高效降解棉籽粕中游離棉酚菌株的篩選及復(fù)配發(fā)酵方式的優(yōu)化

亓秀曄 謝全喜 于佳民 趙 倩 張志焱 徐海燕 谷 巍

(山東寶來(lái)利來(lái)生物工程股份有限公司，泰安 271000)

隨著我國(guó)畜牧業(yè)的快速發(fā)展，飼料的需求越來(lái)越大。棉籽餅(粕)是我國(guó)除豆粕以外的一種優(yōu)質(zhì)的植物性蛋白飼料，因此棉籽粕的開(kāi)發(fā)利用是解決我國(guó)蛋白質(zhì)資源短缺的主要途徑之一。我國(guó)每年可生產(chǎn)600多萬(wàn)t棉籽粕，而使用量?jī)H為30%，資源浪費(fèi)嚴(yán)重[1]，這是由于棉籽餅中含有棉酚、環(huán)丙稀脂肪酸、單寧等有毒物質(zhì)，制約了其在畜牧業(yè)中的應(yīng)用。其中最主要的是棉酚。棉酚的存在形式有2種，即結(jié)合棉酚和游離棉酚。結(jié)合棉酚在機(jī)體消化系統(tǒng)中不被吸收，可很快隨糞便排出體外，毒性很低。游離棉酚分子結(jié)構(gòu)中的活性基團(tuán)(醛基和羧基)對(duì)動(dòng)物毒性很大，長(zhǎng)期飼喂動(dòng)物過(guò)多的未經(jīng)脫毒的棉籽粕飼料，棉酚含量會(huì)在動(dòng)物體內(nèi)蓄積，引發(fā)中毒，棉酚中毒的表現(xiàn)在所有動(dòng)物中是相似的，均會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物出現(xiàn)急性呼吸窘迫臨床癥狀，厭食乏力，甚至死亡等[2-3]。大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)如羊、豬和肉雞等表明，棉酚在動(dòng)物體內(nèi)各器官中的殘留是不均勻的，最先在肝臟中蓄積，其次是膽汁、腎、脾和血液，而淋巴結(jié)、心、肺、膈肌和胰中的含量較低[4]。飼料中游離棉酚可以在不同畜禽體內(nèi)殘留，并轉(zhuǎn)移到人們可食用的畜產(chǎn)品中[5]。

棉粕的脫毒方法主要有物理法、化學(xué)法和微生物發(fā)酵法等，其中微生物發(fā)酵法是目前普遍認(rèn)為的成本低、效果好、較安全的脫毒方法[6-8]。研究表明，微生物發(fā)酵能有效降解飼料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子，促進(jìn)養(yǎng)分的消化吸收，改善動(dòng)物健康，減少飼用抗生素(促生長(zhǎng))的使用[9]。微生物發(fā)酵棉籽餅脫毒的關(guān)鍵是菌種的選擇，不同微生物菌種對(duì)棉酚的降解能力不同，篩選優(yōu)良的微生物菌種是影響棉籽粕脫毒效果的首要條件。選取合適的微生物進(jìn)行飼料的發(fā)酵能有效降解飼料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子，促進(jìn)養(yǎng)分的消化吸收，分泌的代謝產(chǎn)物如小肽、有機(jī)酸等利于改善動(dòng)物健康[10-12]。目前，國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)可降解棉籽粕中游離棉酚的微生物主要有假絲酵母、黑曲霉、稻根霉菌、魯氏毛霉甚至還有黃曲霉等真菌、芽孢菌和乳酸菌等細(xì)菌。但是這些菌單獨(dú)發(fā)酵時(shí)存在一些不足，比如霉菌在動(dòng)物飼料中使用的安全性仍然被懷疑；芽孢菌在氨基酸代謝中會(huì)發(fā)生脫羧或脫氨作用，產(chǎn)生刺鼻的氨，影響發(fā)酵風(fēng)味；乳酸菌降解棉酚效果不顯著等。實(shí)際生產(chǎn)中真菌和細(xì)菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用存在一定的差別，如果利用安全的真菌和細(xì)菌聯(lián)合發(fā)酵棉籽粕或許可以更有利于棉籽粕中棉酚的降解。本研究旨在利用酵母菌和乳酸菌對(duì)棉籽粕進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，以降低棉酚含量，提高棉粕蛋白利用率，改善棉粕品質(zhì)，具有廣闊的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 發(fā)酵基料及菌株

棉籽粕由新疆泰昆生物集團(tuán)提供，粉碎過(guò)40目篩。

酵母菌(Yeast)菌株：BLCC4-0327、BLCC4-0021、BLCC4-0018、BLCC4-0048，乳酸桿菌(Lactobacillus)菌株：BLCC2-0015、BLCC2-0092、BLCC2-0111、BLCC2-0112和BLCC2-0111；均由山東寶來(lái)利來(lái)生物工程股份有限公司研究院保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖(yeast extract peptone dextrose medium，YEPD)培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母膏0.5 g/L，磷酸二氫鉀2.0 g/L，pH自然，121 ℃滅菌20 min。

MRS培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，牛肉膏8 g/L，酵母膏4 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，硫酸錳0.3 g/L，檸檬酸銨2 g/L，乙酸鈉5 g/L，吐溫-80 1 mL/L，pH值6.0，121 ℃滅菌20 min。

1.1.3 化學(xué)試劑

葡萄糖：山東祥瑞藥業(yè)有限公司；硫酸鎂、硫酸錳：濟(jì)南匯豐達(dá)化工有限公司；檸檬酸銨：上海撫生實(shí)業(yè)有限公司；乙酸鈉：青島捷世康生物科技有限公司；吐溫-80、氫氧化鈉、氫氧化鈉、磷酸、氯化鈉：天津博迪化工股份有限公司；磷酸二氫鉀：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；試劑均為分析純。乙腈、丙酮、甲醇(均為色譜級(jí))：天津市永大化學(xué)試劑有限公司；微孔濾膜(直徑13 mm、孔徑0.22 μm)：上海安譜有限公司；棉酚標(biāo)準(zhǔn)品(純度98%)：上海源葉生物科技有限公司。蛋白胨：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；牛肉膏、酵母膏：天津市英博生化試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DHP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；THZ-C恒溫振蕩器：揚(yáng)州培英實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；LDE-2A低速離心機(jī)：北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司；SHB-ⅢS循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；SB1200 超聲波清洗機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；LC-20AT液相色譜儀：日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 酵母菌和乳桿菌發(fā)酵液的制備

將4 ℃條件下保存的酵母斜面活化，轉(zhuǎn)接到裝有50 mL YEPD培養(yǎng)基的三角瓶中，30 ℃搖床振蕩培養(yǎng)16 h備用；將4 ℃條件下保存的乳桿菌斜面活化，轉(zhuǎn)接到裝有100 mL MRS培養(yǎng)基的鹽水瓶中，37 ℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)24 h備用。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.2.1 酵母菌的篩選

稱(chēng)取一定量的基料于500 mL三角瓶中，料水比為1∶0.4 (m/V)，裝量50 g/瓶，按2%接種量分別接入培養(yǎng)好的酵母菌種子液，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行，以不接種任何菌株的空白料為對(duì)照，置于30 ℃培養(yǎng)箱進(jìn)行需氧發(fā)酵，分別于發(fā)酵24 h和48 h取樣，測(cè)定活菌數(shù)、酸溶蛋白和游離棉酚含量。

1.3.2.2 乳桿菌的篩選

稱(chēng)取一定量的基料按料水比1∶0.4 (g∶mL)配制好，以袋量為100 g/袋裝袋，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行，分別按照2%接種量接入培養(yǎng)好的乳桿菌發(fā)酵液，以不接種任何菌株的空白料為對(duì)照，壓實(shí)后于37 ℃培養(yǎng)箱進(jìn)行生料厭氧發(fā)酵，分別于發(fā)酵24 h和48 h取樣，測(cè)定pH值、活菌數(shù)、酸溶蛋白和游離棉酚含量。

1.3.2.3 混菌發(fā)酵

將篩選得到的酵母菌和乳桿菌進(jìn)行混菌發(fā)酵，發(fā)酵方式為厭氧發(fā)酵，料水比為1∶0.4(g ∶mL)，以裝袋量為100 g/袋裝袋，接種量2%，乳桿菌∶酵母菌(3∶2)，生料發(fā)酵，30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。以不接種任何菌株的空白料為對(duì)照，分別于發(fā)酵24 h和48 h取樣，測(cè)定pH值、活菌數(shù)、酸溶蛋白和游離棉酚含量。

1.4 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.4.1 pH測(cè)定

取10 g樣品加入90 mL滅菌后的生理鹽水中，攪拌均勻后直接測(cè)定。

1.4.2 乳桿菌和酵母菌活菌數(shù)的測(cè)定

準(zhǔn)確稱(chēng)取發(fā)酵棉粕10.0 g，用生理鹽水10倍遞增稀釋?zhuān)∵m當(dāng)稀釋度的樣品分別至LBS培養(yǎng)基和孟加拉紅培養(yǎng)基中，分別于37 ℃和30 ℃培養(yǎng)48 h，根據(jù)菌落數(shù)計(jì)算樣品中乳桿菌和酵母菌數(shù)量，結(jié)果用CFU/g表示。

1.4.3 酸溶蛋白含量的測(cè)定

準(zhǔn)確稱(chēng)取2.00 g發(fā)酵棉籽粕于25 mL具塞試管中，加入15%三氯乙酸溶液10 mL，混合均勻，靜止5 min，定容至25 mL，每隔2 min混勻1次，共計(jì)時(shí)30 min。將溶液定量轉(zhuǎn)移，抽濾，取濾液10 mL，轉(zhuǎn)入消化管中，加入3 g混合催化劑(硫酸鉀∶無(wú)水硫酸銅=15 ∶1)，與濾液混合均勻，再加入7～8 mL濃硫酸，將消化管置于消化爐中420 ℃消化，待消化液呈透亮的藍(lán)綠色時(shí)，繼續(xù)消化40 min，按照凱氏定氮法測(cè)定上清液中可溶性蛋白質(zhì)含量。另準(zhǔn)確稱(chēng)取2.00 g發(fā)酵棉籽粕，采用凱氏定氮法測(cè)定樣品中粗蛋白含量。

酸溶蛋白含量=(上清液中可溶性蛋白質(zhì)含量×25/10)/樣品中粗蛋白含量×100%。

1.4.4 游離棉酚含量的測(cè)定[13]

棉酚標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱(chēng)取棉酚標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈- 0.2%磷酸(體積比為85∶15)溶解得1.21 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液再用乙腈-0.2%磷酸(體積比為85∶15)稀釋成121 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品工作液。用流動(dòng)相將標(biāo)準(zhǔn)品工作液逐級(jí)稀釋得到濃度分別為61.50、20.17、5.04、2.52、1.21 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，濃度由低至高進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積和濃度作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：Y=0.000 005 45X+ 0.160 525(R2=0.999 965 2)，線性范圍為1.21～121 μg/mL。參照GB 5009.148—2014規(guī)定利用高效液相色譜法檢測(cè)[14]，植物油體樣品取樣1.0 g 時(shí)，檢出限為2.5 mg/kg ，定量限為7.5 mg/kg；以棉籽餅為原料的水溶性液體樣品取樣10 g 時(shí)，檢出限為0.25 mg/kg，定量限為0.75 mg/kg。

待測(cè)樣品游離棉酚的提?。簻?zhǔn)確稱(chēng)取待測(cè)樣品3.00 g，加入丙酮30 mL，超聲提取30 min，25 ℃下3 000 r/min離心10 min，重復(fù)提取3次，合并上清液。將上清液全部轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用乙腈- 0.2%磷酸(體積比為85∶15)溶液溶解，多次超聲清洗轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶，定容，過(guò)0.22 μm濾膜后供HPLC測(cè)定。

HPLC法測(cè)定游離棉酚含量：色譜條件為色譜柱IntertsilR ODS-2(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈- 0.2%磷酸(體積比為85∶15)溶液，流速1.0 mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)235 nm，進(jìn)樣量20 μL，柱溫25℃。

1.4.5 棉酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

由棉酚標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜圖(圖1，棉酚標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度6.15 μg/mL)，可以看出，在5.686 min左右出棉酚色譜峰，且穩(wěn)定性良好、分離效果好、峰型理想、靈敏度高。由圖2可以看出，棉酚標(biāo)準(zhǔn)曲線線性吻合良好、定量范圍廣、定量限低、準(zhǔn)確度和靈敏度高，該方法可用于準(zhǔn)確測(cè)定游離棉酚的含量。

圖1 棉酚標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜圖

圖2 游離棉酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)用Excel 2007進(jìn)行初步處理后，采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)程序進(jìn)行方差分析，LSD法進(jìn)行組間多重比較，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 酵母菌的篩選

由表1可知，發(fā)酵24 h時(shí)，各酵母菌菌株均能夠成功發(fā)酵棉籽粕，各組發(fā)酵棉籽粕中酵母菌活菌數(shù)均在幾億水平，差異不顯著；與空白對(duì)照組相比，各菌株發(fā)酵均顯著提高了發(fā)酵棉籽粕中酸溶蛋白含量(P<0.05)，其中以菌株BLCC4-0327發(fā)酵時(shí)最高，四組酵母菌發(fā)酵組間差異不顯著(P>0.05)，BLCC4-0327組的酸溶蛋白含量較空白對(duì)照組高出23.20%。以BLCC4-0327組發(fā)酵棉籽粕游離棉酚含量最低，顯著低于其他各組(P<0.05)，其游離棉酚降解率達(dá)到72.72%，其次是BLCC4-0018組，BLCC4-0048組游離棉酚降解率最低。

表1 不同酵母菌發(fā)酵棉粕對(duì)飼料品質(zhì)的影響

注：游離棉酚降解率=[(空白對(duì)照組樣品游離棉酚含量-發(fā)酵組樣品游離棉酚含量)/空白對(duì)照組樣品游離棉酚含量]×100，余同。

發(fā)酵48 h時(shí)，各組發(fā)酵棉籽粕中酵母菌活菌數(shù)升高，以BLCC4-0327較高，但差異不顯著。BLCC4-0327組的酸溶蛋白含量最高，顯著高于高于其他酵母菌發(fā)酵組(P<0.05)。以BLCC4-0327組發(fā)酵棉籽粕游離棉酚含量最低，顯著低于其他各組(P<0.05)，其游離棉酚降解率達(dá)到81.83%，其次是BLCC4-0018組，BLCC4-0048組游離棉酚降解率最低。綜上可知，酵母菌BLCC4-0327在提高發(fā)酵棉籽粕的酸溶蛋白含量和降低游離棉酚含量方面效果最好。

2.2 乳酸菌的篩選

由表2可知，5個(gè)乳酸菌發(fā)酵組中，發(fā)酵24 h時(shí)除BLCC2-0112組發(fā)酵棉籽粕中乳酸菌活菌數(shù)較低外，其他乳酸菌發(fā)酵組間差異不顯著(P>0.05)，均在幾十億水平，發(fā)酵48 h 時(shí)仍以BLCC2-0112組發(fā)酵棉籽粕中乳酸菌活菌數(shù)最低，顯著低于其他乳酸菌發(fā)酵組(P<0.05)；無(wú)論是發(fā)酵24 h還是發(fā)酵48 h時(shí)，發(fā)酵棉籽粕的pH均以BLCC2-0092和BLCC2-0001組最低，其次是BLCC2-0015組，這3組在發(fā)酵48 h時(shí)pH均降至5.00以下，其中BLCC2-0092組在發(fā)酵48 h時(shí)pH降至4.67。從降低發(fā)酵棉籽粕的pH來(lái)看，5株乳酸菌中以菌株BLCC2-0092、BLCC2-0001和BLCC2-0015發(fā)酵棉籽粕較好，最優(yōu)為菌株BLCC2-0092。

表2 乳酸菌發(fā)酵對(duì)棉粕品質(zhì)和游離棉酚含量的影響

表3 酵母菌和乳酸菌復(fù)配發(fā)酵對(duì)飼料品質(zhì)的影響

2.3 酵母菌和乳酸菌的復(fù)配發(fā)酵

由表3可以看出，各復(fù)配菌株發(fā)酵組各發(fā)酵階段發(fā)酵棉籽粕中酵母菌活菌數(shù)均達(dá)到或接近億水平，乳酸菌活菌數(shù)達(dá)到幾十億水平，與同時(shí)間段下菌株單獨(dú)發(fā)酵時(shí)相比有所降低。綜合各項(xiàng)指標(biāo)來(lái)看，2個(gè)復(fù)配菌株發(fā)酵組中以BLCC4-0327+ BLCC2-0092組最優(yōu)。與空白對(duì)照組相比，BLCC4-0327+ BLCC2-0092組各發(fā)酵階段的發(fā)酵棉籽粕的pH均顯著降低(P<0.05)，發(fā)酵24 h時(shí)pH降至5.73，發(fā)酵48 h時(shí)pH降至5.64，這高于乳酸菌單獨(dú)發(fā)酵時(shí)的pH，但顯著低于酵母菌單獨(dú)發(fā)酵時(shí)(數(shù)值未列出，酵母菌發(fā)酵pH變化不大，均在6.50以上)。各復(fù)配菌株發(fā)酵組各發(fā)酵階段發(fā)酵棉籽粕的游離棉酚含量顯著降低(P<0.05)，游離棉酚降解率均在60%以上，優(yōu)于乳酸菌單獨(dú)發(fā)酵時(shí)。發(fā)酵24 h時(shí)，BLCC4-0327+BLCC2-0092組游離棉酚降解率達(dá)到70.99%，發(fā)酵48 h時(shí)游離棉酚降解率達(dá)到73.44%，這個(gè)數(shù)值稍低于酵母菌BLCC4-0327單獨(dú)發(fā)酵時(shí)。

各復(fù)配菌株發(fā)酵組發(fā)酵棉籽粕的酸溶蛋白含量顯著提高，發(fā)酵24 h時(shí)BLCC4-0327+ BLCC2-0092組酸溶蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到14.61%，這比BLCC4-0327單獨(dú)發(fā)酵時(shí)提高了82.17%，比BLCC2-0092單獨(dú)發(fā)酵時(shí)提高了122.71%；發(fā)酵48 h時(shí)酸溶蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到17.61%，這比BLCC4-0327單獨(dú)發(fā)酵時(shí)提高了111.91%，比BLCC2-0092單獨(dú)發(fā)酵時(shí)提高了176.45%。

3 討論

利用微生物發(fā)酵棉籽粕，在使其游離棉酚含量的安全性大大提高的同時(shí)，還可以提高棉籽粕的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值如改善蛋白質(zhì)含量及發(fā)酵風(fēng)味等，增加其在動(dòng)物飼糧中的添加量，提高棉籽粕的利用率[15-16]。發(fā)酵、酶解粕類(lèi)和植物蛋白質(zhì)源的主要目的是將其中的大分子蛋白質(zhì)降解成為小分子蛋白質(zhì)，甚至降解成多肽和小肽，從而促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成，促進(jìn)礦物質(zhì)元素的吸收利用，提高動(dòng)物機(jī)體的免疫機(jī)能以及動(dòng)物的生長(zhǎng)速率和生產(chǎn)性能。研究表明，使用酸溶蛋白質(zhì)含量指標(biāo)評(píng)價(jià)發(fā)酵、酶解粕類(lèi)蛋白質(zhì)品質(zhì)，既可以反映其中抗原蛋白質(zhì)和其他蛋白質(zhì)抗?fàn)I養(yǎng)因子被水解的程度，進(jìn)而揭示該類(lèi)抗?fàn)I養(yǎng)因子活性被消除的程度，又可在一定程度上反映肽含量的高低[17-18]。

酵母菌是人類(lèi)利用較早的一大類(lèi)真核微生物，它是研究真核生物的模式菌株；此外，酵母菌還具有脫毒作用，主要表現(xiàn)在兩個(gè)方面：一方面是酵母菌對(duì)真菌毒素、細(xì)菌內(nèi)毒素及其他有害有毒物質(zhì)具有減毒或脫毒作用；另一方面為酵母菌細(xì)胞壁中的β-葡聚糖及糖蛋白參與了生物脫毒過(guò)程，酵母菌細(xì)胞壁也作為高效脫毒劑得到了應(yīng)用[19]。有關(guān)酵母菌發(fā)酵棉籽粕脫毒效果的研究有很多，但大都需要較復(fù)雜的條件，或是需要較大的接種量或是培養(yǎng)基需要另添加底物。如程福亮等[20]以產(chǎn)朊假絲酵母為發(fā)酵菌種，在溫度為30 ℃、發(fā)酵底物含水量為37%和接種量5%的條件下進(jìn)行固態(tài)厭氧發(fā)酵，發(fā)酵36 h 降解棉酚率為85.7%；周慧林等[21]對(duì)釀酒酵母、產(chǎn)朊假絲酵母和熱帶假絲酵母3種酵母棉酚的培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)能力進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)朊假絲酵母降解棉酚能力強(qiáng)，在接種107水平，30 ℃發(fā)酵24 h時(shí)棉酚含量下降了55.6%。陳生琴等[22]發(fā)現(xiàn)以醋酸棉酚為唯一碳源，分離篩選到的一株高效降解棉酚菌株RE-1，在最優(yōu)發(fā)酵條件為溫度34 ℃、時(shí)間8 d、pH5.0、料水比1∶0.5、接種量20%時(shí)，發(fā)酵棉籽粕中棉酚的降解率達(dá)到72.54%；張文舉等[23]發(fā)現(xiàn)，在棉籽餅發(fā)酵底物中需要額外補(bǔ)充糖類(lèi)、尿素或是硫酸亞鐵等，才可以降低發(fā)酵料的棉酚含量。在本研究中，酵母菌BLCC4-0327單獨(dú)發(fā)酵棉籽粕，2%接種量，30 ℃發(fā)酵24 h時(shí)，游離棉酚降解率可達(dá)到72.72%，同時(shí)發(fā)酵料的酸溶蛋白含量較空白對(duì)照組提高23.02%(P<0.05)，優(yōu)于文獻(xiàn)中報(bào)道。

乳酸菌在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生乳酸、乙酸、丙酸和細(xì)菌素等多種物質(zhì)，這些物質(zhì)除具有殺毒抑菌作用外，還具有維持腸道內(nèi)菌群平衡、抑制病原菌微生物生長(zhǎng)、調(diào)節(jié)胃腸道功能等作用，同時(shí)餅粕類(lèi)飼料經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后，有特殊的酸甜芳香氣味，pH下降，能有效改善飼料的適口性[24]。劉建成等[25]研究發(fā)現(xiàn)一株德氏乳桿菌固態(tài)發(fā)酵棉粕產(chǎn)有機(jī)酸含量達(dá)到25.64 g/kg，比優(yōu)化前提高了39.65%；乳酸菌固態(tài)發(fā)酵酶解豆粕、棉籽粕和菜籽粕均能有效提高粗蛋白質(zhì)含量，降低pH，使酸度增加；有效降解棉籽粕中單寧及菜籽中異硫氰酸酯和唑烷硫酮，而對(duì)游離棉酚及植酸的降解能力有限[26]。這也與本研究結(jié)果一致，本研究發(fā)現(xiàn)幾株乳酸菌均不具有降解棉酚的能力，但可以降低發(fā)酵棉籽粕的pH，乳酸菌BLCC2-0092發(fā)酵24 h時(shí)，發(fā)酵棉籽粕 pH 降至5.47。因此，本研究利用酵母菌和乳酸菌復(fù)配發(fā)酵棉籽粕，在降低發(fā)酵棉籽粕中游離棉酚含量的同時(shí)，改善發(fā)酵風(fēng)味，大幅度提高飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

混菌發(fā)酵的效果優(yōu)于單菌發(fā)酵。諸葛斌等[27]利用黑曲霉P1和枯草芽孢桿菌H1按照2∶1比例混菌發(fā)酵，發(fā)酵后棉粕小肽含量可提高18.36%；喬曉艷等[28]利用熱帶假絲酵母JD-9和甘酪乳桿菌MX-48發(fā)酵棉粕，發(fā)酵后游離棉酚脫毒率達(dá)到48.1%，棉粕中小肽含量提高14.43%；劉惠琴等[29]從棉籽殼中分離出一株能降解游離棉酚的細(xì)菌M2，產(chǎn)朊假絲酵母與M2 的混合接種比為7∶3，發(fā)酵溫度32.5 ℃，發(fā)酵時(shí)間54 h，底物初始含水量75%，pH自然，在此條件下游離棉酚的降解率最高，達(dá)到53.021%。本研究中，將降解游離棉酚效果最好的酵母菌和降低 pH 效果最好的乳酸菌復(fù)配發(fā)酵，與空白對(duì)照組相比，最優(yōu)復(fù)配發(fā)酵組(BLCC4-0327+ BLCC2-0092組)各發(fā)酵階段的發(fā)酵棉籽粕的pH均顯著降低(P<0.05)，發(fā)酵24 h時(shí)pH降至5.73；游離棉酚含量顯著降低(P<0.05)，發(fā)酵24 h時(shí)游離棉酚降解率達(dá)到70.99%，發(fā)酵48 h時(shí)游離棉酚降解率達(dá)到73.44%，但這兩個(gè)指標(biāo)并沒(méi)有超越乳酸菌和酵母菌單獨(dú)發(fā)酵時(shí)的效果。分析原因可能是由于接種比例問(wèn)題，在發(fā)酵過(guò)程中導(dǎo)致兩種菌生長(zhǎng)狀態(tài)不一致[30]，酵母菌生長(zhǎng)旺盛會(huì)抑制產(chǎn)酸，導(dǎo)致pH降低沒(méi)那么明顯；產(chǎn)酸量過(guò)高會(huì)抑制酵母菌生長(zhǎng)，而酵母菌是降解游離棉酚的有效菌株，從而導(dǎo)致混菌發(fā)酵的游離棉酚降解率沒(méi)有酵母菌單獨(dú)發(fā)酵時(shí)高，但總體差異不顯著。整體來(lái)看，混菌發(fā)酵優(yōu)于單菌，主要體現(xiàn)在酸溶蛋白方面：最優(yōu)復(fù)配發(fā)酵組(BLCC4-0327+BLCC2-0092組)發(fā)酵24 h時(shí)BLCC4-0327+ BLCC2-0092組酸溶蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到14.61%，這比BLCC4-0327單獨(dú)發(fā)酵時(shí)提高了82.17%，比BLCC2-0092單獨(dú)發(fā)酵時(shí)提高了122.71%；發(fā)酵48 h時(shí)酸溶蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到17.61%，這比BLCC4-0327單獨(dú)發(fā)酵時(shí)提高了111.91%，比BLCC2-0092單獨(dú)發(fā)酵時(shí)提高了176.45%。

4 結(jié)論

利用酵母菌和乳酸菌發(fā)酵棉籽粕，篩選出可高效降解游離棉酚的酵母菌BLCC4-0327，可改善發(fā)酵風(fēng)味的乳酸菌BLCC2-0092。結(jié)果表明，最優(yōu)復(fù)配發(fā)酵組為BLCC4-0327+BLCC2-0092(1∶1)，30 ℃厭氧發(fā)酵。與空白對(duì)照組相比，最優(yōu)復(fù)配發(fā)酵組各發(fā)酵階段的發(fā)酵棉籽粕的pH均顯著降低(P<0.05)；酸溶蛋白含量顯著提高(P<0.05)；游離棉酚含量顯著降低(P<0.05)。