大[21]。進(jìn)樣口的溫度過低（200℃以下），對分析實(shí)際應(yīng)用意義不大，且極易污染進(jìn)樣口，最高可達(dá)到300℃。因此本試驗(yàn)在200℃～300℃范圍內(nèi)，通過逐步升高色譜進(jìn)樣口溫度，考察了進(jìn)樣口溫度變化對敵百蟲分解率的影響，見圖4。

圖4 亞磷酸二甲酯含量隨進(jìn)樣口溫度變化圖Fig.4 Dimethyl phosphite content diagram of different inlet temperature

溫度從200℃升至260℃時(shí)，亞磷酸二甲酯的含量逐漸增加，在260℃～300℃區(qū)間，含量趨于平緩，并達(dá)到相對穩(wěn)定的狀態(tài)。如選擇200℃～250℃溫度段，此時(shí)敵百蟲的分解量處在上升階段，樣品響應(yīng)值不理想且不穩(wěn)定的狀態(tài)會導(dǎo)致重現(xiàn)性不好。根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，選擇進(jìn)樣口溫度260℃較為適宜，該溫度也是氣相色譜分析中的常用溫度。

2.3 提取條件的選擇

作為極性較強(qiáng)的有機(jī)磷農(nóng)藥，敵百蟲在三氯甲烷、乙酸乙酯和乙腈等試劑中的溶解度較好，使用三氯甲烷或乙酸乙酯作為有機(jī)磷的提取溶劑比較常見。然而，蛋白、脂肪等雜質(zhì)在肉類食品中含量較高。而類脂化合物在乙腈中的溶解度較差，動(dòng)物蛋白又能很好的沉淀下來[23]，因此乙腈作為肉類食品的提取溶劑。常用為1+9或2+9乙腈溶液[19，23-24]，對于某些干肉類食品，可選用1+1乙腈溶液，以保證乙酸鋅的凈化作用。本試驗(yàn)分別使用1+9、2+9和1+1乙腈溶液對風(fēng)干牦牛肉樣品進(jìn)行兩次提取，同時(shí)做平行試驗(yàn)。考察不同濃度的乙腈溶液對提取率的影響，見表2。

表2 不同濃度乙腈溶液對樣品的提取率結(jié)果（n=3）Table 2 Sample extraction rate results in different concentrations of acetonitrile（n=3）

由表2結(jié)果可知，1+1乙腈溶液對樣品的提取率高于另外兩個(gè)濃度，且達(dá)到95%以上，滿足分析要求，因此提取溶劑選擇1+1乙腈溶液。

使用高速離心機(jī)分離提取時(shí)，查閱大量文獻(xiàn)，通常選用4 000 r/min離心3 min[19，23-24]。本試驗(yàn)選擇離心速率為4 000、5 000、6 000 r/min時(shí)分別對樣品液離心2 min～5 min，測定不同離心速率和時(shí)間組合的提取率，見表3。

表3 不同離心條件對樣液的提取率結(jié)果Table 3 Sample extraction rate results in different centrifugal conditions

由表3結(jié)果可知，當(dāng)離心速率為5 000 r/min以上，提取率可以達(dá)到97%，滿足分析要求。在此條件下增加離心速率和時(shí)間不會帶來提取率的顯著提升，因此遵循高效、簡捷的原則，確定離心條件為：以5 000 r/min的速率離心2 min。

2.4 凈化溶劑的選擇

查閱相關(guān)文獻(xiàn)可知，在肉類食品樣液的凈化過程，提取液常使用三氯甲烷、二氯甲烷和乙酸乙酯進(jìn)行凈化處理[19-20，23-24]。本試驗(yàn)使用三氯甲烷、二氯甲烷和飽和乙酸乙酯分別萃取提取液，比較萃取效果，見表4。

表4 不同凈化溶劑對提取液的萃取效果比較Table 4 Comparison of extraction effect in different purificants

根據(jù)表4比較結(jié)果，選擇飽和乙酸乙酯作為凈化溶劑。此處使用硫酸鈉飽和的乙酸乙酯，可以排除硫酸鈉水溶液中帶來部分水分的影響，同時(shí)在相轉(zhuǎn)移過程，減少了因更換不同溶劑造成萃取過程中樣品的損失。在風(fēng)干牦牛肉中加入敵百蟲標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果譜圖顯示了較少的雜質(zhì)峰，并且不會對目標(biāo)物的測定產(chǎn)生影響，表明凈化試驗(yàn)取得了理想的效果?？瞻兹芤骸悠啡芤?、添加敵百蟲樣品液全掃描和選擇離子掃描色譜圖如圖5～圖7。

圖5 空白對照溶液全掃描圖Fig.5 Full scan chromatogram of blank control

圖6 樣品溶液全掃描圖Fig.6 Full scan chromatogram of sample

圖7 樣品添加標(biāo)樣選擇離子掃描圖Fig.7 Sim scan chromatogram of spiked sample

2.5 進(jìn)樣方式的選擇

敵百蟲在進(jìn)樣時(shí)極易發(fā)生分解，因此研究了不分流和脈沖不分流兩種進(jìn)樣方式對其穩(wěn)定性的影響，見圖8。

由圖8可知，采用不同的進(jìn)樣方式時(shí)，敵百蟲分解產(chǎn)生亞磷酸二甲酯的含量存在顯著差異，因此選擇脈沖不分流的方式進(jìn)樣，更有助于利用其進(jìn)行定量分析。

圖8 亞磷酸二甲酯含量與進(jìn)樣方式的關(guān)系圖Fig.8 Dimethyl phosphite content diagram of different injection methods

2.6 柱箱程序時(shí)間的確定

考察亞磷酸二甲酯含量在8組不同保持時(shí)間組合（如表5）的柱箱程序中的變化（如圖9），選擇最佳柱箱程序?yàn)椋?0℃保持2 min，10℃/min升至170℃保持3 min，20℃/min升至200℃保持1 min。

表5 8組不同保持時(shí)間組合Table 5 8 groups of different hold time

圖9 亞磷酸二甲酯含量與柱箱程序的關(guān)系圖Fig.9 Dimethyl phosphite content diagram of different oven programs

2.7 線性范圍

用乙酸乙酯逐級稀釋濃度為100 μg/mL的敵百蟲標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成濃度為 0.05、0.1、0.5、1、2、5 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。按上述測定條件上機(jī)測定，以亞磷酸二甲酯的定量離子峰面積對濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在0.05 μg/mL～5 μg/mL 濃度范圍內(nèi)，峰面積（Y）與濃度（X）的線性回歸方程為Y=4 310 000X+52 173，線性相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.999 9，線性關(guān)系良好。

2.8 方法精密度與回收率

稱取5.0 g風(fēng)干牦牛肉空白樣品，分別加入敵百蟲標(biāo)準(zhǔn)溶液0.25、0.5、10 μg作為3個(gè)加標(biāo)水平，同時(shí)各做6份平行處理，按照1.4的處理方法制備樣品加標(biāo)溶液，精密度與回收率試驗(yàn)結(jié)果見表6～表7。

由表中數(shù)據(jù)可以看出，樣品的RSD為2.8%～5.1%，本方法的室內(nèi)精密度試驗(yàn)結(jié)果符合測定的要求。加標(biāo)3個(gè)水平樣品回收率范圍為85.3%～102.3%，本方法的回收率結(jié)果理想，符合農(nóng)藥殘留檢測的要求。查閱其他相關(guān)文獻(xiàn)方法，殷帥等[19]使用乙腈-三氯甲烷-正己烷液液萃取法處理干制魚樣品，GC-MS上機(jī)測試，所得精密度范圍為4.3%～6.9%，回收率范圍為84.8%～107.7%；張衛(wèi)鋒等[20]使用乙腈-乙酸乙酯液液萃取法處理咸魚樣品，GC-FPD上機(jī)測試，所得精密度范圍為3.82%～5.80%，回收率范圍為84%～99%；農(nóng)業(yè)部783號公告-3-2006《水產(chǎn)品中敵百蟲殘留量的測定氣相色譜法》[24]使用乙腈-三氯甲烷液液萃取法處理水產(chǎn)品樣品，氣相色譜法上機(jī)測試，所得精密度≤10%，回收率≥75%。對比可知本方法的精密度與回收率結(jié)果均較其它方法更理想。

表6 精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Table 6 Results of precision test（n=6）

表7 回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 7 Results of recovery test

2.9 方法檢出限

對風(fēng)干牦牛肉空白樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，在敵百蟲標(biāo)準(zhǔn)品添加水平為0.02 mg/kg時(shí)，得到亞磷酸二甲酯定性離子的信噪比等于3，因此本方法的檢出限為0.02 mg/kg。查閱其他相關(guān)文獻(xiàn)方法，農(nóng)業(yè)部783號公告-3-2006《水產(chǎn)品中敵百蟲殘留量的測定氣相色譜法》[24]使用乙腈-三氯甲烷液液萃取法處理水產(chǎn)品樣品，氣相色譜法上機(jī)測試，所得檢出限結(jié)果為0.04 mg/kg。對比可知本方法的檢出限水平高于標(biāo)準(zhǔn)使用的液液萃取-氣相色譜法，可以滿足敵百蟲限量檢測的要求。本方法改進(jìn)了前處理過程中使用的萃取溶劑的種類和濃度，提高了前處理效率，使用了定量更準(zhǔn)確的GC-MS法進(jìn)行上機(jī)測試，優(yōu)化了儀器參數(shù)，針對被檢樣品特性使儀器達(dá)到最佳檢測狀態(tài)，因此本方法更具有推廣泛先進(jìn)性。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法，選擇最佳儀器分析條件，線性相關(guān)性和結(jié)果精密度均能滿足敵百蟲的測定要求。前處理方法選取適合的提取和凈化條件組合進(jìn)行萃取，有效減少中間步驟帶來的損失，且試劑相比傳統(tǒng)方法用量更合理，回收率更好。使用本方法測定風(fēng)干牦牛肉中的敵百蟲殘留，操作簡捷、靈敏度高、重復(fù)性好、雜質(zhì)干擾少、測定結(jié)果達(dá)到了我國對敵百蟲殘留分析的要求。該研究為肉類敵百蟲的檢測提供了新方法，對風(fēng)干牦牛肉中敵百蟲檢測和安全監(jiān)控具有重要意義。