熒光 PCR 探針熔解曲線技術(shù)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌對(duì)五種抗結(jié)核藥物耐藥性的研究

曹志華 趙悅竹 胡雙雙

結(jié)核病是全球范圍內(nèi)一種重要的傳染病，嚴(yán)重危害著人類的生命健康[1]。隨著抗結(jié)核藥物的廣泛使用，耐藥結(jié)核病患者逐漸增加，給結(jié)核病的預(yù)防和治療帶來重大的挑戰(zhàn)[2-3]。耐多藥結(jié)核病(multidrug resistant tuberculosis, MDR-TB)[4]即至少同時(shí)對(duì)異煙肼(INH)和利福平(RFP)兩種一線抗結(jié)核藥物產(chǎn)生耐藥的結(jié)核病，具有治療成本高、周期長(zhǎng)、治愈率低等特點(diǎn)[4-5]，所以，需要準(zhǔn)確診斷和治療才能有效預(yù)防廣泛流行[6-8]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織建議，結(jié)核病治療方案中至少應(yīng)包含MTB對(duì)其不具有耐藥性的4種有效藥物，這樣能顯著提高結(jié)核病患者的治愈率[1]。但是，在我國大部分結(jié)核病患者沒有進(jìn)行耐藥性檢測(cè)，導(dǎo)致治療存在較大盲目性[6]。目前，臨床常用的MTB藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱“藥敏試驗(yàn)”)存在耗時(shí)費(fèi)力，操作繁瑣，受人為因素影響較大，標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一等缺點(diǎn)[9-10]。因此，急切需要一種準(zhǔn)確且快速檢測(cè)多種抗結(jié)核藥物是否耐藥的方法，從而在臨床上能有效指導(dǎo)醫(yī)生對(duì)患者用藥[11-13]。近年來，基于基因水平的診斷方法進(jìn)行MTB耐藥性檢測(cè)的研究主要是針對(duì)RFP、INH兩種一線抗結(jié)核藥物，得到的耐藥信息有限[12-17]。本研究運(yùn)用熒光PCR 探針熔解曲線法來檢測(cè)MTB對(duì)RFP、INH、乙胺丁醇(EMB)、鏈霉素(Sm) 4種一線抗結(jié)核藥物以及氟喹諾酮(FQ)類藥物的耐藥突變，與金標(biāo)準(zhǔn)比例法藥敏試驗(yàn)進(jìn)行對(duì)比，以評(píng)價(jià)該方法檢測(cè)耐藥結(jié)核病的臨床應(yīng)用價(jià)值。

資料和方法

一、標(biāo)本來源

收集2018年1—8月分離自遼寧省撫順市第四人民醫(yī)院門診患者的155株MTB臨床分離株，經(jīng)對(duì)硝基苯甲酸(PNB)生長(zhǎng)試驗(yàn)鑒定，153株為MTB，2株為非MTB。

二、 試劑與儀器

RFP、INH、EMB、Sm、左氧氟沙星(Lfx)和PNB含藥培養(yǎng)基(珠海貝索生物技術(shù)有限公司)；4% NaOH溶液；熒光PCR 探針熔解曲線法檢測(cè)試劑：MTB對(duì)RFP、INH、EMB、Sm和FQ耐藥突變檢測(cè)試劑盒(廈門致善生物科技股份有限公司)；SLAN-96S型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(上海宏石醫(yī)療科技有限公司)；BY-R18型低溫高速離心機(jī)(北京白洋醫(yī)療器械有限公司)。

三、固體培養(yǎng)及比例法藥敏試驗(yàn)

按照《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[18]進(jìn)行簡(jiǎn)單法分枝桿菌固體培養(yǎng)(簡(jiǎn)稱“固體培養(yǎng)”)：用移液槍吸取1～2 ml標(biāo)本至離心管中，加入1～2倍的4% NaOH溶液進(jìn)行前處理，振蕩至痰標(biāo)本液化，室溫靜置15 min，將前處理后的痰標(biāo)本均勻接種至酸性羅氏培養(yǎng)基斜面上，置于恒溫培養(yǎng)箱37 ℃孵育4～8周，最后肉眼判定：若無菌落生長(zhǎng)則報(bào)告培養(yǎng)陰性；若出現(xiàn)不透明淡黃色、粗糙、干燥、凸起于培養(yǎng)基、或呈菜花樣，則報(bào)告培養(yǎng)陽性；若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基液化或者生長(zhǎng)真菌，則報(bào)告污染。

培養(yǎng)結(jié)果為陽性者經(jīng)PNB生長(zhǎng)試驗(yàn)鑒定為MTB復(fù)合群后，再進(jìn)行比例法藥敏試驗(yàn)：在磨菌瓶中加入1～2滴10%吐溫-80水溶液，用接種環(huán)刮取2～3周的新鮮菌落置于磨菌瓶中，旋渦振蕩10～20 s，將菌液用生理鹽水稀釋至1 mg/ml，再用生理鹽水分別稀釋至10-2mg/ml和10-4mg/ml，然后用22 SWG標(biāo)準(zhǔn)接種環(huán)分別取1滿環(huán)10-2mg/ml和10-4mg/ml的菌液，用劃線法均勻接種至作為對(duì)照的中性改良培養(yǎng)基及含藥培養(yǎng)基表面，置于恒溫培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)，4周后報(bào)告結(jié)果。

四、熒光 PCR 探針熔解曲線法檢測(cè)MTB對(duì)5種抗結(jié)核藥物的耐藥性

按照熒光PCR探針熔解曲線法耐藥突變檢測(cè)試劑盒說明書的要求進(jìn)行檢測(cè)。針對(duì)RFP耐藥性基因突變，檢測(cè)rpoB基因507～533共27個(gè)氨基酸密碼子區(qū)域內(nèi)(81 bp，RFP耐藥決定區(qū))的突變狀況；針對(duì)INH耐藥性基因突變，檢測(cè)katG315密碼子、inhA94密碼子、inhA啟動(dòng)子區(qū)(-17～-8位點(diǎn))和ahpC啟動(dòng)子(-44～-30及-15～3位點(diǎn))的突變狀況；針對(duì)EMB耐藥性基因突變，檢測(cè)embB306、embB406以及embB497共3個(gè)密碼子的突變狀況；針對(duì)Sm耐藥性基因突變，檢測(cè)rpsL43密碼子、rpsL88密碼子、rrs905～908密碼子的突變狀況；針對(duì)FQ耐藥性基因突變，檢測(cè)gyrA88～94密碼子的突變狀況，從而進(jìn)行MTB的耐藥篩查。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以比例法藥敏試驗(yàn)為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算熒光PCR探針熔解曲線法的敏感度、特異度、一致率和Kappa值(極低一致：0.00～0.20；一般一致：0.21～0.40；中等一致：0.41～0.60；高度一致：0.61～0.80；完全一致：0.81～1.00)。

結(jié) 果

一、比例法藥敏試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)153株MTB菌株進(jìn)行比例法藥敏試驗(yàn)，其中對(duì)RFP耐藥者有45株，敏感者有108株；對(duì)INH耐藥者有53株，敏感者有100株；對(duì)EMB耐藥者有21株，敏感者有132株；對(duì)Sm耐藥者有29株，敏感者有124株；對(duì)FQ耐藥者有16株，敏感者有137株。其中，同時(shí)對(duì)RFP和INH耐藥者有37株，同時(shí)對(duì)5種抗結(jié)核藥物耐藥者有8株。

二、熒光PCR探針熔解曲線法

熒光PCR探針熔解曲線法檢測(cè)153株MTB，檢出49株對(duì)RFP耐藥，104株對(duì)RFP敏感；52株對(duì)INH耐藥，101株對(duì)INH敏感；28株對(duì)EMB耐藥，125株對(duì)EMB敏感；35株對(duì)Sm耐藥，118株對(duì)Sm敏感；20株對(duì)FQ耐藥，133株對(duì)FQ敏感。其中，檢測(cè)出34株對(duì)RFP和INH均耐藥，8株對(duì)5種抗結(jié)核藥物均耐藥。

三、敏感度和特異度

以比例法藥敏試驗(yàn)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，熒光PCR探針熔解曲線法檢測(cè)MTB對(duì)RFP耐藥性的敏感度為95.56%(43/45)，特異度為94.44%(102/108)，一致率為94.77%(145/153)，Kappa值為0.88；對(duì)INH耐藥性的敏感度為90.57%(48/53)，特異度為96.00%(96/100)，一致率為94.12%(144/153)，Kappa值為0.87；對(duì)EMB耐藥性的敏感度為85.71%(18/21)，特異度為92.42%(122/132)，一致率為91.50%(140/153)，Kappa值為0.69；對(duì)Sm耐藥性的敏感度為89.66%(26/29)，特異度為92.74%(115/124)，一致率為92.16%(141/153)，Kappa值為0.76；對(duì)FQ耐藥性的敏感度為93.75%(15/16)，特異度為96.35%(132/137)，一致率為96.08%(147/153)，Kappa值為0.81(表1～5)。

表1 以比例法藥敏試驗(yàn)為標(biāo)準(zhǔn)熒光PCR探針熔解曲線法檢測(cè)MTB對(duì)利福平耐藥性的效能

注敏感度=A/(A+C)×100%；特異度=D/(B+D)×100%；一致率=(A+D)/(A+B+C+D)×100%

表2 以比例法藥敏試驗(yàn)為標(biāo)準(zhǔn)熒光PCR探針熔解曲線法檢測(cè)MTB對(duì)異煙肼耐藥性的效能

注敏感度=A/(A+C)×100%；特異度=D/(B+D)×100%；一致率=(A+D)/(A+B+C+D)×100%

表3 以比例法藥敏試驗(yàn)為標(biāo)準(zhǔn)熒光PCR探針熔解曲線法檢測(cè)MTB對(duì)乙胺丁醇耐藥性的效能

注敏感度=A/(A+C)×100%；特異度=D/(B+D)×100%；一致率=(A+D)/(A+B+C+D)×100%

表4 以比例法藥敏試驗(yàn)為標(biāo)準(zhǔn)熒光PCR探針熔解曲線法檢測(cè)MTB對(duì)鏈霉素耐藥性的效能

注敏感度=A/(A+C)×100%；特異度=D/(B+D)×100%；一致率=(A+D)/(A+B+C+D)×100%

表5 以比例法藥敏試驗(yàn)為標(biāo)準(zhǔn)熒光PCR探針熔解曲線法檢測(cè)MTB對(duì)氟喹諾酮類藥物耐藥性的效能

注敏感度=A/(A+C)×100%；特異度=D/(B+D)×100%；一致率=(A+D)/(A+B+C+D)×100%

討 論

MTB是一種主要侵犯并破壞肺及淋巴系統(tǒng)的慢性生長(zhǎng)菌，侵襲肺部后會(huì)引起肺結(jié)核，攻擊人的淋巴細(xì)胞后將會(huì)降低人體免疫力，從而極易引起其他病癥[19]。根據(jù)Trauner等[20]的報(bào)道，患者體內(nèi)MTB菌群中存在大量低比例的耐藥突變，這些突變?cè)谒幬镏委熐氨阋呀?jīng)積累，在治療過程中，若沒有采用4種或4種以上有效藥物進(jìn)行治療，容易導(dǎo)致耐藥菌株的比例不斷上升，最終由敏感菌株變成耐藥菌株，這將使得治療更為艱難。根據(jù)2017年世界衛(wèi)生組織報(bào)道，我國是耐藥結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一[21]。臨床上目前使用的耐藥MTB檢測(cè)方法主要是經(jīng)過增殖培養(yǎng)后再進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，需要8周以上的時(shí)間，在采樣至報(bào)告結(jié)果的這個(gè)漫長(zhǎng)的等待過程當(dāng)中，可能會(huì)使得結(jié)核病患者不能及時(shí)得到有效的治療，導(dǎo)致病情加重，已經(jīng)不能滿足當(dāng)前的臨床需要。因此，迫切需要一種能快速檢測(cè)出MDR-MTB的方法。

近年來，隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，有關(guān)MTB產(chǎn)生耐藥的機(jī)制以及其耐藥相關(guān)基因被逐漸揭曉[22-24]。現(xiàn)有的MTB耐藥分子診斷方法主要有線性探針膜反向雜交法、基因芯片法、基因測(cè)序法和熒光PCR探針熔解曲線法等[25-27]。線性探針膜反向雜交法、基因芯片法在6～8 h可獲得結(jié)果，但要求特殊儀器，操作繁瑣，對(duì)人員和設(shè)施的要求高[15-16]。 基因測(cè)序法需要價(jià)格昂貴的儀器，且操作繁瑣，不適合臨床推廣。熒光PCR探針熔解曲線法不需要特殊的儀器，在通用的實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上就能完成整個(gè)過程，操作簡(jiǎn)便，在3 h內(nèi)就可以得到結(jié)果[28-31]。

本研究結(jié)果顯示，以比例法藥敏試驗(yàn)為金標(biāo)準(zhǔn)，熒光PCR探針熔解曲線法檢測(cè)MTB對(duì)RFP耐藥性基因突變的敏感度為95.56%，特異度為94.44%，一致率為94.77%；馬艷艷等[29]、徐費(fèi)凡等[14]、嚴(yán)虹等[30]研究的敏感度為87.69%～98.51%，特異度為93.90%～95.35%，一致率為92.89%～97.27%。檢測(cè)MTB對(duì)INH耐藥性基因突變的敏感度為90.57%，特異度為96.00%，一致率為94.12%；徐費(fèi)凡等[14]、嚴(yán)虹等[30]研究的敏感度為80.00%～94.12%，特異度為95.24%～96.40%，一致率為90.70%～94.55%。檢測(cè)MTB對(duì)EMB耐藥性基因突變的敏感度為85.71%，特異度為92.42%，一致率為91.50%；嚴(yán)虹等[30]研究的敏感度為88.64%，特異度為75.76%，一致率為80.91%。檢測(cè)MTB對(duì)Sm耐藥性基因突變的敏感度為89.66%，特異度為92.74%，一致率為92.16%；嚴(yán)虹等[30]研究的敏感度為82.98%，特異度為80.95%，一致率為81.82%。檢測(cè)MTB對(duì)FQ耐藥性基因突變的敏感度為93.75%，特異度為96.35%，一致率為96.08%；李國利等[31]研究的敏感度為97.01%，特異度為99.55%，一致率為99.21%。5種抗結(jié)核藥物耐藥突變檢測(cè)的敏感度、特異度和一致率均與徐費(fèi)凡等[14]、馬艷艷等[29]、嚴(yán)虹等[30]、李國利等[31]研究的結(jié)果接近，但不完全一致，可能的原因是：(1)檢測(cè)樣本數(shù)量有所差別，不同的樣本量會(huì)導(dǎo)致敏感度、特異度和一致率的波動(dòng)；(2)雖然本研究采用的藥敏試驗(yàn)方法與他們研究采用的藥敏試驗(yàn)方法一致，但是藥敏試驗(yàn)對(duì)操作人員要求高，不同操作人員可能會(huì)使得藥敏試驗(yàn)結(jié)果有所差異。

5種抗結(jié)核藥物的耐藥性基因突變檢測(cè)，均出現(xiàn)少數(shù)菌株熒光PCR探針熔解曲線法檢測(cè)結(jié)果與藥敏試驗(yàn)結(jié)果不一致，可分為兩種情況：(1)熒光PCR探針熔解曲線法檢測(cè)為野生型，而藥敏試驗(yàn)結(jié)果為耐藥，出現(xiàn)這種情況的原因可能是本方法所覆蓋耐藥檢測(cè)區(qū)以外的DNA序列發(fā)生突變?cè)斐赡退幓蛘咂渌退帣C(jī)制引起耐藥[28]；(2)熒光PCR探針熔解曲線法檢測(cè)為耐藥性基因突變，而藥敏試驗(yàn)結(jié)果為敏感，原因可能為：一是由于低水平耐藥性基因突變或者同義突變?cè)斐删昴退幮曰蛲蛔兒笠廊粚?duì)抗結(jié)核藥物敏感[30]；二是由于在藥敏試驗(yàn)過程中，操作人員操作失誤導(dǎo)致藥敏試驗(yàn)結(jié)果有偏差。

值得注意的是，在藥敏試驗(yàn)結(jié)果為對(duì)RFP和INH同時(shí)耐藥的37株MTB臨床分離株中，熒光PCR探針熔解曲線法檢測(cè)出34株耐藥，檢出率為91.89%(34/37)。藥敏試驗(yàn)結(jié)果為對(duì)5種抗結(jié)核藥物同時(shí)耐藥的8株臨床MTB分離株中，熒光PCR探針熔解曲線法檢測(cè)結(jié)果均為耐藥，說明熒光PCR探針熔解曲線法對(duì)多種藥物同時(shí)耐藥的MTB檢測(cè)效果較佳，在臨床上可以給醫(yī)生重要的耐藥性基因突變信息，輔助醫(yī)生對(duì)患者開展聯(lián)合用藥，從而達(dá)到最佳的治療效果。

本研究的結(jié)果與比例法藥敏試驗(yàn)結(jié)果有很強(qiáng)的一致性，說明熒光PCR探針熔解曲線法適用于MTB耐藥性基因突變的快速篩查。同時(shí)，本研究也存在一些不足，對(duì)于熒光PCR探針熔解曲線法與藥敏試驗(yàn)不一致的樣本，均采用熔解曲線法進(jìn)行了重復(fù)檢測(cè)并獲得一致結(jié)果，但是由于藥敏試驗(yàn)周期較長(zhǎng)，尚未進(jìn)行重復(fù)藥敏試驗(yàn)，且受條件限制的原因，目前也未進(jìn)行第三方測(cè)序驗(yàn)證。此外，本研究的檢測(cè)對(duì)象為培養(yǎng)菌株提取的核酸，對(duì)于臨床應(yīng)用中常見的痰標(biāo)本檢測(cè)尚未進(jìn)行研究。因此，筆者將在后續(xù)研究中將熒光PCR探針熔解曲線法用于痰標(biāo)本的MTB耐藥性基因突變的檢測(cè)研究中。