中國(guó)部分地區(qū)黑胸大蠊遺傳多樣性與系統(tǒng)發(fā)育地理結(jié)構(gòu)研究

徐永媛，李 蓉，陳艷艷，陳善元，肖 蘅

(云南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,昆明 650091)

黑胸大蠊(Periplanetafuliginosa)隸屬于節(jié)肢動(dòng)物門(Arthropoda)，昆蟲綱(Insecta)，蜚蠊目(Blattodea)，蜚蠊科(Blattidae)，大蠊屬(Periplaneta)[1]，為雜食性昆蟲，以動(dòng)、植物食料為食，其主要生活于廚房、衛(wèi)生間及垃圾桶周圍。黑胸大蠊具有較強(qiáng)的適應(yīng)性及行動(dòng)能力，常會(huì)攜帶多種病原體[2-5]，是人類疾病病菌的潛在攜帶者。研究表明，黑胸大蠊中有52種細(xì)菌寄生，可通過機(jī)械性傳播病原體或取食時(shí)污染食品傳播和導(dǎo)致多種疾病[6-7]。

近年來(lái)隨著分子生物學(xué)的發(fā)展和應(yīng)用，分子標(biāo)記被廣泛運(yùn)用于昆蟲的遺傳研究。在眾多的分子標(biāo)記技術(shù)中，由于線粒體DNA(mtDNA)具有分子結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、無(wú)重組、進(jìn)化速率快、多拷貝及嚴(yán)格的母系遺傳等特點(diǎn)[8-10]，被廣泛用于昆蟲的系統(tǒng)進(jìn)化及系統(tǒng)地理學(xué)的研究。其中線粒體細(xì)胞色素氧化酶亞基I(Cytochrome coxidase subunit I，COI)基因運(yùn)用較為廣泛。例如，楊小強(qiáng)[11]通過對(duì)中國(guó)東南地區(qū)14個(gè)地理種群的116頭馬六甲肉食螨(Cheyletusmalaccensis)的COI基因序列片段進(jìn)行了系統(tǒng)地理結(jié)構(gòu)的研究，發(fā)現(xiàn)馬六甲肉食螨種群存在來(lái)自種群內(nèi)部的遺傳分化，但遺傳距離與地理距離無(wú)明顯的相關(guān)性，即無(wú)明顯的系統(tǒng)地理結(jié)構(gòu)。任秋平[12]運(yùn)用COI基因與AL31、AL51、AL65核基因位點(diǎn)對(duì)中國(guó)南部11個(gè)不同地理種群的106個(gè)雙紋小蠊(Blattellabisignata)的種群結(jié)構(gòu)研究表明，地理、氣候等因素可能影響雙紋小蠊的種群結(jié)構(gòu)。王紅等[13]基于COI基因序列對(duì)中國(guó)東北大豆食心蟲(Leguminivoraglycinivorella)種群間的遺傳多樣性、基因流和分子變異進(jìn)行分析顯示，各種群間的遺傳距離與地理距離之間無(wú)顯著相關(guān)性，且種群間的基因交流未受地理距離的影響。

目前對(duì)黑胸大蠊的生物學(xué)特性、形態(tài)學(xué)、藥用價(jià)值等方面進(jìn)行了深入的研究[14-17]。對(duì)于其系統(tǒng)發(fā)育和系統(tǒng)地理學(xué)的研究也有相關(guān)報(bào)道。例如，陳壯志等[18]基于COI與細(xì)胞色素b (Cytb)基因片段對(duì)黑胸大蠊等6種蜚蠊物種進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，兩基因聯(lián)合能將蜚蠊物種區(qū)分開，并且黑胸大蠊和美洲大蠊(Periplanetaamericana)的親緣關(guān)系較近。陳壯志等[19]基于COI基因片段的保守性對(duì)蜚蠊科6種昆蟲研究發(fā)現(xiàn)，COI基因適合用于蜚蠊物種的分類鑒定與系統(tǒng)進(jìn)化分析。Cho等[20]對(duì)蜚蠊目的黑胸大蠊、美洲大蠊、日本大蠊(Periplanetajaponica)、德國(guó)小蠊(Blattelagermanica)物種的COI基因序列構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，黑胸大蠊和美洲大蠊互為姐妹群，說(shuō)明同美洲大蠊、日本大蠊、德國(guó)小蠊3種蜚蠊物種相比，黑胸大蠊與美洲大蠊的親緣關(guān)系較近。但目前未見利用線粒體COI基因片段作為分子標(biāo)記對(duì)黑胸大蠊的遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育地理結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究。因此，本研究首次利用線粒體COI基因，對(duì)采自中國(guó)浙江、湖南、貴州和云南4個(gè)省份9個(gè)地區(qū)共計(jì)88個(gè)黑胸大蠊樣本的序列，進(jìn)行遺傳多樣性、遺傳分化、系統(tǒng)發(fā)育地理結(jié)構(gòu)等分析，為探討中國(guó)部分地區(qū)黑胸大蠊的遺傳多樣性與系統(tǒng)發(fā)育地理結(jié)構(gòu)及黑胸大蠊的有效防治策略提供分子生物學(xué)的理論基礎(chǔ)。

表1 黑胸大蠊樣本信息與多樣性指數(shù)Table 1 Sample information and diversity index of Periplaneta fuliginosa used in this study

Code:種群代碼Population code;N:樣本數(shù)Number of samples;H:單倍型數(shù)Number of haplotypes;Hd:單倍型多樣度Haplotype diversity;Pi:核苷酸多樣Nucleotide diversity;Lng(E):經(jīng)度Longitude;Lat(N):緯度Latitude

1 材料與方法

1.1 材料

本研究的材料為2015年7月—2016年3月采自浙江省寧波市、湖南省長(zhǎng)沙市、貴州省畢節(jié)市、云南省昆明市等4省7市共9個(gè)地理種群的88個(gè)黑胸大蠊樣本(表1)。采樣時(shí)為保證樣本的完整性，采用藥物進(jìn)行捕獲，將捕獲到的黑胸大蠊標(biāo)本分別儲(chǔ)藏于無(wú)水乙醇的標(biāo)本管中，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 總DNA提取

取約30 mg黑胸大蠊的腹胸部肌肉組織并剪碎，用雙蒸水將其處理為細(xì)胞懸液，參照血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取方法提取總DNA。但在方法上做了一定的改進(jìn)，如根據(jù)樣品量的多少適量增減蛋白酶K的量和適當(dāng)延長(zhǎng)消化時(shí)間，使樣品充分溶解；采用緩沖液TE洗脫時(shí)，洗脫2～3次，以提高DNA原液的濃度等。將提取的DNA原液存于-80℃冰箱備用。

1.2.2 PCR擴(kuò)增與序列測(cè)定

PCR擴(kuò)增使用COI基因通用引物：LCO1490 5′-GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G-3′和HCO2198 5′-TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA-3′[21]。PCR總反應(yīng)體系為35 μL：ddH2O 21.65 μL，TaKaRa ExTaq(Mg2+free Buffer)Buffer 1.5 μL、25 mmol/L MgCl23.5 μL、25 mmol/L DNTP mixture 2.8 μL、10 μmol/L正反引物各0.7 μL、5 U/μL TaKaRa ExTaq酶0.15 μL，模板DNA 4 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性1 min，40℃～44℃退火1 min，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸5 min。每次PCR擴(kuò)增均設(shè)置空白作為陰性對(duì)照。對(duì)擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物在1.2%的瓊脂糖凝膠(含1%核酸染料)中進(jìn)行檢測(cè)后，將擴(kuò)增條帶單一的PCR產(chǎn)物送往昆明碩擎生物技術(shù)有限公司，使用ABI3730測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

利用DNASTAR軟件包中的SeqMan和EditSeq程序?qū)π蛄羞M(jìn)行拼接和校對(duì)，手動(dòng)刪除序列兩端的引物區(qū)，獲得長(zhǎng)度相同的有效序列片段。利用MEGA 6.06軟件對(duì)有效序列片段進(jìn)行排序，構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹，樹上各分支的支持率由Bootstrap重復(fù)1000次所得。利用DnaSP v5軟件計(jì)算遺傳多樣性指數(shù)、Tajima′sD中性檢測(cè)值、遺傳分化系數(shù)(Gst)、基因流(Nm)。利用POPART[22]軟件構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)圖。采用Arlequin3.5軟件進(jìn)行AMOVA分子變異分析。利用IBDWSv3.23軟件對(duì)遺傳距離與地理距離之間的Mantel相關(guān)性進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 COI基因序列特征與單倍型分析

通過PCR擴(kuò)增和序列測(cè)定共獲得黑胸大蠊9個(gè)地理種群88個(gè)個(gè)體的線粒體COI基因序列，其長(zhǎng)度均為658bp，且未發(fā)現(xiàn)堿基的插入或缺失。堿基A、T、C、G的平均含量為32.1%、35.3%、16.7%和15.9%，A+T堿基含量(67.4%)明顯高于G+C含量(32.6%)。所有COI基因序列中共檢測(cè)到11個(gè)變異位點(diǎn)，9個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)，7個(gè)單倍型(Hap1-Hap7，GenBank登錄號(hào)：MG021442～MG021449)。單倍型Hap3為9個(gè)地理種群所共享，包含72個(gè)個(gè)體；單倍型Hap6由來(lái)自云南省曲靖市陸良縣的1個(gè)個(gè)體，昆明市五華區(qū)的1個(gè)個(gè)體、西山區(qū)的3個(gè)個(gè)體，安寧市的1個(gè)個(gè)體所共享；單倍型Hap1、Hap2和Hap4由來(lái)自昭通市綏江縣的3個(gè)、3個(gè)和2個(gè)個(gè)體所共享；單倍型Hap5僅由來(lái)自云南省昆明市五華區(qū)的1個(gè)個(gè)體所共享；來(lái)自云南省昆明市盤龍區(qū)的1個(gè)個(gè)體形成了單倍型Hap7。除浙江省寧波市、湖南省長(zhǎng)沙市和貴州省畢節(jié)市的3個(gè)地理種群只包含Hap3一個(gè)單倍型外，其余6個(gè)地理種群均包含2～4個(gè)單倍型。

2.2 遺傳多樣性、遺傳分化與基因流分析

利用DnaSPv5軟件計(jì)算相關(guān)指數(shù)，其結(jié)果顯示：9個(gè)地理種群的單倍型多樣度為0.327，核苷酸多樣度為0.0017，Tajima′sD中性檢驗(yàn)值為-1.2743(P>0.05)，遺傳分化系數(shù)(Gst)為0.1060，基因流(Nm)為4.22。而不同地理種群的單倍型多樣度(Hd)為0.000～0.667，平均值為0.313；核苷酸多樣度(Pi)為0.0000～0.0050，平均值為0.0011(表1)。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育地理結(jié)構(gòu)分析

選取美洲大蠊(Periplanetaamericana)的COI基因序列(GenBank登錄號(hào)：JQ350707、KM576931、GU947663)為外群，同本研究黑胸大蠊7個(gè)單倍型序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)。結(jié)果顯示，黑胸大蠊各單倍型序列都明顯與外群分開。7個(gè)單倍型形成了兩個(gè)較為明顯的分支，其中單倍型Hap3-Hap7的序列聚為分枝I，支持率為66%，單倍型Hap1與Hap2聚為分枝II，支持率為94%。分枝I和分枝II互為姐妹群聚為單系枝，其支持率為100%。此外，發(fā)現(xiàn)距離較遠(yuǎn)的地理種群ZJNB的單倍型Hap3與地理種群KMAN的單倍型Hap6聚為一枝；距離較近的地理種群KMWH、KMPL的單倍型Hap6、Hap7聚為一枝，并未反映出與地理位置相關(guān)的信息。

為了進(jìn)一步了解單倍型之間的關(guān)系，利用POPART軟件采用中間結(jié)合法(Median-joining)構(gòu)建了黑胸大蠊的單倍型網(wǎng)絡(luò)圖(圖2)，結(jié)果顯示，單倍型Hap1和Hap2關(guān)系較為緊密，但與其他單倍型有明顯分支，而單倍型Hap3為72個(gè)個(gè)體9個(gè)地理種群的共享單倍型。各個(gè)黑胸大蠊地理種群的所有單倍型并沒有單獨(dú)聚在一起，而是被來(lái)自其它地理種群的單倍型相互隔開。

圖1 基于COI基因序列構(gòu)建的黑胸大蠊不同地理種群的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 1 Phylogenetic tree of different geographic populations of Periplaneta fuliginosa with COI sequences using NJ method

圖2 基于COI基因構(gòu)建的黑胸大蠊的單倍型網(wǎng)絡(luò)圖Figure 2 The haplotype network of Periplaneta fuliginosa based on COI gene sequences

AMOVA分子變異分析顯示，9個(gè)地理種群間的方差組分為0.120 72，占方差比率的20.55%；種群內(nèi)的方差組分為0.466 66，占方差比率的79.45%。種群內(nèi)的方差比率明顯高于種群間的方差比率。

不同地理種群間的遺傳距離與地理距離的自然對(duì)數(shù)值分別為0.0000～0.0040，1.4669～7.5809(表2)。Mantel相關(guān)性分析(圖3)顯示，遺傳距離與地理距離兩個(gè)矩陣的相關(guān)系數(shù)R為0.0038，P=0.5670，說(shuō)明遺傳距離與地理距離間無(wú)顯著相關(guān)性。以上結(jié)果一致顯示黑胸大蠊種群間沒有顯著的系統(tǒng)發(fā)育地理結(jié)構(gòu)。

表2 黑胸大蠊種群間的遺傳距離(下三角)與地理距離的自然對(duì)數(shù)值(上三角)Table 2 The pairwise genetic distance (below the diagonal) and the natural logarithm of geographical distance (above the diagonal) among Periplaneta fuliginosa populations

圖3黑胸大蠊種群間的遺傳距離與地理距離的Mantel相關(guān)性
Figure 3 Mantel test between genetic distance and geographic distance amongPeriplanetafuliginosapopulations

3 討論

線粒體DNA因具有拷貝數(shù)量大、獨(dú)立于細(xì)胞核DNA等特點(diǎn)，被廣泛用于物種的分子鑒定與系統(tǒng)發(fā)育的研究[20,23]，除此之外，還被廣泛用于地理種群遺傳多樣性研究[21]。線粒體COI基因序列的堿基組成具有明顯的偏好性。本研究中，黑胸大蠊COI基因的堿基A+T含量(67.4%)明顯大于G+C含量(32.6%)，符合昆蟲線粒體COI基因的序列特征[18,24]。黑胸大蠊7個(gè)單倍型中單倍型Hap3和Hap6為共享單倍型，說(shuō)明這兩個(gè)單倍型可能是黑胸大蠊群體中相對(duì)原始、穩(wěn)定且能夠適應(yīng)環(huán)境變化選擇的單倍型。而其余單倍型為各地理種群的獨(dú)享單倍型，說(shuō)明各地理種群具有一定程度上的遺傳分化和存在一定的基因交流。

物種進(jìn)化潛力、生活習(xí)性、對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力及歷史因素等對(duì)物種遺傳多樣性都具有一定的影響[25-26]。本研究中，黑胸大蠊的單倍型多樣度(0.327)與核苷酸多樣度(0.0017)同任秋平等[12]基于COI基因?qū)?1個(gè)雙紋小蠊種群的遺傳多樣性(Hd=0.966，Pi=0.0299)進(jìn)行比較，顯示了黑胸大蠊種群相對(duì)較低的遺傳多樣性，說(shuō)明黑胸大蠊對(duì)不同的生存環(huán)境的適應(yīng)能力相對(duì)較弱。這一結(jié)論與魏中華等[27]認(rèn)為黑胸大蠊生存及適應(yīng)環(huán)境能力較強(qiáng)的結(jié)論相矛盾，這可能與黑胸大蠊的某些生物學(xué)特性有關(guān)。據(jù)相關(guān)研究顯示黑胸大蠊在每年3—5月份及6—8月份生殖產(chǎn)卵及卵胚發(fā)育較好，生長(zhǎng)較為迅速[15-16]。而本研究中，黑胸大蠊的采樣時(shí)間為2015年7月—2016年3月，處于黑胸大蠊繁殖、生長(zhǎng)發(fā)育程度相對(duì)低的時(shí)期，且就室內(nèi)生長(zhǎng)的黑胸大蠊而言，其食物和食性較為相似。本研究中的樣本雖分屬于9個(gè)地理種群，但均為室內(nèi)采樣，較少有野外樣品。因此，雖為隨機(jī)采樣且采樣點(diǎn)各不相同，因其生存環(huán)境較為相似，所以黑胸大蠊遺傳多樣性較低。這一結(jié)論與李春選等[28]認(rèn)為昆蟲遺傳多樣性在不同生態(tài)環(huán)境下具有一定的差別相符。黑胸大蠊總種群的中性檢驗(yàn)Tajima′sD檢驗(yàn)不顯著，表明黑胸大蠊在較近的歷史時(shí)期未經(jīng)歷種群擴(kuò)張和持續(xù)增長(zhǎng)的現(xiàn)象，種群大小較為穩(wěn)定。

基因流(Nm)可以揭示種群間可能存在的基因滲透現(xiàn)象[29]。當(dāng)Nm<1時(shí)，種群間遺傳分化的主要因素為遺傳漂變，當(dāng)Nm>4，說(shuō)明種群間存在較強(qiáng)的基因流[30-31]。本研究中，黑胸大蠊9個(gè)地理種群的基因流Nm為4.22>4，表明種群間存在較強(qiáng)的基因交流，在一定程度上阻礙了群體的遺傳分化。系統(tǒng)發(fā)育和單倍型網(wǎng)絡(luò)圖分析中黑胸大蠊各地理種群的單倍型并沒有單獨(dú)聚在一起，部分單倍型被來(lái)自不同地理種群的個(gè)體所共享。根據(jù)AMOVA分析可知黑胸大蠊遺傳變異主要來(lái)源于種群內(nèi)部，由此可見黑胸大蠊地理種群間基因交流頻繁并遺傳分化程度較低，說(shuō)明為使種群在自然選擇作用下穩(wěn)定存在，需在種群內(nèi)通過遺傳變異抵御外界環(huán)境的變化。本研究分析的9個(gè)地理種群間存在一定的距離跨度，但Mantel相關(guān)性檢測(cè)顯示遺傳距離與地理距離沒有顯著相關(guān)性，說(shuō)明種群間的地理距離與地理隔離無(wú)關(guān)。以上結(jié)果一致表明黑胸大蠊種群間無(wú)顯著的系統(tǒng)發(fā)育地理結(jié)構(gòu)。究其原因可能是由于黑胸大蠊種群間存在較高的基因交流。王紅等[13]基于線粒體COI基因的分析可知，昆蟲種群間的基因交流程度并不是完全取決于其遷飛能力，而遷飛能力弱或無(wú)遷飛能力的昆蟲，也可通過其他方式進(jìn)行基因交流。黑胸大蠊的遷飛能力雖然弱，但多寄居于輪船、火車、飛機(jī)等交通工具及人類居住的環(huán)境內(nèi)，會(huì)因交通工具和人為因素而進(jìn)行遷移擴(kuò)散，進(jìn)而增強(qiáng)了物種內(nèi)的基因交流，這一結(jié)果同上述基因流分析的結(jié)果相吻合。

本研究的結(jié)果在一定程度上為黑胸大蠊地理種群遺傳多樣性的研究提供了一定的理論依據(jù)。但基于本研究的采樣地點(diǎn)僅限于中國(guó)的浙江、湖南、貴州、云南的部分地區(qū)，且部分地區(qū)種群包含的樣本數(shù)量較少。只利用了線粒體COI基因的部分序列片段，并不能獲取完整的遺傳信息。因此，若要全面了解中國(guó)的黑胸大蠊遺傳多樣性及系統(tǒng)發(fā)育地理結(jié)構(gòu)，還需擴(kuò)大樣本的采集范圍和樣本量。同時(shí)考慮全長(zhǎng)序列的分析及結(jié)合更多的分子標(biāo)記進(jìn)行進(jìn)一步分析，從而更加全面地了解黑胸大蠊各種群間的系統(tǒng)發(fā)育地理關(guān)系及遺傳機(jī)制，為黑胸大蠊的有效防治策略提供理論依據(jù)。