杏鮑菇多糖鋅螯合物的制備工藝及其抗氧化活性

顧冰飛，趙圓圓，陳義勇

（常熟理工學院生物與食品工程學院，江蘇常熟215500）

鋅是生物體正常生長發(fā)育所必需的微量元素之一，是很多種酶的活性中心物質(zhì)，發(fā)揮著催化和調(diào)節(jié)的作用[1]。研究表明，缺鋅會導致兒童發(fā)育遲緩[2]、心血管疾病[3]、學習記憶能力降低[4]等。目前補鋅劑多以無機形式存在，無機鋅不易吸收且攝入過多會產(chǎn)生一定的毒害作用，與無機鋅相比，有機鋅易被人體吸收且生物學效價高[5]。近年來，多糖鋅螯合物作為一種有機鋅補充劑成為研究熱點，目前報道的通過人工合成的多糖鋅螯合物如金針菇多糖-Zn2＋螯合物[6-7]、肉蓯蓉多糖鋅[8]、蛹蟲草基質(zhì)多糖鋅配合物[9]、酵母多糖鋅配合物[10]、豬苓多糖鋅配合物[11]等，研究發(fā)現(xiàn)這些人工合成的多糖鋅復合物有望被開發(fā)成一種新型補鋅劑。

杏鮑菇（Pleurotus eryngii）又名刺芹側(cè)耳，隸屬傘菌目、側(cè)耳科、側(cè)耳屬，是一種珍貴食用菌[12]。多糖是杏鮑菇主要成分之一，目前對杏鮑菇多糖（Pleurotus eryngii polysaccharides，PEP）研究主要集中在生物活性如抗腫瘤[13-14]、降血糖[15]、抑菌[16]、保濕[17]、抗疲勞[18]、提高免疫力[19]等及提取[20-23]、乙酰化修飾[24]、羧甲基化修飾[25]等方面。金屬離子如 Fe2＋、Co2＋、Cu2＋、Zn2＋等對硬軟配體都有一定親和性，能分別與軟硬離子競爭配體形成絡合物[26]。多糖與鋅離子的螯合原理主要是由于多糖中的-OH和-COO-與鋅離子發(fā)生了配位[8]。但對于杏鮑菇多糖與微量元素的螯合及其生物活性的研究尚未見報道。

因此本研究以PEP為對象，通過響應面分析法優(yōu)化杏鮑菇多糖鋅螯合物（Pleurotus eryngii polysaccharides-zinc（II）chelate，PEP-Zn）的制備工藝，通過紅外光譜PEP和PEP-Zn結(jié)構(gòu)進行初步表征，并對PEP和PEP-Zn的抗氧化性進行研究，為開發(fā)杏鮑菇多糖鋅螯合物這一新型具有抗氧化活性的補鋅劑提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

杏鮑菇：常熟市農(nóng)貿(mào)市場；DPPH：深圳欣博盛生物科技有限公司；三羥甲基氨基甲烷：蘇州亞科科技股份有限公司；硫酸鋅、水楊酸、焦性沒食子酸、過氧化氫、無水乙醇、鹽酸等均為分析純。

1.2 儀器與設備

DF-101S恒溫加熱磁力攪拌器：金壇市友聯(lián)儀器研究所；722型數(shù)顯可見分光光度計：上海光學儀器五廠有限公司；小型高速粉碎機：山東維諾醫(yī)藥設備制造有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：北京成萌偉業(yè)科技有限公司；HH-2智能數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州國華電器有限公司；SHB-B95循環(huán)水式多用真空泵：鄭州世紀雙科實驗儀器有限公司；IRTracer-100傅里葉變換紅外光譜儀：日本島津公司；TAS-990原子吸收分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3 方法

1.3.1 PEP的制備

杏鮑菇經(jīng)過洗滌、干燥、粉碎過篩，按料液比1∶30（g/mL）將杏鮑菇粉和蒸餾水混合，90℃熱水浸提 3 h，離心（4 000 r/min，10 min）后合并上清液，用Sevage法[27]除去上清液中的蛋白，離心后收集上清液，然后加入4倍體積的95%乙醇，4℃醇沉24 h后離心（4 500 r/min，15min），將沉淀冷凍干燥得到 PEP。

1.3.2 PEP-Zn的制備

PEP-Zn的制備參考黃靖等[8]的方法并根據(jù)預試驗結(jié)果對試驗參數(shù)進行調(diào)整。準確稱取0.25 g杏鮑菇多糖溶于100 mL蒸餾水，充分溶解得到2.5 g/L的多糖溶液。取25 mL多糖溶液然后加入等體積的ZnSO4溶液（0.15 mol/L），調(diào)節(jié)混合液pH值為5，然后50℃條件下攪拌反應3 h。反應液經(jīng)流水透析48 h，透析液經(jīng)冷凍干燥后得到PEP-Zn。

1.3.3 PEP-Zn螯合率的測定

鋅標準曲線繪制：分別配置濃度為 0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4、2.8 mg/L 的 ZnSO4標準溶液，用火焰原子吸收分光光度計測定，橫、縱坐標分別為鋅離子濃度和吸光度，繪制標準曲線，得到方程：Y=0.272 1X+0.05，R2=0.978 1，式中：Y為吸光度；X為鋅離子濃度，mg/L。

將PEP-Zn溶于1L蒸餾水，充分溶解。根據(jù)預試驗及鋅標準曲線的數(shù)據(jù)，將溶液稀釋10倍。稀釋液經(jīng)過濾，用火焰原子吸收分光光度計測定，根據(jù)吸光度得出螯合前和螯合后鋅離子濃度（mg/L），分別記為C0和C，根據(jù)以下公式計算螯合率：

1.3.4 單因素試驗

1.3.4.1 螯合時間對PEP-Zn螯合率的影響

取25mL杏鮑菇多糖溶液（2.5g/L）和等體積硫酸鋅溶液（0.15mol/L），將兩者混合均勻，調(diào)節(jié)混合溶液pH值為5，螯合溫度為50℃，考察不同螯合時間（2、3、4、5 h）對PEP-Zn螯合率的影響，確定最佳螯合時間。

1.3.4.2 螯合溫度對PEP-Zn螯合率的影響

取25 mL杏鮑菇多糖溶液（2.5 g/L）和等體積硫酸鋅溶液（0.15 mol/L），將兩者混合均勻，調(diào)節(jié)混合溶液pH值為5，螯合時間為3 h，考察不同螯合溫度（40、50、60、70℃）對PEP-Zn螯合率的影響，確定最佳螯合溫度。

1.3.4.3 螯合pH值對PEP-Zn螯合率的影響

取25 mL杏鮑菇多糖溶液（2.5 g/L）和等體積硫酸鋅溶液（0.15 mol/L），將兩者混合均勻，螯合時間為3 h，螯合溫度為 50 ℃，考察不同螯合 pH 值（4、5、6、7）對PEP-Zn螯合率的影響，確定最佳螯合pH值。

1.3.5 響應面試驗設計

以單因素試驗結(jié)果為基礎，采用Box-Benhnken中心組合試驗設計，設計螯合時間、螯合溫度、螯合pH值三因素三水平的回歸方程以擬合各因素與響應值螯合率的關系，利用Design-Expert 8.0.6軟件系統(tǒng)進行響應面分析，以得到PEP-Zn的最優(yōu)制備工藝。

1.3.6 PEP及PEP-Zn的結(jié)構(gòu)表征

將PEP和PEP-Zn粉末充分干燥后，分別取5 mg與KBr充分混勻后壓片，進行紅外光譜掃描。波數(shù)范圍 400 cm-1～4 000 cm-1，對 PEP 與 PEP-Zn 的紅外光譜圖進行對比分析。

1.3.7 抗氧化活性測定

1.3.7.1 DPPH自由基清除能力測定

配置0.1 mmol/L的DPPH乙醇溶液，避光保存?zhèn)溆?。在試管中分別加入不同濃度的PEP和PEP-Zn溶液 （0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）2.0 mL 以 及 2.0 mL DPPH溶液，搖勻、室溫下避光反應30 min，于517 nm處進行吸光度測定，2 mL蒸餾水分別代替PEP和PEP-Zn溶液及2 mL DPPH乙醇溶液（0.1 mmol/L）反應作為空白參比，測定OD517值，以蒸餾水作參比調(diào)零[28]。DPPH自由基清除率計算公式如下：

式中：A1為蒸餾水替代DPPH測得的吸光度；A2為不同濃度PEP及PEP-Zn測得的吸光度；A3為蒸餾水替代PEP及PEP-Zn測得的吸光度。

1.3.7.2 羥基自由基清除能力的測定

配置9.0 mmol/L的FeSO4溶液，9.0 mmol/L的水楊酸乙醇溶液以及8.8 mmol/L的H2O2溶液備用。分別向各試管中加入1 mL的FeSO4、1 mL的水楊酸乙醇溶液，混勻后加入不同濃度的PEP和PEP-Zn溶液（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）1.0 mL，再加入 1.0 mL H2O2啟動反應。混勻后于37℃水浴加熱反應30 min，測定OD510值[29]。羥基自由基的清除率計算公式如下：

式中：A1為以蒸餾水代替水楊酸測得的吸光度；A2為不同濃度PEP及PEP-Zn測得的吸光度；A3為以蒸餾水代替不同濃度PEP及PEP-Zn測得的吸光度。

1.3.7.3 超氧陰離子自由基清除能力測定

配置 50 mmol/L，pH 8.2的 Tris-HCl緩沖液，7 mmol/L焦性沒食子酸溶液，10 mol/L HCl溶液備用。向試管中加入4.5 mL Tris-HCl緩沖液（50 mmol/L，pH 8.2），1 mL不同濃度的PEP及PEP-Zn溶液（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）以及 3.2 mL 蒸餾水，混勻后于25℃水浴20 min。隨后加入0.3 mL鄰苯三酚溶液（7 mmol/L），搖勻，25℃水浴加熱3 min后立即滴入1滴HCl（10 mol/L）溶液終止反應，測定OD325值[30]。超氧陰離子自由基清除率計算公式如下。

式中：A為不同濃度PEP及PEP-Zn測得的吸光度；A0為以蒸餾水代替不同濃度PEP及PEP-Zn測得的吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 PEP-Zn的制備工藝優(yōu)化

2.1.1 單因素試驗

2.1.1.1 螯合時間對PEP-Zn螯合率的影響

螯合時間對PEP-Zn螯合率的影響見圖1。

圖1 螯合時間對PEP-Zn螯合率的影響Fig.1 Effect of chelating time on the chelation rate of PEP-Zn

根據(jù)圖1，螯合時間對PEP-Zn的螯合率影響較為顯著。在2 h～4 h，隨著螯合時間不斷增長，螯合率顯著上升。螯合時間達到4 h時，螯合率達到最大值53.6%。超過4 h后，隨著螯合時間的增長，螯合率逐步表現(xiàn)出下降勢態(tài)。其主要原因在于延長了螯合時間，促使PEP與硫酸鋅兩者有了更為緊密的接觸反應，使得螯合率不斷升高。但是螯合時間的不斷延長，在一定程度上破壞了體系的穩(wěn)定性，使其副反應的發(fā)生率增高，導致部分配合物開始解離，從而造成螯合率的顯著降低[25]。因此PEP-Zn制備的最佳螯合時間為4 h。

2.1.1.2 螯合溫度對PEP-Zn螯合率的影響

螯合溫度對PEP-Zn螯合率的影響見圖2。

根據(jù)圖2可知，螯合溫度對PEP-Zn螯合率影響較為顯著。在40℃～60℃之間，隨著螯合溫度持續(xù)升高的情況下，螯合率呈現(xiàn)出不斷增長的趨勢。溫度在60℃的條件下，螯合率升到最大值44.9%。但是當螯合溫度大于60℃并繼續(xù)升高時，螯合率表現(xiàn)出下降的態(tài)勢。主要原因可能是，螯合溫度在一定范圍內(nèi)增加，促進PEP的溶脹，利于ZnSO4滲透到多糖顆粒內(nèi)部，分子間有效碰撞的幾率得到增加，使得螯合率顯著增大。溫度超過60℃后，過高的溫度易導致PEP的分解，反而降低了螯合效率。因此PEP-Zn制備的最佳螯合溫度為60℃。

圖2 螯合溫度對PEP-Zn螯合率的影響Fig.2 Effect of chelating temperature on the chelation rate of PEP-Zn

2.1.1.3 螯合pH值對PEP-Zn螯合率的影響

螯合pH值對PEP-Zn的影響如圖3所示。

圖3 螯合pH對PEP-Zn螯合率的影響Fig.3 Effect of chelating pH on the chelation rate of PEP-Zn

當螯合pH值在4.0～7.0范圍內(nèi)，隨著pH值的增大，螯合率先上升后下降。pH值為5時，螯合率達到最大值43.7%。pH值為7時，產(chǎn)生了Zn（OH）2沉淀，不利于螯合反應的進行。因此PEP-Zn制備的最佳螯合pH值為5。

2.1.2 PEP-Zn制備工藝條件優(yōu)化

2.1.2.1 響應模型的建立與分析

基于單因素試驗結(jié)果，以螯合率為指標，試驗設計因素及水平取值見表1，Box-Behnken試驗設計及響應值螯合率結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

利用Design-Expert 8.0.6對表2中的數(shù)據(jù)進行分析，在對各因素進行回歸分析后得到響應值螯合率（Y）對螯合時間（A）、螯合溫度（B）、pH值（C）的三元二次回歸方程：

表1 試驗設計因素及水平取值Table 1 Factors and levels designed for response surface analysis

表2 Box-Behnken試驗設計及螯合率響應值Table 2 Box-Behnken design with response values for chelation rate

表3 回歸模型方差分析Table 5 Analysis of variance for the fitted quadratic polynomial model

由表3方差分析結(jié)果可知，本試驗所選用的模型極顯著（P＜0.001），且方程失擬項不顯著（P=0.293 9＞0.05），說明未知因素對試驗影響較小，此模型合適本試驗。R2=0.994 0，表明該模型具有相對較優(yōu)的擬合程度，在評估相關因素對PEP-Zn螯合率的影響時較為準確，可用來對PEP-Zn制備工藝研究進行分析和預測。一次項C因素對螯合率的線性效應極為顯著（P＜0.001），交互項 AB、AC、BC 及二次項 A2、B2、C2對響應值螯合率均有顯著影響（P＜0.001）。

2.1.2.2 響應面圖分析

圖4～圖6中的響應面三維模型圖顯示了螯合時間、螯合溫度和螯合pH值中任意選取一個變量為零水平時，另外兩個變量對PEP-Zn螯合率的影響，據(jù)此可分析各影響因素對PEP-Zn螯合率的影響及兩因素間的交互作用。

圖4 螯合時間和螯合溫度對螯合率的影響Fig.4 Effect of chelating time and chelating temperature on chelation rate

圖5 螯合時間和螯合pH值對螯合率的影響Fig.5 Effect of chelating time and chelating pH on chelation rate

由圖4～圖6可知，當一個因素取零水平時，另外兩個因素同時發(fā)生變化，隨著兩因素變量的加大，PEP-Zn螯合率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。螯合時間與螯合pH值、螯合溫度與pH值及螯合時間與螯合溫度之間的交互作用非常顯著。

圖6 螯合溫度和螯合pH值對螯合率的影響Fig.6 Effect of chelating temperature and chelating pH on chelation rate

2.1.2.3 最佳工藝條件確定及驗證試驗

對響應面試驗結(jié)果進行分析，根據(jù)Design-Expert.V8.0.6軟件得到分析數(shù)據(jù)，可知PEP-Zn制備工藝的最佳工藝條件：螯合時間為3.73 h，螯合溫度為58.50℃，螯合pH值為4.29，在該條件下，PEP-Zn螯合率預測值為64.3%。

為確保試驗的可行性，驗證試驗采取的工藝條件適當調(diào)整為，螯合時間為4 h，螯合溫度為58℃，螯合pH值為4，在該工藝條件下測得PEP-Zn的螯合率為63.8%，與預測值相比，誤差較小，說明該模型可行。

2.2 PEP與PEP-Zn紅外光譜分析

PEP與PEP-Zn紅外光譜分析如圖7所示。

圖7PEP與PEP-Zn紅外光譜圖Fig.7 Infrared spectra of PEP and PEP-Zn

PEP與PEP-Zn都具有多糖類物質(zhì)的紅外特征峰，在3 440 cm-1強峰為O-H的伸縮振動峰，在2 900 cm-1波數(shù)處是C-H的伸縮振動峰，與PEP相比，PEP-Zn的吸收峰有所減弱。在1 600 cm-1及1 384 cm-1波數(shù)處，PEP表現(xiàn)出異常顯著的C=O伸縮振動，而PEP-Zn在這兩處的吸收峰都有所減弱，揭示Zn2+可能與羧酸或羧酸鹽之間形成了配位鍵，且Zn2+多與C=O基團發(fā)生配位反應，加上羥基參與反應，形成強烈的氫鍵締合，加強了分子間作用。由于紅外光譜給出的結(jié)構(gòu)信息僅僅是相關官能團連接方式及類型[31]，對PEP-Zn的結(jié)構(gòu)反映不全面，因此對其結(jié)構(gòu)需要進一步研究。

2.3 PEP與PEP-Zn的抗氧化活性

2.3.1 PEP與PEP-Zn對DPPH自由基的清除作用

PEP與PEP-Zn對DPPH自由基的清除作用見圖8。

圖8PEP和PEP-Zn對DPPH自由基的清除作用Fig.8 DPPH radicals scavenging effect of PEP and PEP-Zn

從圖8可知，PEP、PEP-Zn兩者對DPPH自由基清除作用明顯，且在濃度不斷增大的條件下，清除作用也隨之增強。與PEP相比，PEP-Zn對DPPH自由基清除作用減弱，原因可能與結(jié)合鋅離子位點的數(shù)目及結(jié)合強度有關，導致PEP分子的空間構(gòu)象發(fā)生改變，從而導致PEP-Zn對DPPH自由基清除作用降低，具體原因還需進一步研究。

2.3.2 PEP與PEP-Zn對羥基自由基的清除作用

PEP與PEP-Zn對羥基自由基的清除作用見如圖9所示。

圖9 PEP和PEP-Zn對羥基自由基的清除作用Fig.9 Hydroxyl radicals scavenging effect of PEP and PEP-Zn

當多糖濃度低于1 mg/mL時，PEP及PEP-Zn對羥基自由基的清除作用隨著濃度增大而增強。PEP與PEP-Zn對羥基自由基最大清除率分別達到33.8%和42.2%，PEP-Zn對羥基自由基的清除率較PEP有顯著提升?？赡苁且驗镻EP-Zn與鋅配合后，導致配位部分增強與暴露的活性基團之間的作用，進而促進與自由基的作用增大[32]。

2.3.3 PEP與PEP-Zn對超氧陰離子（O2-·）的自由基清除作用

PEP與PEP-Zn對超氧陰離子（O2-·）的自由基清除作用如圖10所示。

圖10 PEP和PEP-Zn對超氧陰離子（O2-·）自由基的清除作用Fig.10 Superoxide anion（O2-·）free radicals scavenging effect of PEP and PEP-Zn

當多糖濃度低于1 mg/mL時，PEP和PEP-Zn對超氧陰離子自由基的清除作用隨濃度增大而增強。PEP與PEP-Zn對超氧陰離子自由基的最大清除率值分別達到14.1%和27%。PEP-Zn對O2-·自由基的清除能力比PEP有明顯的提升，這可能是由于PEP與鋅配合后，與自由基反應生成的中間體可能更加穩(wěn)定，導致清除自由基的能力增大[33]。由此可見，對PEP進行鋅離子的螯合有利于提升其對超氧陰離子自由基的清除能力。

3 結(jié)論

本研究通過響應面法優(yōu)化確定了PEP-Zn制備工藝的最佳工藝條件為：螯合時間為3.73 h，螯合溫度為58.5℃，螯合pH值為4.29，在該條件下，PEP-Zn螯合率為64.3%。與PEP相比，PEP-Zn對DPPH自由基清除作用減弱，對羥基自由基和超氧陰離子的清除率增強，修飾后抗氧化活性變化的機理還不是很清楚，還需進一步深入研究，本研究成果為開發(fā)PEP-Zn作為一種新型的具有抗氧化活性的補鋅劑提供了一定的理論依據(jù)。