上海地區(qū)健康豬群中副豬嗜血桿菌的分離鑒定

寧 昆 沈莉萍 徐 鋒

（上海市動物疫病預(yù)防控制中心， 上海 201103）

副豬嗜血桿菌病又稱豬革拉斯病，是由副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis, HPS） 引起豬的一種以高熱、呼吸道紊亂、關(guān)節(jié)腫脹、中樞神經(jīng)癥狀及高死亡率為特征的疾病。該病在臨床上以多發(fā)性關(guān)節(jié)炎和漿膜炎為主要病變特征，又稱多發(fā)性纖維素性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎。HPS 血清型眾多，可分為15 個(gè)血清型，命名為1～15 型，另有約20%分離株尚不能分型。HPS 屬于典型的“機(jī)會主義”病原，在機(jī)體遭受應(yīng)激或感染病毒性疾?。ㄈ绺咧虏⌒载i藍(lán)耳病、圓環(huán)病毒感染、豬瘟）導(dǎo)致免疫力下降時(shí)，可以侵入機(jī)體引起發(fā)病[1]。本菌可使2周齡到4 月齡的豬感染發(fā)病，尤其以5 周齡至8 周齡斷奶前后和保育階段的豬比較常見，發(fā)病率10%～15%，病死率可達(dá)50%[2]，給養(yǎng)豬業(yè)帶來重大經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重威脅著全世界養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。

本研究通過對上海地區(qū)健康豬群進(jìn)行監(jiān)測，以期了解副豬嗜血桿菌在健康豬群中的攜帶情況，為上海地區(qū)副豬嗜血桿菌病的防控提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

2018 年在上海2 個(gè)規(guī)?；i場采集豬唾液20 份、豬鼻拭子60 份。所采集的樣品經(jīng)保溫箱運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，當(dāng)天進(jìn)行檢測。

1.1.2 培養(yǎng)基和試劑

胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）、Columbia 血瓊脂基礎(chǔ)購自BD 公司，輔酶I（NAD）購自上海如吉生物科技發(fā)展有限公司；無菌脫纖維羊血購自杭州新銳生物工程有限公司；小牛血清購自Thermo 公司；Premix 購自TaKaRa 公司；引物由上海桑尼生物科技有限公司合成；質(zhì)譜樣品處理基質(zhì)液（VITEK MS-CHCA）購自生物梅里埃公司；微量生化鑒定管購自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.1.3 標(biāo)準(zhǔn)菌株

副豬嗜血桿菌HP80 由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所惠贈，金黃色葡萄球菌ATCC 25923、大腸埃希菌ATCC 8739 購自ATCC。

1.1.4 儀器

全自動快速微生物質(zhì)譜檢測系統(tǒng)（VITEK MS）購自生物梅里埃公司；PCR 儀（PTC-200）購自伯樂公司；恒溫箱購自Thermo 公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)

在生物安全柜中用接種環(huán)蘸取樣品，劃線接種于含5%小牛血清和0.1 g/mL 的TSA 平板上，于37℃培養(yǎng)48 h；挑取可疑菌落進(jìn)行革蘭氏染色；挑取可疑菌落，接種于含5%小牛血清和0.1 g/mL 的TSA 平板進(jìn)行純培養(yǎng)。

無菌挑取純培養(yǎng)后的菌落，平行劃線于無NAD 的綿羊血平板上，再挑取金黃色葡萄球菌垂直于水平線劃線接種，于37℃培養(yǎng)24～48 h，觀察菌落生長情況。

1.2.2 細(xì)菌的生化、PCR 和質(zhì)譜鑒定

挑取可疑菌落分別接種于葡萄糖、乳糖、半乳糖、甘露醇和木糖微量生化鑒定管中，鑒定管中每管按10 μg/mL 終濃度的NAD，于37℃培養(yǎng)24 h。同時(shí)，對可疑菌落進(jìn)行硝酸鹽還原試驗(yàn)、尿素酶試驗(yàn)和氧化酶試驗(yàn)。

挑取3～5 個(gè)可疑菌落于含100 μL 去離子水的離心管中，100℃水浴10 min，8 000 r/min 離心5 min，吸取上清作為模板。使用筆者團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)的副豬嗜血桿菌16s rRNA 引物（見表1）進(jìn)行擴(kuò)增。副豬嗜血桿菌反應(yīng)體系如下：premix 12.5 μL，DEPC 水8.5 μL，上下游引物各1 μL，模板2 μL；反應(yīng)條件為：95℃2 min；94℃30 s，58℃1 min，72℃1.5 min，擴(kuò)增33 個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。

于鑒定前一天接種副豬嗜血桿菌HP80 和質(zhì)控株ATCC 8739，使用全自動快速微生物質(zhì)譜檢測系統(tǒng)（VITEK MS） 按照操作步驟對HP80、ATCC8739 和可疑菌落進(jìn)行鑒定，讀取鑒定結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 分離培養(yǎng)

經(jīng)48 h 培養(yǎng)，TSA 平板上生長出的可疑菌落直徑約1～2 mm，不溶血、半透明、圓形隆起、邊緣整齊、光滑濕潤。經(jīng)革蘭氏染色，可疑菌落呈革蘭氏陰性短桿狀，大小約0.5 μm×（1.5～2.0） μm。將可疑菌落純培養(yǎng)，24 h 后出現(xiàn)上述菌落形態(tài)。

可疑菌落和金黃色葡萄球菌一起培養(yǎng)后出現(xiàn)“衛(wèi)星生長現(xiàn)象”，即在金黃色葡萄球菌旁邊的可疑菌落較大，遠(yuǎn)離金黃色葡萄球菌的可疑菌落較小。

2.2 鑒定

可疑菌落的生化試驗(yàn)結(jié)果見表2，可以看到，所分離的細(xì)菌發(fā)酵葡萄糖、半乳糖，不發(fā)酵乳糖、甘露醇和木糖。觸酶試驗(yàn)陰性，硝酸鹽還原試驗(yàn)陽性，尿素酶試驗(yàn)陰性，氧化酶試驗(yàn)陰性。

表2 細(xì)菌的生化反應(yīng)結(jié)果

PCR 檢測結(jié)果見圖1，可疑菌落出現(xiàn)275 bp 的目的條帶，20 份豬唾液中檢測出1 份陽性，60 份豬鼻拭子中檢測出5 份陽性。

使用VITEK MS 對可疑菌落進(jìn)行蛋白質(zhì)譜鑒定，見圖2，結(jié)果與數(shù)據(jù)庫中的副豬嗜血桿菌同源性達(dá)到75%以上。綜合上述分離鑒定結(jié)果，判定為副豬嗜血桿菌。

圖1 副豬嗜血桿菌的PCR 鑒定結(jié)果

圖2 副豬嗜血桿菌的質(zhì)譜鑒定圖

3 討論

副豬嗜血桿菌病相對于其他疾病較難防控的原因有：一是目前該菌已確定的血清型有15 種，各血清型之間的交叉保護(hù)力較弱或者沒有。有研究表明，已經(jīng)接種過滅活菌苗的豬群也會因缺乏交叉保護(hù)而致免疫失敗。二是該菌屬于機(jī)會性致病菌，在豬群整體狀態(tài)較好時(shí)不發(fā)病，容易被豬場管理者忽視，但是在豬群存在豬藍(lán)耳病或圓環(huán)病毒病時(shí)，HPS 易繼發(fā)感染，該菌的分離率會增加[3]；或者在豬群遇到氣溫驟降、運(yùn)輸?shù)葢?yīng)激條件下，也會增加感染的風(fēng)險(xiǎn)[4]。因此，防治本病的前提是做好飼養(yǎng)管理，提高豬群免疫力，采取疫苗加抗生素相結(jié)合的綜合防控措施。具體來講，需要做到如下幾點(diǎn)。

一是加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，改善飼養(yǎng)條件。保育階段是豬發(fā)生副豬嗜血桿菌病的高發(fā)年齡段，在仔豬斷奶后到保育舍時(shí)，由于保育舍溫度較低，仔豬受到寒冷應(yīng)激之后抵抗力下降，此時(shí)容易感染副豬嗜血桿菌這類條件致病菌。所以在轉(zhuǎn)舍時(shí)，將保育舍的溫度提高到同產(chǎn)房的溫度，而后每天緩慢降低。

二是做好免疫抑制性疾病的預(yù)防。副豬嗜血桿菌常繼發(fā)于圓環(huán)病毒病、藍(lán)耳病和支原體肺炎等免疫抑制性疾病，所以對于本病的預(yù)防應(yīng)該從這幾種病入手，做到及時(shí)免疫。

三是合理使用藥物。副豬嗜血桿菌對恩諾沙星、頭孢噻呋等比較敏感。對于本病的治療應(yīng)該盡早，如果在發(fā)病后期則治愈率較低。同時(shí)，在治療時(shí)一定要找到病因，找到原發(fā)病，然后配合該菌的敏感藥物就可以較好地治愈本病。