三磷酸腺苷對(duì)后肢制動(dòng)大鼠比目魚(yú)肌離體單一肌梭電生理活動(dòng)的影響

余 蕾，趙雪紅，樊小力，李雪萍

(1.西安醫(yī)學(xué)院，西安710021；2.湖北文理學(xué)院 醫(yī)學(xué)院機(jī)能學(xué)部，襄陽(yáng) 441053；3.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部，西安 710016)

制動(dòng)、失重等條件下骨骼肌發(fā)生萎縮，這種由于運(yùn)動(dòng)減少、缺乏鍛煉所致的肌肉萎縮稱(chēng)為廢用性肌萎縮。中長(zhǎng)期的航天飛行過(guò)程中宇航員會(huì)出現(xiàn)肌肉萎縮尤其是下肢抗重力肌的萎縮，這極大地限制了宇航員在太空中的作業(yè)，待其返回地面后，萎縮的肌肉無(wú)法立即恢復(fù)正常，并且容易出現(xiàn)站立不穩(wěn)、平衡失調(diào)等情況，嚴(yán)重影響宇航員的生活[1-2]。對(duì)于骨折患者的制動(dòng)治療雖然可保護(hù)受損組織利于骨折的愈合，但限制了周?chē)】店P(guān)節(jié)、肌肉的運(yùn)動(dòng)，可導(dǎo)致明顯的肌肉萎縮。廢用條件下肌緊張減弱，大鼠出現(xiàn)肌肉萎縮，其中肌梭的萎縮比梭外肌出現(xiàn)的要早，其萎縮程度也較梭外肌更為嚴(yán)重，這提示肌梭在廢用性肌萎縮的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著舉足輕重的作用[3-5]。研究發(fā)現(xiàn)，蟾蜍離體單一肌梭在肌苷的作用下，其自發(fā)放電可明顯增多[6]。到目前為止，以大鼠單一肌梭作為研究對(duì)象，觀察在廢用性肌萎縮發(fā)生過(guò)程中藥物對(duì)肌梭放電的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)建立后肢制動(dòng)模型導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)廢用性肌萎縮，而后記錄大鼠比目魚(yú)肌離體單一肌梭的電生理活動(dòng)，并分別觀察不同劑量的三磷酸腺苷(1、2和3 mg/kg)對(duì)肌梭電生理活動(dòng)的影響，為廢用性肌萎縮的預(yù)防與治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與藥品

實(shí)驗(yàn)選取雄性SD大鼠作為研究對(duì)象(購(gòu)自西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，體重200～220 g。按體重配對(duì)原則隨機(jī)將大鼠分為5組，即正常對(duì)照組(CON)、后肢制動(dòng)組、后肢制動(dòng)+1 mg/kg三磷酸腺苷鈉組(Na2ATP 1)、后肢制動(dòng)+2 mg/kg三磷酸腺苷鈉組(Na2ATP 2)、后肢制動(dòng)+3 mg/kg三磷酸腺苷鈉組(Na2ATP 3)，每組5只。氯化琥珀膽堿注射液(1 g/2 mL)，購(gòu)自上海旭東海普藥業(yè)有限公司。Na2ATP注射液(10 mg/1 mL)，購(gòu)自遼寧可濟(jì)藥業(yè)有限公司。

1.2 大鼠后肢制動(dòng)模型建立

實(shí)驗(yàn)采用改良Booth等的方法[7]建立大鼠后肢制動(dòng)模型。大鼠經(jīng)0.4 g/kg水和氯醛腹腔注射麻醉后清潔其左后肢，在左后肢上包裹一層輕薄的棉花，尤其注意關(guān)節(jié)及血管等處防止這些部位受到石膏壓迫，而后將石膏繃帶置于棉花上纏繞包裹左后肢，繃帶松緊適宜，由踝關(guān)節(jié)起向上經(jīng)膝關(guān)節(jié)纏繞至腹股溝處，注意固定過(guò)程中膝關(guān)節(jié)處于伸展?fàn)顟B(tài)，踝關(guān)節(jié)處于背伸狀態(tài)，最終使左后肢固定于靜息位一周。石膏外側(cè)包繞銅網(wǎng)，防止動(dòng)物撕咬。室溫維持在25℃左右，將大鼠置于鼠籠內(nèi)喂養(yǎng)，一鼠一籠，保證大鼠正常飲水進(jìn)食以及活動(dòng)。

1.3 大鼠比目魚(yú)肌單一肌梭標(biāo)本的制備

腹腔注射戊巴比妥鈉(45 mg/kg)麻醉大鼠，取后肢比目魚(yú)肌置于改良任氏液(CaCl2濃度為 1.8 mol/L)中，水浴37℃，持續(xù)通氧。肌梭與梭外肌并聯(lián)，外觀呈梭形，以此作為標(biāo)志，在雙目解剖顯微鏡和倒置顯微鏡下尋找肌梭。沿肌纖維走形方向，使用分離針小心剝離肌梭周?chē)慕Y(jié)締組織和梭外肌。分離過(guò)程注意保護(hù)肌梭梭囊的完整，并保留至少3 mm的傳入神經(jīng)纖維。為保證肌梭活性，整個(gè)分離過(guò)程不超過(guò)10 min，超時(shí)仍未分離出肌梭則需更換新的比目魚(yú)肌及改良任氏液重新分離。

1.4 單一肌梭電活動(dòng)記錄

實(shí)驗(yàn)采用空氣隔絕法[8]記錄單一肌梭傳入放電。將制備好的肌梭標(biāo)本放入屏蔽箱內(nèi)通氧平衡10 min，CON組及后肢制動(dòng)組記錄肌梭自發(fā)傳入放電；而后給予50 mg/L Sch灌流，記錄肌梭誘發(fā)放電情況。后肢制動(dòng)+Na2ATP 1、后肢制動(dòng)+Na2ATP 2、后肢制動(dòng)+Na2ATP 3給予相應(yīng)濃度的Na2ATP灌流，記錄肌梭自發(fā)傳入放電；而后給予50 mg/L Sch灌流，記錄肌梭誘發(fā)放電情況。

1.5 數(shù)據(jù)采集與統(tǒng)計(jì)分析

表1 后肢制動(dòng)一周對(duì)大鼠比目魚(yú)肌離體單一肌梭放電變化Table 1 The influence of hindlimb immobilization for one week on the discharges of isolated soleus muscle spindle in rats

*：P<0.05,compared with CON;△：P<0.05,compared with the electrical activity of muscle spindle before administration of Sch

2 結(jié)果

2.1 后肢制動(dòng)一周大鼠比目魚(yú)肌單一肌梭放電變化

實(shí)驗(yàn)記錄了正常對(duì)照組及后肢制動(dòng)組各12例肌梭自發(fā)及誘發(fā)放電情況，結(jié)果顯示后肢制動(dòng)一周后大鼠比目魚(yú)肌離體單一肌梭傳入放電形式與正常對(duì)照組一致，均為簇狀放電，簇狀放電之間間隔一定的周期。然而后肢制動(dòng)組放電頻率較正常對(duì)照組明顯減少(P<0.05)，放電周期間隔延長(zhǎng)明顯(P<0.05)，給予50 mg/L Sch后誘發(fā)放電未見(jiàn)明顯增多。

2.2 三磷酸腺苷對(duì)后肢制動(dòng)大鼠比目魚(yú)肌單一肌梭放電的影響

實(shí)驗(yàn)觀察并記錄了分別給予Na2ATP 1、2和3 mg/kg后，后肢制動(dòng)大鼠比目魚(yú)肌單一肌梭放電的變化，每組記錄12例肌梭放電。

2.2.1 自發(fā)放電變化

平均頻率：給予1 mg/kg Na2ATP灌流后肌梭傳入放電平均頻率為(0.08±0.01)Hz，較給藥前制動(dòng)大鼠平均頻率(0.07±0.01)Hz未見(jiàn)明顯變化；給予2 mg/kg Na2ATP灌流后肌梭傳入放電平均頻率由(0.08±0.01)Hz增至(0.14±0.01)Hz(P<0.05)；給予3 mg/kg Na2ATP灌流后肌梭傳入放電平均頻率由(0.07±0.01)Hz增至(0.15±0.01)Hz(P<0.05)。

峰值頻率：給予1 mg/kg Na2ATP灌流后肌梭傳入放電峰值頻率為(6.30±1.85)Hz，較給藥前制動(dòng)大鼠峰值頻率(5.62±1.03)Hz未見(jiàn)明顯變化；給予2 mg/kg Na2ATP灌流后肌梭傳入放電峰值頻率由(4.80±0.87)Hz增至(8.53±1.22)Hz(P<0.05)；給予3 mg/kg Na2ATP灌流后肌梭傳入放電峰值頻率由(5.61±0.79)Hz增至(9.94±1.05)Hz(P<0.05)。

周期間隔：給予1 mg/kg Na2ATP灌流后肌梭傳入放電周期間隔為(4.08±1.03)min，較給藥前制動(dòng)大鼠自發(fā)放電周期間隔(4.79±0.89)min未見(jiàn)明顯改變；給予2 mg/kg Na2ATP灌流后肌梭自發(fā)放電周期間隔由(4.66±0.72)min縮短至(4.08±1.03)min；給予3 mg/kg Na2ATP灌流后肌梭傳入放電自發(fā)放電周期間隔由(4.71±0.83)min縮短至(2.96±0.94)min(P<0.05)。

2.2.2 誘發(fā)放電變化

各組給予50 mg/L Sch灌流觀察其誘發(fā)放電情況，結(jié)果顯示，Na2ATP 1組中僅2例肌梭放電增加，誘發(fā)陽(yáng)性率為16.7%。誘發(fā)放電的平均頻率為(0.08±0.01)Hz，峰值頻率為(7.80±2.57)Hz，自發(fā)放電的周期間隔為(4.15±1.21)min；Na2ATP 2組中僅3例肌梭放電增加，誘發(fā)陽(yáng)性率為25%。誘發(fā)放電的平均頻率為(0.16±0.01)Hz，峰值頻率為(10.37±1.89)Hz，自發(fā)放電的周期間隔為(3.74±0.94)min；Na2ATP 3組中6例肌梭放電增加，誘發(fā)陽(yáng)性率為50%。誘發(fā)放電的平均頻率為(0.24±0.01)Hz(P<0.05)，峰值頻率為(15.18±1.64)Hz(P<0.05)，自發(fā)放電的周期間隔為(2.81±0.75)min。

A：平均頻率；B：峰值頻率；C：放電周期間隔。*：P<0.05,compared with hindlimb immobilization；Δ：P<0.05,compared with before the administration of Sch

圖1 Na2ATP對(duì)后肢制動(dòng)大鼠單一比目魚(yú)肌肌梭傳入放電的影響
Figure 1 Effects of Na2ATP on the afferent discharges of hindlimb immobilization rat′s soleus muscles′ single spindles

3 討論

肌梭是骨骼肌內(nèi)的本體感受器，它與梭外肌平行排列，位于初長(zhǎng)度時(shí)肌梭可產(chǎn)生自發(fā)的傳入放電。在重力的作用下，肌梭自發(fā)傳入放電不斷傳向中樞，從而產(chǎn)生了肌緊張，使地球上的人和動(dòng)物維持站立的狀態(tài)。失重和制動(dòng)均可使骨骼肌活動(dòng)減少，最終導(dǎo)致廢用性肌萎縮的發(fā)生。既往研究發(fā)現(xiàn)模擬失重情況下在體肌梭傳入放電明顯減少[3]，肌緊張減弱，梭內(nèi)內(nèi)肌與梭外肌均萎縮，且肌梭發(fā)生萎縮的時(shí)間早于梭外肌。然而在體條件下，肌梭與梭外肌纖維并聯(lián)，梭外肌收縮導(dǎo)致肌梭縮短，傳入放電減少；且梭內(nèi)肌纖維受來(lái)自脊髓前角的γ-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元支配，而γ-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元?jiǎng)t受到高位中樞功能狀態(tài)的調(diào)控[9]，為排除上述影響因素，本實(shí)驗(yàn)采用空氣隔絕法記錄離體單一肌梭放電，單純觀察后肢制動(dòng)對(duì)肌梭傳入放電的影響并尋找相應(yīng)的有效對(duì)抗措施。

本實(shí)驗(yàn)建立了大鼠后肢制動(dòng)模型，發(fā)現(xiàn)后肢制動(dòng)一周大鼠比目魚(yú)肌離體單一肌梭自發(fā)放電頻率較正常明顯減少，肌梭簇狀放電的周期間隔延長(zhǎng)，且對(duì)興奮肌梭的藥物Sch無(wú)明顯反應(yīng)，這與趙雪紅等人[10]對(duì)模擬失重情況下在體肌梭放電減少的研究結(jié)果一致。分別給予1、2和3 mg/kg 3種濃度的Na2ATP灌流后肢制動(dòng)7 d的大鼠比目魚(yú)肌的離體單一肌梭，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，一定濃度的三磷酸腺苷可興奮肌梭，使其自發(fā)放電明顯增加，然而僅較高濃度的三磷酸腺苷可使誘發(fā)放電明顯增加。

三磷酸腺苷興奮肌梭可能與以下因素有關(guān)：1)研究表明模擬失重僅3 d，梭內(nèi)、外肌細(xì)胞即出現(xiàn)了胞漿游離Ca2+濃度增多的現(xiàn)象；模擬失重14 d，梭內(nèi)、外肌細(xì)胞胞漿出現(xiàn)鈣超載現(xiàn)象，并可見(jiàn)到梭內(nèi)肌纖維中鈣結(jié)合蛋白D28K的表達(dá)明顯減少，D28K與胞漿游離Ca2+的結(jié)合減弱，胞漿游離Ca2+增多[11]。廢用性肌萎縮發(fā)生時(shí)細(xì)胞可出現(xiàn)鈣超載，三磷酸腺苷作為能量補(bǔ)充劑，一方面經(jīng)ATP酶水解后可促使肌絲滑行，梭內(nèi)肌纖維收縮，肌梭傳入沖動(dòng)增多；另一方面可加快肌漿網(wǎng)對(duì)Ca2+的攝取，提高梭內(nèi)肌纖維的舒張速度。2)在三磷酸腺苷的作用下，神經(jīng)肌肉接頭處突觸前膜內(nèi)的遞質(zhì)乙酰膽堿釋放增多，乙酰膽堿擴(kuò)散至終板膜與其受體結(jié)合，可提高終板膜對(duì)Ca2+的通透性，觸發(fā)Ca2+內(nèi)流[12]。Ca2+內(nèi)流一方面可觸發(fā)核袋纖維收縮，肌梭傳入放電增多；另一方面可降低梭內(nèi)肌細(xì)胞膜電位水平，產(chǎn)生感受器電位[13]，提高梭內(nèi)肌纖維的興奮性，從而使肌梭傳入放電增多。3)另有研究表明，當(dāng)被稱(chēng)為腫瘤抑制器的叉頭轉(zhuǎn)錄因子FoxO3a活化時(shí)，MAFbx 表達(dá)上調(diào)，從而引起肌萎縮。外源性ATP可促使FoxO3a磷酸化，MAFbx表達(dá)下調(diào)，起到緩解肌萎縮的作用[14-15]。

制動(dòng)情況下肌肉發(fā)生萎縮，肌梭自發(fā)放電減少，傳向中樞的神經(jīng)沖動(dòng)減少，肌緊張減弱，最終導(dǎo)致或加重了肌肉萎縮[16-17]。到目前為止尚未發(fā)現(xiàn)對(duì)抗廢用性肌萎縮的較好的方法，本實(shí)驗(yàn)采用空氣隔絕法測(cè)單一肌梭放電，結(jié)果顯示后肢制動(dòng)一周單一肌梭傳入放電明顯減少，給予一定濃度的三磷酸腺苷可對(duì)抗肌梭傳入放電減少的情況，其對(duì)抗肌萎縮的機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果為大鼠肌梭生理的研究與廢用性肌萎縮的實(shí)驗(yàn)研究中提供了有意義的資料，為制動(dòng)所致肌萎縮的防治提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。