疫苗中和抗體效價-時間曲線下面積在豬瘟疫苗免疫效果評價中的應(yīng)用

韓永剛 劉 浩 趙 毅

（1 陜西省漢中市漢臺區(qū)畜牧獸醫(yī)技術(shù)推廣中心， 陜西 漢中 723000； 2 陜西省動物衛(wèi)生與屠宰管理站， 陜西 西安 710000；3 陜西省動物疫病預(yù)防控制中心， 陜西 西安 723000）

豬瘟（Classical Swine Fever, CSF）是由豬瘟病毒引起的一種豬的高度接觸性、出血性和致死性傳染病，該病傳染性強、致死率高，嚴重威脅著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。世界動物衛(wèi)生組織將其列為必須報告的動物疫病，中國將其列為一類動物疫病?！秶抑虚L期動物疫病防治規(guī)劃（2012—2020 年）》 及《國家豬瘟防治指導(dǎo)意見（2017—2020 年）》提出要求：到2020 年底，全國所有種豬場和部分區(qū)域達到豬瘟凈化標準，并進一步擴大豬瘟凈化區(qū)域范圍。

豬瘟凈化的標準是指“連續(xù)24 個月以上，種豬場、區(qū)域內(nèi)無豬瘟臨床病例，豬瘟病毒野毒感染病原學(xué)檢測陰性”。目前，普通豬場在凈化豬瘟的過程中，首先將其建成為豬瘟穩(wěn)定控制場，即在豬場內(nèi)采用豬瘟病毒E2蛋白滅活疫苗免疫6～8 個月，當傳統(tǒng)豬瘟C 株活疫苗免疫產(chǎn)生的E0 抗體完全消失后，淘汰場內(nèi)所有豬瘟野毒感染產(chǎn)生的E0 抗體陽性的豬只。顯然，使用豬瘟病毒E2 蛋白滅活疫苗對豬場內(nèi)所有豬只進行免疫是建立豬瘟穩(wěn)定控制場的一項必要的步驟。

豬瘟病毒E2 蛋白滅活疫苗產(chǎn)品中的豬瘟病毒E2 蛋白含量盡管符合官方標準，但由于存在生產(chǎn)工藝、生產(chǎn)批次的差異，疫苗中抗原蛋白空間構(gòu)象、抗原含量不盡相同，疫苗在豬只體內(nèi)達到的免疫效果會有一定差異，進而影響臨床上豬瘟凈化工作。因此，開展不同來源、批次的豬瘟病毒E2 蛋白滅活疫苗及豬瘟C 株活疫苗產(chǎn)品臨床免疫效果評價，是豬瘟凈化的必要工作。

血藥濃度- 時間曲線下面積（Area Under the Curve,AUC）指血藥濃度隨時間變化的動態(tài)過程，以血藥濃度為縱坐標，以時間為橫坐標繪制的曲線與橫坐標軸之間的面積。AUC 代表藥物的生物利用度，AUC 大則生物利用度高，反之則低。AUC0-∞指藥物從零時間至所有原形藥物全部消除這一段時間的藥時曲線下總面積，反映藥物進入血循環(huán)的總量[1]。它代表一次用藥后的吸收總量，反映藥物的吸收程度。同一受試者，AUC大，表示吸收利用程度大。生物利用度研究就是在同一受試者中比較兩個制劑AUC 的大小。與此評價有關(guān)的指標還包括血藥濃度達峰時間（peak time,Tmax）和血漿藥物達峰濃度（peak concentration,Cmax），通常用AUC反映藥物的吸收程度，以Cmax和Tmax的大小綜合反映藥物制劑的吸收、分布、排泄和代謝情況。在同一受試者中，Cmax和Tmax主要與藥物制劑有關(guān)。

為了探求一種系統(tǒng)、嚴格且較為準確的免疫效果的血清學(xué)評價方法，以豬瘟病毒E2 蛋白滅活疫苗免疫中和抗體效價代替血藥濃度，建立了抗體效價-時間曲線下面積指標，進行豬瘟疫苗免疫效果的血清學(xué)綜合評價，以優(yōu)選豬瘟疫苗，促進豬瘟凈化的實施和完成。

1 具體實施方法

為便于更好地理解技術(shù)評價方案，以下結(jié)合已有的中和抗體檢測數(shù)據(jù)對本方案作進一步的詳細說明。

1.1 建立基準曲線

選定一個豬瘟凈化達標的豬場W 或SPF 無特定病原豬場，在該豬場內(nèi)建立一個豬瘟病毒E2 蛋白滅活疫苗免疫效果評價的基準曲線Q，基準曲線Q 的建立按照下述步驟依次完成，

⑴商品豬免疫標準的豬瘟病毒E2 蛋白滅活疫苗后，在0、14、28、56、84、112、140、168、196 日采集血樣，每個采樣日的血樣為3～5 份，分離血清后冷凍保存。

⑵檢測血清樣品的中和抗體效價，計算每個采樣日多份血清樣品中E2 抗體效價的平均值H，見表1。

⑶將表1 中各數(shù)據(jù)代入計算公式Sn=（Hn＋Hn-1）×L/2，計算相鄰兩個采樣日H 值兩點連線下的面積Sn，式中：n 為采樣日，n-1 為上一個采樣日，Hn為某個采樣日E2 抗體效價的平均值，Hn-1為上一個采樣日E2 抗體效價的平均值，L 為相鄰兩個采樣日之間的間隔天數(shù)。

例如，采樣日n 為14，Hn為H14=4.0，Hn-1=H0=3.2，L=14-0=14，則S14=（H14＋H0） ×L/2=（4.0 ＋3.2） ×14÷2=50.4；采樣日n 為28，Hn為H28=6.0，Hn-1=H14=4.0，L=28-14=14，則S28=（H28＋H14）×L/2=（6.0＋4.0）×14÷2=70；采樣日n 為112，Hn為H112=12.0，Hn-1=H84=11.2，L=112-84=28，則S112=（H112＋H84） ×L/2=（12.0＋11.2）×28÷2=324.8；將表1 中其余各數(shù)據(jù)帶入上述公式計算，即可得到如下表1 所列相應(yīng)數(shù)據(jù)。

⑷將表1 中的各個Sn數(shù)據(jù)帶入計算公式Mn=Sn＋Sn-1＋Sn-2＋…中，計算出對應(yīng)于各采樣日豬瘟E2 抗體效價-時間曲線下累加面積Mn，式中：Sn-1為上一個采樣日的E2 抗體效價的平均值與它前一個采樣日的E2 抗體效價的平均值兩點連線下的面積，Sn-2為n-2 采樣日的E2 抗體效價的平均值與它前一個采樣日的E2 抗體效價的平均值兩點連線下的面積，

例如，采樣 日n 為14，Sn為S14，Sn-1為S0，則Mn=M14=S14＋S0=50.4＋0=50.4；采樣日n 為28，Sn為S28，Sn-1為S14，則Mn=M28=S2＋S14=70.0＋50.4=120.4；采樣日n 為56，Sn為S56，Sn-1為S28，Sn-2為S14，則Mn=M56=S56＋S28＋S14=S56＋M28=189.0 ＋120.4=309.4；將表1 中其余各數(shù)據(jù)帶入上述計算式，即可得到如下表1 所列相應(yīng)數(shù)據(jù)。

表1 豬瘟凈化達標場內(nèi)豬瘟E2 滅活疫苗A 免疫中和抗體效價均值Hn[2]、 中和抗體效價-時間曲線下面積Sn 以及中和抗體效價-時間曲線下累加面積Mn 數(shù)值表

⑸以采樣日n 為橫坐標，病毒E2 蛋白滅活疫苗A抗體效價-時間曲線下面積累加值Mn為縱坐標，即生成在豬瘟凈化達標豬場W 內(nèi)商品豬免疫標準的豬瘟病毒E2 蛋白滅活疫苗后建立的疫苗免疫效果評價基準曲線Q，如圖1。

該基準曲線采用EXCEL 制表軟件擬合多項式為：Y=0.012X2＋7.3797X-93.095

其中：X 為采樣日距E2 疫苗免疫日的間隔天數(shù)，Y為采樣日的E2 疫苗免疫抗體效價-時間曲線下面積累加值，R2為多項式與散點圖擬合度，取值范圍0≤R≤1，R=1 時為完全重合。

圖1 豬瘟病毒E2 蛋白滅活疫苗免疫效果評價基準曲線

1.2 建立參比曲線

在豬場W 內(nèi)，參照基準曲線建立過程，建立一個豬瘟病毒C 株活疫苗B 免疫效果評價的參比曲線P1，P1的數(shù)據(jù)及建立過程見表2。

⑴商品豬免疫待評估的豬瘟病毒C 株活疫苗B 后，在0、14、28、56、84、112、140、168、196 日采集血樣，每個采樣日的血樣為3～5 份，分離血清后冷凍保存。

⑵與1.1⑵步驟相同，計算每個采樣日多份免疫豬瘟活疫苗B 血清樣品中和抗體效價的平均值H，見表2。

⑶將表2 中各H 數(shù)據(jù)代入計算公式Sn=（Hn＋Hn-1）×L/2，計算免疫豬瘟活疫苗B 后各采樣日中和抗體效價的平均值與它前一個采樣日的E2 抗體效價的平均值兩點連線下的面積Sn，將表2 中其余各數(shù)據(jù)帶入上述公式計算，即可得到表2 所列數(shù)據(jù)。

⑷將表2 中各Sn數(shù)據(jù)帶入計算公式Mn=Sn＋Sn-＋Sn-2＋…中，計算對應(yīng)于各采樣日免疫豬瘟活疫苗B 抗體效價-時間曲線下累加面積Mn。將表2 中其余各數(shù)據(jù)帶入上述計算式，即可得到表2 所列數(shù)據(jù)。

⑸以采樣日n 為橫坐標，免疫豬瘟活疫苗B 中和抗體效價-時間曲線下面積累加值Mn為縱坐標，即生成在豬場W 內(nèi)使用待評估的豬瘟病毒C 株活疫苗B 的免疫效果評價參比曲線P1，如圖2。表2 豬瘟凈化達標場內(nèi)豬瘟活疫苗B 免疫抗體效價均值Hn[2]、 中和抗體效價-時間曲線下面積Sn、 中和抗體效價-時間曲線下累加面積Mn數(shù)值表

圖2 待評估的豬瘟病毒C 株活疫苗B 的免疫效果評價參比曲線

表2 豬瘟凈化達標場內(nèi)豬瘟活疫苗B 免疫抗體效價均值Hn[2]、 中和抗體效價-時間曲線下面積Sn、 中和抗體效價-時間曲線下累加面積Mn 數(shù)值表

1.3 指標對比

將參比曲線P1 與基準曲線Q 放在同一坐標系內(nèi)，如圖3 所示，先做幾何學(xué)初步判定，然后做統(tǒng)計學(xué)判定。

1.3.1 幾何學(xué)初步判定方法

先看參比曲線與基準曲線的重合度，再看參比曲線是在基準曲線的左上側(cè)還是右下側(cè)，最后看參比曲線中免疫112 天后的線段是否有相對于基準曲線向下偏離的形態(tài)，若重合度嚴重不好的，基本斷定為該疫苗與E2基準疫苗免疫效果相差較大。

圖3 參比曲線P1 與基準曲線Q 在同一坐標系的比較圖

1.3.2 統(tǒng)計學(xué)判定方法

對于與基準曲線重合度較好的參比曲線，即處于基準曲線的左上側(cè)，或雖處于基準曲線右下側(cè)卻十分接近基準曲線，而且參比曲線中免疫112 天后的線段相對于基準曲線沒有明顯向下偏離的參比曲線，將參比曲線112 天后的Mn與基準曲線上對應(yīng)的Mn兩者進行統(tǒng)計學(xué)方差分析，若差異不顯著，即P＞0.05 的，可判定為該豬場的豬瘟疫苗免疫效果達標，進而即可確定該豬場使用的豬瘟疫苗合格；如果差異顯著，即P＜0.05 的，可判定為該豬場的豬瘟疫苗免疫效果不達標，進而即可確定不宜在豬場使用該豬瘟疫苗。

從圖3 中可以看出，參比曲線P1 處于基準曲線Q的右下側(cè)，且距離較遠，屬于重合度嚴重不好的類型，免疫112 天后呈現(xiàn)明顯向下偏離標準基線的形態(tài)。因此可以初步判定為該豬瘟病毒C 株活疫苗B 免疫效果（中和抗體效價） 與豬瘟病毒E2 蛋白滅活疫苗差異明顯。再做進一步統(tǒng)計學(xué)判定，活疫苗B 與E2 滅活疫苗A 免疫112 天后指標數(shù)據(jù)經(jīng)方差分析為T=2.9482，P＜0.05，差異顯著，可進一步斷定活疫苗B 與豬瘟病毒E2 蛋白滅活疫苗A 血清學(xué)免疫效果差異顯著。

按照本研究評價方法，可以對多種待銷售的和已經(jīng)上市的豬瘟疫苗的免疫效果做出準確的判定。

2 結(jié)果討論

⑴豬瘟綜合控制是一項復(fù)雜的工程，免疫預(yù)防是目前控制豬瘟的重要手段，在使用疫苗的同時，應(yīng)配合良好的檢測手段和科學(xué)的評價方法，以群體抗體水平來評價和優(yōu)化免疫程序才能保證豬瘟免疫效果。以凈化種公豬、種母豬和后備母豬為主，淘汰豬瘟病原陽性豬和抗體陰性豬，結(jié)合調(diào)整豬瘟免疫程序，加強隔離消毒、設(shè)施改善、環(huán)境治理等綜合性措施、協(xié)同控制其他疫病的綜合控制措施對我國比較實用[3]。

⑵豬瘟疫苗種類多，抗原含量差距較大，且C 株疫苗免疫后，可很快誘導(dǎo)細胞免疫，免疫早期雖然檢測不到中和抗體，但豬卻能抵抗強毒的攻擊，說明免疫早期細胞免疫的作用更加重要[4,5]。如果接種后晚些時間攻毒，豬群中和抗體水平與攻毒保護之間呈一定相關(guān)性[6,7]。因此規(guī)?；i場制定免疫程序最好以群體抗體檢測結(jié)果為依據(jù)。另外母豬群的免疫水平及均勻性直接關(guān)系到仔豬群的群體免疫效果，因此做好種豬群免疫，對穩(wěn)定仔豬免疫水平非常重要。

⑶以采樣日為橫坐標，豬瘟疫苗中和抗體效價-時間曲線下累加面積為縱坐標的豬瘟疫苗抗體效價-時間曲線下面積-時間圖，將生物制品免疫效價水平和效價持續(xù)時間相結(jié)合，組成了效價-時間復(fù)合指標，彌補了豬瘟疫苗單純抗原含量測定評價方法的不足，并將免疫效價高低評價一維體系推進到二維空間，因此提高了免疫評價結(jié)果的準確性。

⑷建立的指標曲線，即基準曲線和參比曲線清楚地表現(xiàn)了不同疫苗產(chǎn)品在免疫效果上的差異，為用戶選用豬瘟疫苗開展豬瘟免疫凈化提供了直觀的對比依據(jù)。

⑸對于使用同一批次豬瘟病毒E2 蛋白滅活疫苗免疫的不同豬場，基于本方案建立的指標曲線真實地反映了相應(yīng)豬場在這一指標上的差異，可用以評估各豬場生物安全管理水平及豬場豬群免疫系統(tǒng)功能受外界綜合免疫抑制因素如免疫抑制病、霉菌毒素等影響的程度。

⑹本方案是一種嚴格的中和抗體血清學(xué)評價方法，具有很高的準確性，通過豬場的豬瘟病毒E2 蛋白滅活疫苗免疫效果評價，在各豬場的生物安全管理水平及豬場豬群免疫系統(tǒng)功能一致的狀況下，可以判定某種豬瘟病毒E2 蛋白滅活疫苗產(chǎn)品的優(yōu)劣，從而為該種疫苗的選擇提供了準確且可靠的方法，進而可促進豬瘟凈化的實施和完成。同時可以為基于豬瘟病毒E2 蛋白滅活疫苗及其配套技術(shù)達到的豬瘟穩(wěn)定控制豬場是否達到豬瘟凈化標準的問題的自動化判斷奠定了必要的技術(shù)理論及物質(zhì)基礎(chǔ)，并降低豬瘟穩(wěn)定控制場發(fā)病的風(fēng)險，對國家提出豬瘟凈化目標的早日實現(xiàn)具有十分重要的現(xiàn)實意義。